MTT试剂配制方法—悬浮细胞
检查原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT试剂还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测**毒性，则表示**毒性越小）。
MTT 溶液的配制方法——悬浮细胞
1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培育基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培育液稀释（储存液100mg/ml，需预试寻找佳稀释度，1:10-1:20）；③需检查物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul参入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。
每板设对照（加100ml 1640）。
2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3、每孔参入10 ul MTT试剂溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培育4 h。
（悬浮细胞推荐使用WST-1，培育4 h后可跳过步骤4，直接酶联**检查仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔参入100 ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联**检查仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
MTT试验标准操作步骤1. 原理活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功效。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中甲瓒，用酶标仪在570nm波优点测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成量和细胞数成正比。
依据测得吸光度值（即OD值），来判定活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（假如是测药品毒性，则表示药品毒性越小）。
2. 试剂及耗材CO2细胞培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、低速离心机、酶标仪、8道排枪、培养基胎牛血清、MTT、DMSO、96孔细胞培养板、胰酶、血细胞计数板3. 注意事项MTT溶液配制，通常MTT 配成终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
MTT通常最好现用现配，0.22μm过滤后4℃避光保留两周内，或配制成5mg/ml保留在-20℃长久保留，避免反复冻融，小剂量分装，用避光袋或锡箔纸包住避光以免分解，当MTT变为灰绿色时不能再用。
DMSO能够直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液过程中，可能会把结晶去掉，造成结果不稳定。
4. 试验步骤：4.1 细胞标准曲线制作4.1.1 0.5%胰酶消化对数期细胞，待细胞立即脱离皿底时，加少许血清终止反应，1000r/min，离心5min，吸去上清，将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至5-10×104/ml。
4.1.2 取4块96孔板，分别标识为0h、24h、48h、72h，，每组设置3个复孔，每孔加入100 μL细胞悬液，每板分别铺8组细胞，分别为3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个/孔，边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应。
4.1.3 5%CO2，37℃培养箱继续培养，每24 h取出一块96孔板检测：a) 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4-6h；b) 小心吸去孔内培养液；c) 每孔加入150μL DMSO，使结晶物充足溶解；d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长μl570nm吸光值；4.1.4 标准曲线制作以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞增殖标准曲线。
细胞的增殖检测（MTT法）MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济，但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
一、检测原理MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（商品名：噻唑蓝），是一种黄颜色的染料。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值（也有用570nm波长)，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
二、试剂材料准备与实验仪器1、对数生长期细胞2、受试因素（药物）3、5mg.mL-1MTT溶液：称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中（60℃水浴助溶），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可，在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
（PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调pH 7.4 ，定容1L）4、DMSO（二甲基亚砜）5、96孔板6、酶联免疫检测仪7、细胞培养箱三、MTT法实验步骤（一）普通MTT法实验步骤1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
