第38卷第5期 唐山师范学院学报 2016年9月 Vol.38 No.5 Journal of Tangshan Normal University Sep. 2016──────────基金项目：安徽省重点实验室绩效项目（1606c08226），院校中青年科研基金项目（WK201601），安徽省大生创新创业训练计划项目（201510368123）收稿日期：2016-06-30 作者简介：李萍（1984-），女，江苏兴化人，硕士，实验师，研究方向为天然药物药理学。
-75-云南白药体外抗氧化活性作用李 萍1,2，秦国正1,2，何宝佳1，卜晓阳1，李贵州1（1. 皖南医学院 药学院，安徽 芜湖 241002；2. 活性生物大分子研究安徽省重点实验室，安徽 芜湖 241002）摘 要：以VC 为对照，测定云南白药对DPPH 自由基、羟基自由基的清除力，以及还原能力测定，研究云南白药的体外抗氧化活性。
结果表明，云南白药具有抗氧化活性，可以有效清除DPPH 自由基、羟基自由基、并具有还原能力。
关键词：云南白药；抗氧化；自由基 中图分类号：Q5-33文献标识码：A 文章编号：1009-9115(2016)05-0075-03DOI ：10.3969/j.issn.1009-9115.2016.05.023In Vitro Antioxidant Activity of Yunnan BaiyaoLI Ping 1,2, QIN Guo-zheng 1,2, HE Bao-jia 1, BU Xiao-yang 1, LI Gui-zhou 1(1. School of Pharmacy, W annan Medical College, Wuhu 241000, China; 2. Anhui Province Key Laboratory of Biological Macro-MoleculesResearch, Wuhu 241000, China)Abstract: With VC as control, by determinating Yunnanbaiyao on DPPH free radical scavenging, hydrogen peroxide scavenging, as well as the reducing power, the study in vitro antioxidant activity of Yunnan Baiyao was made. The results show that Yunnan Baiyao exhibits antioxidant activity, effectively antioxidant activity, DPPH radical, hydrogen peroxide scavenging and reducing power.Key Words: Yunnanbaiyao; antioxidant; free radical云南白药是我国著名的中成药，由三七、冰片、重楼、麝香等名贵重药材制成，具体配方至今为不传之密。
近年来研究发现云南白药除治疗跌打损伤和治疗各种出血及溃疡有奇效外，还具有保护缺血心肌[1]、促进人牙髓干细胞分化[2]和骨骼肌急性损伤后卫星细胞的再生[3]、抗肿瘤[4]的作用，对糖尿病引起的牙周炎[5]及骨质疏松的治疗[6]也有良好的效果。
Liu 等[7-8]用高效液相色谱及质谱对其中的某些成分进行了定量，但云南白药成分复杂，目前对其作用机制尚不明确。
本试验采用DPPH 法、结晶紫法、铁氰化钾法对其体外抗氧化活性和还原能力进行测定，考察云南白药的体外抗氧化作用，探讨其可能的作用机制，为进一步研究该药物的用途，提供实验依据和理论支持。
1 材料与方法1.1 材料与试剂云南白药粉（云南白药集团股份有限公司）；DPPH（Sigma ）、Tris-HCl （Amresco ）；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、铁氰化钾、结晶紫、三氯乙酸均为国药分析纯。
1.2 仪器与设备AL104分析天平（梅特勒）；UV2550紫外可见记录分光光度计（岛津）；TDL-5-A 台式离心机（上海飞鸽）；HH-6数显电子恒温水浴锅（江苏金坛宏华仪器厂）。
1.3 DPPH 法测定云南白药体外抗氧化活性将云南白药粉和VC 分别用蒸馏水配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL -1的溶液，DPPH 用无水乙醇配制成2×10-4 mol·L -1的溶液。
以无水乙醇作为参比，取2 mL 不同浓度的云南白药溶液及2 mL 的DPPH 溶液加入具塞试管中，摇匀后室温放置30 min ，测定517 nm 处的吸光度A i 。
同时无水乙醇作参比测定2 mL 不同浓度的云南白药与2 mL 无水乙醇混合液在517 nm 的吸光度第38卷第5期 唐山师范学院学报 2016年9月-76-A j ，再用无水乙醇作参比测定2 mL DPPH 与2 mL 蒸馏水混合液在517 nm 的吸光度Ac [9-10]。
根据公式计算不同浓度受试物的清除率：清除率(%)=[1-(A i -A j )/A c ]×100%1.4 清除羟基自由基能力的测定将云南白药粉和VC 分别用蒸馏水配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL -1的溶液，配制2×10-5 mol·L -1结晶紫溶液，5×10-3 mol·L -1 FeSO 4溶液，1% H 2O 2溶液，pH5.5的Tris-HCL 溶液。
参照张明[9]的实验方法，以维生素C 为对照分别测定A s 、A b 、A o ，计算样品对羟基自由基的清除率：清除率(%)=[(A s -A b )/(A o -A b )]×100%1.5 云南白药还原能力测定将云南白药粉和VC 分别用蒸馏水配制成1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg·mL -1的溶液，再配制质量分数1%的铁氰化钾，pH6.6的0.02 mol·L -1磷酸盐缓冲液，10%的TCA 以及2.0 mg·mL -1的FeCL 3。
参照文献[12]，在试管中依次加入磷酸盐缓冲液2.5 mL ，铁氰化钾2.5 mL ，混匀置于50 ℃水浴20 min 。
取出加入2.5 mL 浓度为TCA ，混匀后置于3 000 g 离心10 min ，取出离心后的上清液2.5 mL ，然后加无水乙醇2.5 mL ，FeCl 3 0.5 mL 混匀。
于700 nm 处测吸光度值。
空白管中加等量的蒸馏水，以VC 为对照，测定云南白药的还原能力2 结果与分析2.1 云南白药对DPPH 自由基的清除能力的试验结果云南白药清除DPPH 自由基能力测定结果如图1所示，云南白药对DPPH 自由基有显著的清除能力，随着浓度的加大清除能力增强，当浓度达到1 mg·mL -1时，云南白药对DPPH 自由基的清除率达到45.35%，但是弱于同浓度下的维生素C 。
图1 云南白药对DPPH 自由基清除率2.2 云南白药对羟基自由基的清除能力的试验结果由图2所示可以看出，云南白药对羟自由基的清除能力较好，随着云南白药浓度的增加清除率在不断增大，并且在浓度达到0.8 mg·mL -1后清除率大幅度增加，1 mg·mL -1时清除率达到55.37%，在该0.2-0.8的浓度范围内维生素C 的清除率与云南白药差别不大，浓度达到1 mg·mL -1时维生素C 的清除率弱于云南白药，可见云南白药有着较强的羟自由基清除力。
图2 云南白药对·OH 的清除率2.3 云南白药还原力测定的试验结果因为还原力大小可通过反应生成的普鲁士蓝成正比，而普鲁士蓝的量则可通过吸光度检测。
由表1可见云南白药有一定的还原能力，但很弱，随着浓度增大还原能力略有增加，云南白药浓度为2.0 mg·mL -1时吸光度也只有0.143，而同浓度下的维生素C 吸光度达到2.405。
由此可见云南白药还原能力远弱于维生素C 。
表1 云南白药的还原力测定质量浓度（mg·mL -1）云南白药（A700）维生素C （A700）1.2 0.105 1.857 1.4 0.1192.026 1.6 0.124 2.105 1.8 0.131 2.246 2.0 0.143 2.405对云南白药的抗氧化活性研究表明，云南白药具有抗氧化活性，可以有效清除DPPH 自由基、羟基自由基、具有一定的还原能力，其抗氧化能力随着浓度的增加逐渐增强。
体外测定抗氧化活性的方法，除本文提到的这三种外还有邻苯三酚自氧化法[13]、超氧阴离子自由基清除率[14]、硝酸盐清除率[15]等方式方法。
本试验选择了DPPH 清除率，羟自由基清除率及还原能力这三种具有代表性的方法来考察样品的综合抗氧化活性。
不同浓度的云南白药表现出了不同的抗氧化活性效果，云南白药作为一种复方制剂，成分复杂，起抗氧活性的成分尚不明确，可进行不同溶剂提取后进一步实验。
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