PCR几点看法
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P CR里面一般第一步都有个预变性,其目的为：
破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。
此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR 反应得以顺利进行。
PCR延伸
用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：
1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。
（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。
酶说明书上有延伸速率)
2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。
通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。
3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。
引物的复性温度就是变性温度后一段温度较低的时期，在该阶段，引物单链和变性期已经解链的模板单链结合，这就是引物退火过程，该过程需要的温度就是复性温度。
该温度十分重要，可决定PCR的特异性以及扩增效率
在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个退火温度)的时候，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，这就使PCR后期的过程成为可能。
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
另一种说法：熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
Tm值除了用软件之外，还可以这个公式：2（A+T）+4（C+G），然后减5—10度
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃
或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
另外，由于PCR仪的不同，注意其退火温度的设定：一般的PCR仪允许设置跨度12-15度的梯度范围，所以你的梯度范围尽可能设置宽一点，争取一轮梯度就可以确定最佳可用退火
温度。
具体从多少度到多少度，要看你这对引物的Tm值，如果两个引物Tm值不高，可以设置48-60的梯度；否则可以设置58-70度的梯度；如果两个引物的Tm中等，则可以设置53-65的梯度范围，具体情况灵活掌握。
传统梯度PCR仪中是可以放置12个样品进行梯度的，需要注意的是每个相邻两孔间的温度差异是不等的，尤其是第2、3孔与第1孔接近，第10、11孔与第12孔接近。
可以舍弃第2、2、10、11孔，只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8个样品，孔间温度变化几乎呈真正的梯度状。
Ta q DNA聚合酶 PCR反应中,50ul该酶的用量,通常是2.5单位。
加酶量过多将导致非特异性片段的扩增。
变性剂 反应中加入适量变性剂(如二甲亚砜、尿素、甲酰胺等)可减少模板的二级结构,提高反应的特异性。
我们在用PCR扩增猪瘟病毒cDNA片段的反应中,加入5%甲酰胺,不但提高了反应的特异性,而且目的cDNA片段的产量大大提高。
8、循环参数 用3种不同温度处理样品,使之变性,退火和延伸,就可进行PCR循环。
PCR操作可于三个不同温度的水浴锅内手动完成,或者于PCR循环仪上自动完成。
变性是循环的第一步,变性不完全,扩增明显受到影响,变性温度太高或时间太长, Taq DNA酶的寿命受到影响,使得循环次数明显减少。
绝大多数PCR变性温度在92～94℃之间,时间通常控制在40秒左右;退火是循环的第二步,退火温度的选择决定着引物与模板互补结合的效率和特异性,是PCR 能否成功的关键因素。
选择适当的退火温度,取决于引物的长度、G+C含量、模板的纯度和丰度。
较高的退火温度可提高引物与模板配对的特异性,从而提高反应的特异性。
就含量和纯度较高的模板而论,对于G+C含量在50%左右的约20nt长的引物,55℃是常用的退火温度。
如果引物
较短(12～15nt)退火温度可降至40～45℃。
对于丰度（1.在给定生物组织细胞中，某特异大分子的相对含量。
2）mRNA丰度：指细胞中mRNA分子的数量。
3）高丰度mRNA：有少量不同mRNA分子组成，在细胞中存在大量拷贝。
）
极低的模板的PCR,特别是稀有RNA模板的反转录PCR(RT PCR),在最初的1～5个循环可以用更低的退火温度,然后再行正常的退火温度,这样能明显提高PCR的成功率。
