仙草抗乙型肝炎病毒的体外实验研究_王妍
- 格式：pdf
- 大小：1.41 MB
- 文档页数：3
第11卷 第8期 2009 年 8 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 11 No. 8Aug . ，2009仙草(hsian-tsao,Mesona procumbens Hemsl)又名凉粉草、仙人草、仙人冻、薪草,为唇形科一年生草本植物。
分布于广东、广西、江西、福建、浙江、台湾和云南等地,印度、印度尼西亚和马来西亚等地也有分布。
因其具有清热、解毒、消暑、保肝的功效,民间常用作制备龟苓膏和天然凉茶的主要原料,是我国传统的药食两用植物。
现代研究表明仙草有抗缺氧[1]、抗氧化[2]、降糖[3]等药理作用。
为进一步观察仙草对乙肝病毒的影响，本文用HepG2.2.15细胞株为模型，观察仙草体外抗HBV活性，并对其作用机理初步探讨。
1 实验材料仙草购于广东清平中药材专业市场，经鉴定为唇形科植物仙草(hsian-tsao,Mesona procumbens Hemsl)的地上部分，干扰素α1b(赛若金)由深圳科兴生物工程股份有限公司提供， 10万IU/支。
HepG2. 2. 15细胞由南方医科大学病毒性肝炎实验室提供；噻唑蓝(MTT),二甲基亚砜(DMSO)和G418(Sigma公司)；HBsAg和HBeAg的ELESA检测试剂盒(华美生物公司)；Model 1680酶联免疫检测仪(德国Bio-Rad公司)；HBV DNA提取及扩增荧光检测试剂盒(广州中山大学达安基因股份有限公司)； DMEM高糖培养液(含20%胎牛血清、0. 03% L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素、380μg/mLG418)、胰蛋白酶、EDTA、L-谷氨酰胺、胎牛血清(Gibco公司)； PE7700型自动荧光PCR检测仪(美国Perkin El-mer公司)。
2 实验方法2.1仙草供试液的制备 取仙草加水煎煮2次，每次2h，合并提取液，水浴浓缩为1g/mL（每mL药液相当于1g药材），经1500 r/min离心10 min，上清液再用定性过滤液纸粗滤，调节pH值为7. 09，再经0. 22μm微孔滤膜过滤除菌，置于4℃存放备用。
2.2细胞培养 将HepG 2. 2. 15细胞接种于DMEM 混合培养液，置于37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养。
换液1次/3 d，6~10 d传代。
每次换液留取上清，检测HBV-DNA分泌情况，表达稳定后开始实验。
2.3药物对HepG 2. 2. 15细胞的毒性实验 根据Sargent JM等[4]建立的MTT比色分析法，判定各孔中存活细胞增殖代谢情况及细胞毒性反应。
将仙草提取液用DMEM混合培养液分别稀释成1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.82、3.91，1.96mg/ mL和1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.82、3.91、1.96μg/mL等20个实验浓度，培养细胞用胰蛋白酶消化，配制成浓度为10×104/ml的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔0.1mL，37℃、饱和湿度、5%CO2培养，于48h后换入不同浓度含药DMEM混仙草抗乙型肝炎病毒的体外实验研究王 妍，俞 发（中国人民解放军第四五八医院药剂科，广东 广州 510602）摘 要：目的：观察仙草体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。
方法：以HepG2. 2. 15细胞株为模型，用微粒酶免疫测定技术(MEIA)检测细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg含量，用PCR荧光定量技术检测细胞上培养上清液中HBV DNA的变化，以MTT比色法观察药物的细胞毒性。
结果：仙草对HepG 2. 2. 15细胞的TC50为37.45 mg/mL，对抑制HepG2. 2. 15细胞分泌HBsAg和HBeAg的治疗指数分别为14.71和39.42。
对HBV-DNA仅有微弱抑制作用。
结论：仙草在体外细胞培养中具有直接抗HBV活性。
关键词：仙草；HepG2. 2. 15细胞；乙型肝炎病毒中图分类号：G42文献标识码：A文章编号：1673-842X (2009)08- 0219- 03Inhibitory Effects of Xiancao(hsian-tsao Mesona procumbensHemsl)Against Hepatitis B Virus in VitroWANG Yan, YU Fa（Department of Pharmacy, 458 Hospital of PLA, Guangzhou 510602, Guangdong, China）Abstract：Objective: To evaluate the inhibitory effects of Xiancao(hsian-tsao,Mesona procumbensHemsl) against hepatitis B virus (HBV)in vitro. Methods: HepG2.2.15 cells, as model cells, were exposed to different concentrations of extracts of Xiancao(hsian-tsao,Mesona procumbensHemsl) and IFα1b, respectively. MEIA was used to assess HBsAg and HBeAg; fluorescent quantitative PCR was applied to quantify extracellular HBV-DNA, MTT chromatogramphy was applied to observe toxicity . Results: the TC50 of Xiancao(hsian-tsao,Mesona procumbensHemsl) is 37.45 mg/mL, TI against HBsAg, HBeAg are 14.71，39.42 respectively, and also Xiancao inhibits HBV replicationin vitro in to some extent. Conclusion: Xiancao have the anti-HBV activity in vitro.Key words：Xiancao(hsian-tsao,Mesona procumbensHemsl); HepG2.2.15 cell; hepatitis B virus收稿日期：2009-03-11作者简介：王妍（1976-），女，辽宁沈阳人，主管药师，硕士，研究方向：神经药理学。
219220辽宁中医药大学学报 11卷合培养液，同时设无药物细胞对照组，每浓度4孔，每4天换新鲜含药培养液，共2次。
第8天每孔加入MTT 溶液(1mg/mL)200μL，继续在37℃下孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清，然后每孔加入150μL DMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解，置入酶联检测仪中以570nm 波长测定各孔光吸收值(OD 值)，重复3次，依照Reed-Muench 法[5]计算药物对Hep G 2.2.15细胞的抑制百分率(%)=(细胞对照组平均A 组-实验组平均A 值)/细胞对照组平均A 值×100%；细胞半数有毒浓度(TC50)=Anti lg[lgB+(50-B)的抑制百分率/(A-B)的抑制百分率)×C]×100%，治疗指数(TI)=半数有毒浓度(TC50)/半数有效浓度(IC50)。
TI>2为有效低毒，1<TI>2为低效低毒，TI<2为毒性作用。
（A=lg>50%药物浓度，B=lg<50%药物浓度，C=lg 稀释倍数）。
2.4 药物应用 培养细胞用胰岛蛋白酶化，配制成浓度为10×104/mL 的细胞悬液接种于24孔培养孔，每孔1mL，37℃、饱和湿度、5%CO 2培养，根据药物毒性度验结果，于48h 后换入6种不同浓度(31.25、15.63、7.82、3.91、1.96、0.98mg/mL)的细胞全培养液，阳性对照药物为干扰素α1b(赛若金100、200、400IU)，同时设不含药物的细胞对照组。
每4天换新鲜含药培养液，共2次，于第4、8天留取培养液作为检测标本-20℃保存，同批次试剂同一时间检测。
2.5 上清液中HBsAg HBeAg 的检测 采用微粒酶免疫(MEIA)测定技术检测，结果以S/CO 值表示。
抑制率=(细胞对照组S/CO 值-药物组S/CO 值)/细胞对照组/S/CO 值×100%。
2.6 上清液中HBV-DNA 的提取及定量检测 采用PCR 荧光定量技术检测上清液中HBV DNA 定量。
每个浓度重复测定3次，取平均值。
HBV DNA 抑制百分率(%)=(细胞对照组平均A 值-实验组平均A 值)/细胞对照组平均A 值×100%。
2.7 统计学分析 结果用x —±s 表示，组间比较用方差分析，采用SPSS10.0完成。
3 结 果3.1 仙草的细胞毒性 实验结果显示，不同浓度的仙草对HepG22.2.15细胞均有不同程度的毒性作用，随着药物浓度增高，毒性作用逐渐增强，见表1，表1是药物作用8天后对HepG2.2.15细胞的生长抑制情况。
仙草对HepG2.2.15细胞的TC50为37.45mg/mL。
表1 仙草作用8天后对HepG2.2.15细胞的生长抑制率仙草浓度生长抑制率（%）3.89μg4.315.56μg 8.262.25μg 15.5250μg 26.91000μg 38.13.8941.315.5662.062.2578.625082.5100085.73.2 仙草对HBsAg HBeAg 的抑制效果 根据药物的细胞毒性实验结果初定确定了用药浓度范围。
见表2、表3，仙草对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg、HbeAg 均有抑制作用，随着药物作用时间的延长，抑制率也逐渐增高。
在同一浓度下，都表现为对HBeAg 的抑制率高于对HBsAg 的抑制率。
仙草浓度在0.98mg/mL 时作用4天对HBsAg、HBeAg 的抑制率分别达到29.31%，52.37%(P <0.01)，作用8天对HBsAg、HBeAg 的抑制率分别达到48.73%，76.54%(P <0.01)，其IC50分别为3.78，1.08mg/mL，对抑制2.2.15细胞分泌HBsAg 和HBeAg 的治疗指数分别为14.71和39.42。
