紫外分光光度法测定枸杞中多糖含量

紫外分光光度法测定枸杞中多糖含量
摘要:目的：提供一种测定枸杞制品中功效成分多糖的方法，同时合理筛选枸杞品种。

方法：运用苯酚-硫酸紫外分光光度法测定3种枸杞品种中多糖的含量。

结果：宁夏枸杞中的多糖含量为4.01%，新疆枸杞中的多糖含量为3.85%，青海枸杞中的多糖含量为4.01%；同时发现使用紫外分光光度法测定精密度好、重复性好、方法简便。

结论：宁夏枸杞中多糖含量明显高于新疆枸杞和青海枸杞，差异达到显著水平；紫外分光光度法是一种测定枸杞多糖质量分数的理想方法，亦可为其它类多糖质量分数的测定提供依据。

关键词：苯酚-硫酸；紫外分光光度法；枸杞；多糖
枸杞(Lycium Barbrum L.)属茄科枸杞，为落叶灌木植物干燥成熟果实。

近年的医学研究表明，枸杞含有多种营养成分和微量元素，其有效成分枸杞多糖(LBP)具有广泛的药理学作用，可促进造血、降血脂、保肝及治疗神经衰弱等。

枸杞多糖(LBP)是由多个单糖或衍生物聚合而成的大分子活性化合物，是枸杞生物学作用的主要有效成分之一，其结构按LBP-Ⅰ、LBP-Ⅱ、LBP-Ⅲ、LBP-Ⅳ的顺序水溶性依次递减，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。

枸杞多糖对机体具有非特异性免疫调解功能，可调节机体免疫力、抑制肿瘤生长和细胞突变、延缓衰老、提高适应能力，并具有抗疲劳和加速消除疲劳的作用，已成为保健食品中的一种重要功能性添加剂，显示出良好的应用前景。

为了进一步开发新疆黑枸杞的药用价值，本文采用紫外分光光度法测定了几种枸杞叶中的多糖含量。

1 材料与方法
1.1 原理
多糖在80%乙醇溶液中沉淀，与单糖和低聚糖及甙类物质分离。

沉淀用水溶解后，再用碱性二阶铜试剂选择性地从其它高分子物质中沉淀出具有葡聚糖结构的多糖。

苯酚-硫酸可与其中的多糖起显色反应，生成橙黄色化合物，可于485nm 处比色，定量。

1.2 材料与仪器
TU-1901型紫外-可见分光光度计(北京普析通用)、岛津CS-9301PC薄层扫描仪、定量毛细管(美国Dummond)、手动点样仪(CAMAGIII型)、硅胶G(青岛海洋化工集团公司)自制板；D-无水葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所生产，批号110833200302)；试剂：所用试剂均为分析纯。

3种枸杞子分别购于药店、药材集市等，经药品检验所侯惠婵主任药师鉴定，分别编号为枸杞1、枸杞2、枸杞3。

1.3 标准曲线的绘制
标准曲线的测定及线性范围：精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖250mg 置500ml量瓶中。

加水溶解并稀释至刻度，摇匀(每1ml中含葡萄糖0.5mg，此为对照品溶液)。

根据已确定的最大吸收度485nm，以浓度为横坐标，以吸收度为纵坐标绘制标准品曲线，并得出回归方程：A=11.775C+0.0611，r=0.9992。

结果表明，无水葡萄糖在0.02~0.1g·L-1范围内，其质量浓度与吸收度线性关系良好。

1.4 样品中枸杞多糖的测定
1.4.1 样品提取与纯化
称取150g枸杞子于60℃烘干，放置干燥器18h，粉碎，称取100g干燥枸杞粉，每次用氯仿/甲醇(2∶1)300mL，用索氏回流装置于60℃回流脱脂2次，每次2h。

残渣风干后，再用80%乙醇300mL，回流2次，每次2h。

残渣加适量水于90℃3次，每次1h。

离心10min，5000r/min，合并上清液，浓缩成200mL。

在磁力搅拌下，将浓缩液滴入5倍体积的95％乙醇中，静置12h。

抽滤，固形物分别用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，得LBP粗品。

1.4.2 样品中多糖的测定
称取干燥后所得的枸杞多糖粗粉50.0mg，置于50mL容量瓶中，加水溶解至刻度，精密吸取该溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL和5.0mL于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，各取1mL于10mL比色管中，分别加入5%苯酚溶液
1mL，摇匀，匀速加入5mL浓H2SO4，立即摇匀后置于冷水浴冷却至室温，
以蒸馏水同法作空白参比，两种方法的样品均选择在485nm处测定吸收度，计算多糖含量(以葡萄糖计)。

2 结果
2.1 样品含量
按下式计算样品中多糖的含量，结果见表1。

多糖(%)=(C×Df/m)×100%
C=供试溶液中葡萄糖含量(u/ml)；D=供试溶液的稀释倍数；f=换算因子；w=样品重量(mg)
2.2 精密度实验
分别精密吸取葡萄糖对照品溶液1mL并定容至25mL，取该样品溶液1mL 于10mL比色管中，依前法测定吸收度，测定A值，求得其RSD为1.14%(n=3)，精密度良好。

2.3 重现性实验
取同一批枸杞样品3份，分别依上述方法制备多糖溶液，测定多糖含量，RSD=0.47%(n=3),重复性好。

3 讨论
枸杞属植物枸杞为多棘刺落叶小灌木，抗旱能力很强，其浆果枸杞子在《神农本草经》中被引为上品，是我国传统名贵中药材，素有“红宝”美称。

其甘寒无毒，治五内不足，味甘、淡，具有清肝、润肺、滋肾明目、益气生精、祛虚痨、强筋骨、抗癌等功效，既含有碳水化合物、蛋白质、脂肪、胡萝卜素、核黄素、钙、磷、铁、锌，还含有多种维生素及玉蜀黍黄素，因而一直受到中外医学与食疗专家的高度重视。

枸杞多糖(LBP)是其一种重要活性成分，具有调节机体免疫力、抑制肿瘤生长和细胞突变、延缓衰老、抗脂肪肝和降血糖等药理作用。

新近的研究发现，枸杞多糖可明显改善脑缺血再灌注小鼠的行为障碍及卒中症状，显著提高脑缺血再灌注小鼠的学习、记忆能力，并能促进其学习、记忆能力的恢复。

枸杞多糖还可明显促进conA活化的脾淋巴细胞DNA蛋白质的生物合成，对白细胞介素-2的产生有明显的增强作用。

但我国大多数研究使用的都是枸杞多糖的粗品，对枸杞多糖的测定方法以及其组成成分和结构的分析研究报道甚少，因此，笔者在这些方面进行了较为详细的研究，此研究结果为枸杞多糖的深入研究奠定了坚实的基础。

苯酚-硫酸比色法测定枸杞多糖的原理是：枸杞多糖成分在浓H2SO4的
作用下会水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，再用分光光度法测定其含量。

本法操作简单、显色稳定、灵敏度高、重现性好，可作为枸杞及其它多糖含量的测定方法。

由于枸杞中含有单糖、低聚糖等杂质，且呈红色，因此在测定之前要先用乙醇除去单糖、低聚糖等杂质，并以丙酮-石油醚脱色，才能避免其对测定产生干扰。

同时，苯酚-硫酸分光光度计法在吸收
波长为485nm、苯酚-硫酸试剂加入量与多糖溶液的体积比为1∶2、水解显色10min、室温放置10min时，能较为准确地测定样品中多糖的质量分数，其平均精密率RSD=1.14%，重复性RSD=0.47%(n=3)。

该方法精密度好，准确可靠，方法简便，测试费用低，可用于各种多糖样品及相关食品类物质中多糖质量分数的测定。

本组资料显示，枸杞2—宁夏枸杞中多糖含量明显高于枸杞1—新疆枸杞和枸杞3—青海枸杞，差异达到显著水平。

同时试验中还发现，浓硫酸的加入方式对实验的结果影响较大，采取移液管悬空垂直加入浓硫酸并立即摇匀的方式，显色反应充分，且显色结果稳定。

总之，近来关于枸杞子的药理作用报道较多，尤以免疫调节、延缓衰老、抗肿瘤、保肝作用等为主，并已基本上明确了枸杞多糖为其中有效成分。

本文对3种枸杞子多糖含量进行了测定，并根据各地区均有使用多种枸杞子品种的习惯等情况作了综合分析，提示可对上述枸杞子与宁夏枸杞子作更多的比较研究，特别是新疆枸杞子，其价格仅次于宁夏枸杞子，可望作为法定枸杞子的新来源。

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