原发性先天性青光眼CYP1B1基因新变异

生堡堕珏盘蠢２璺塑生！Ｑ旦箍堑鲞筮！Ｑ翅垦坠翌』必查！丝：Ｑ堕尘塑！Ｑ堕：！些堑，壁垒！Ｑ原发性先天性青光眼Ｃ删ＢＪ基因新变异黄菊芳周瑾王慧陈旦曾乐平童建斌夏晓波胡正茂【摘要】目的探讨ＣＹＰＩＢＩ基因变异在湖南地区原发性先天性青光眼患者中的分布。

方法病例对照研究。

收集来自湖南地区的１３例原发性先天性青光眼患者的临床资料进行分析，对１３例患者的ＣＹＰＩＢＩ基因编码外显子进行直接测序和聚合酶链反应－限制性内切酶技术检测。

结果１３例原发性先天性青光眼患者中，有１例发现一种基因新突变（Ｃ．Ｃ３１９Ｇ，ＬＩＯＴＶ），是位于外显子２的错义突变。

１００例正常人中未见Ｌ１０７Ｖ突变。

同时发现已报道的４种单核苷酸多态位点，分别为Ｒ４８Ｇ、ＡＩ１９Ｓ、Ｖ４３２Ｌ、Ｄ４４９Ｄ。

结论ＣＹＰＩＢＩ基因Ｌ１０７Ｖ突变可能是导致湖南地区原发性先天性青光眼患者的致病原因之一。

ｆ乒华腥群杂岙，２００９，４５：ｓ７５－ｓ７ｓ）【关键词】青光眼；芳基烃羟化酶类；突变ＡｎｏｖｅｌｍｕｔａｔｉｏｎｏｆＣＹＰＩＢｌｇｅｎｅｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｇｌａｕｃｏｍＨＵＡＮＧ几扣昭’，ＺＨＯＵ肺，ＷＡＮＧＨｕｉ，ＣＨＥＮＤａｎ，ＺＥＮＧｌ＿ｅ－ｐｉｎｇ，ＴＯＮＧＪｉａｎ—ｂｉｎ，ＸＩＡＸｉａｏ—ｂｏ，ＨＵＺｈｅｎｇ—ｍａｏ．’ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎａｔｏｍｙａｎｄＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＸｉａｎｇｙａＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１００７８，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＨＵＡＮＧＪｕ扣ｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｊｕｆａｎｇｈｕａｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣＹＰｌＢＩ（ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０，ｆａｍｉｌｙ１，ｓｕｂｆａｍｉｌｙＢ，ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ１）ｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｐｒｉｍａｒｙｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｇｌａｕｃｏｍａ（ＰＣＧ）ｉｎＨｕｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ．ＭｅｔｈｏｄｓＣａｓｅ－ｃｏｎｔｒｏｌｓｔｕｄｙ．ＴｈｉｒｔｅｅｎｏｆＰＣＧｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉｓｔｒｉｃｔｓｏｆＨｕｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅｗｅｌ＇ｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．ＤｉｒｅｃｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＷａＳｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｃｅｄｉｎｇａｎｄｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅ＠ｏｎｓｏｆｔｈｅＣＹＰＩＢｌｇｅｎｅｉｎＰＣＧｐａｆｉｅｎｔｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＡｎｏｖｅｌｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｕｔａｔｉｏｎ（Ｃ．Ｃ３１９Ｇ，Ｌ１０７Ｖ）ｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎＰＣＧｐａｔｉｅｎｔｉｎｓｔｕｄｙａｎｄｉｔｗａｓｍｉｓｓｅｎｓｅｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｅ嘿叩２．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ．ｆｏｕｒｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｆｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＳＮＰｓ）ｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎＰＣＧｐａｔｉｅｎｔｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＲ４８Ｇ，Ａｌ１９Ｓ，Ｖ４３２ＬａｎｄＤ４４９Ｄ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＡｎｏｖｅｌＣＹＰＩＢＩｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎ（Ｌ１０７Ｖ）ｍａｙｂｅｔｈｅｆｏｒｐｒｉｍａｒｙｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｇｌａｕｃｏｍａｉｎＨｕｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ．（Ｃｈ洒ＪＯｐｈｔｈＭｍ０１．２００９。

４５：８７５－８７８）【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｇｌａｕｃｏｍａ；ＡｒｙＩｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ；Ｍｕｔａｔｉｏｎ原发性先天性青光眼（ｐｒｉｍａｒｙｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｄａｕｃｏｍａ，ＰＣＧ）是一种遗传性致盲眼病，通常在出生时就已发生，临床表现为畏光、流泪、眼睑痉挛、眼压升高、角膜增大、角膜水肿，如果不予以治疗，最终导致无法逆转的失明。

防治ＰＣＧ关键在于通过揭示疾病的致病基因，进行基因筛查，减少患儿的出生。

目前，已确定的ＰＣＧ致病基因是位于染色体２ｐ２１区的人类细胞色素Ｐ４５０基因（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０，ｆａｍｉｌｙ１，ｓｕｂｆａｍｉｌｙＢ，ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ１，ＣＹＰｌＢｌ）…。

我们于２００７年对１３例ＰＣＧ患者进ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０４１２－４０８１．２００９．１０．００４基金项目：教育部新世纪优秀人才支持计划（ＮＣＥＴ－０５－０６８４）作者单位：４１００７８长沙，中南大学湘雅医学院人体解剖学与神经生物学系（黄菊芳、周瑾、王慧、陈旦、曾乐平、童建斌）；中南大学湘雅医院眼科（夏晓波）；中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室（胡正茂）通信作者：黄菊芳，Ｅｍａｉｌ：ｊ吐ｍｇｈｕ８ｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．∞．论著．行ＣＹＰｌＢｌ基因变异分析，旨在探讨ＣＹＰｌＢｌ基因变异在ＰＣＧ发病中的作用。

对象和方法一、受试对象收集２００７年中南大学湘雅医院眼科门诊及住院ＰＣＧ患者１３例，所有对象均接受两位眼科医师的共同检查并确诊。

其中男性１２例，女性１例；发病年龄出生６０ｄ至１３岁，平均７．８岁。

除１例外，患者均双眼发病。

有家族史者２例。

１．ＰＣＧ患者诊断标准旧Ｊ：（１）不明原因的泪溢、畏光及眼睑痉挛；（２）眼压升高＞２１ｍｍＨｇ（１ｍｍＨｇ＝０．１３３ｋＰａ）；（３）角膜直径增大，角膜水肿，角膜后弹力层破裂；（４）眼底的盘／杯比值增大；（５）排除合并全身及眼部其他先天性或继发性异常。

２．正常对照者：共１００例，排除先天性眼部发生堡堕型盘查；Ｑ塑生！Ｑ旦筮箜鲞筮！！塑￡！也』Ｑ吐！趔翌！！：Ｑ鲢！！Ｑ塑：：箜：盟！：！Ｑ育异常和ＰＣＧ家族史，标本来自中南大学医学遗传学国家重点实验室。

经所有研究对象同意后，分别收集１３例ＰｅＧ患者和１００例正常对照者的外周静脉血４～８ＩＩｌｌ，置入乙二胺四乙酸抗凝管，以备进行ＤＮＡ抽提。

二、研究方法１．ＤＮＡ提取：采集ＰＣＧ患者和正常对照者外周静脉血４～８１１１ｌ，常规酚和氯仿抽提全基因组ＤＮＡ［３１。

２．引物设计：针对人Ｃ即，Ｂ，基因的第２对和第３对外显子（第ｌ对外显子不表达）序列，设计５对引物用于聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）扩增和测序（表１）。

表１人ＣＹＰＩＢｌ基因突变检测引物外显子‘引物序列（５’ｑ’）大茉盛）注：‘示由于第ｌ对外显子不表达，故采用第２对和第３对外显子３．ＰｅＲ扩增：ＣＹＰｌＢｌ基因具有编码功能的两段外显子序列，使用由加拿大生物研究所提供的ｐｒｉｍｅｒ３在线软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ—ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕｆｃｇｉ—ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ／）设计了５对引物覆盖ＣＹＰｌＢＩ基因２个外显子，扩增产物分别为４８１、４８７、４９０、４００、４９８ｂｐ，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

ＰＣＲ在１０恤ｌ反应体系中进行，其中包括１０倍ＰｅＲ缓冲液１斗ｌ，５倍缓冲液２山，ＭｇＣｌ：（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）０．６斗ｌ，三磷酸脱氧核糖核苷酸（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．１５山，正反向引物（０．１ｇ／Ｌ）各０．５山，Ｈｏｔ８ｔａｌ＇ｔ酶（５×１０６Ｕ／Ｌ）０．０５山（上海生工生物工程技术服务有限公司），基因组ＤＮＡ（０．０５ｇ／Ｌ）１．０一，去离子水４．２一。

先预变性９５℃、１５ｍｉｎ后，再进行ｌＯ个循环，每个循环包括变性９４℃、３０ｓ，退火５７—６２℃、３５ｓ，延伸７２℃、４５ｓ，再进行２５个循环，每个循环包括变性９４℃、３０ｓ，退火５５℃、３５ｓ，延伸７２℃、４５ｓ，最后延伸７２℃、１０ｍｉｎ，４ｏＣ保存。

反应结束后，以２％的琼脂糖凝胶电泳确定扩增产物。

４．酶切测序：检测完后，对扩增特异性好的ＰＣＲ产物用虾碱性磷酸酶和核酸外切酶（上海生工生物工程技术服务有限公司）处理，其试剂组成：１０倍虾碱性磷酸酶缓冲液０．５０山，虾碱性磷酸酶（１×１０６Ｕ／Ｌ）２．００斗ｌ，核酸外切酶Ｉ（２×１０７Ｕ／Ｌ）０．２５斗ｌ，ＰＣＲ产物７．２５斗ｌ。

３７℃酶切４０ｍｉｎ，８０℃、１５ｍｉｎ灭活虾碱性磷酸酶和核酸外切酶，处理完后的产物用３１００一基因分析仪（美国ＰｅｋｉｎＥｌｍｅｒ公司，ＡＢＩ３１００测序仪）测序。

５．测序分析：扩增产物在中南大学湘雅医院医学遗传学国家重点实验室进行正反双向测序。

测序结果与正常野生型ＣＹＰｌＢＩ基因序列ＢＬＡＳＴ比较（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）（ＧｅｎＢａｎｋ号：ＮＭ＿０００１ＩＭ），评估其突变位置与意义。

６．ＰＣＲ．限制性内切酶技术：采用ＰＣＲ－限制性内切酶技术检测Ｌ１０７Ｖ突变，扩增引物：５’一ＡＴＣＣＧＣＣＴＩＸⅪＣＡＧＧＣＧ一３’：５７一ＣＴＧＧＣＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＦ．３’。

限制性内切酶为Ｓａｕ９６Ｉ。

正常人带有一个Ｓａｕ９６Ｉ酶切位点，Ｌ１０７Ｖ突变失去该酶切位点。

结果一、ＣＹＰｌＢＩ基因变异检测结果１３例ＰＣＧ患者中仅发现１例存在ＣＹＰｌＢｌ基因突变（ｅ．Ｃ３１９Ｇ），密码子由ＣＴＧ变为ＧＴＧ，导致１０７位氨基酸由亮氨酸变为缬氨酸（Ｌ１０７Ｖ），患者是一个纯合子改变（图１）。

１００例对照组样本均未见ＣＹＰＩＢｌ基因突变。

由于基因检测的双向测序结果一致，图１中仅给出了正向测序结果。

由图１可见在ＣＹＰｌＢｌｅＤＮＡ的３１９位碱基发生一个错义突图ｌ先天性青光眼患者ＣＹＰＩＢＩ基因变异正向测序结果（ｅ．Ｃ３１９Ｇ，Ｌ１０７Ｖ），显示ＣＹＰＩＢＩｅＤＮＡ的３１９位碱摹发生错义突变（箭头），即ｃ变为ｃ，导致其ｍＲＮＡ的１０７位编码亮氨酸的密码子ＣＴＧ变为编码缬氨酸的密码子ＧＴＧ生堡腿整盘查！Ｑ堕生！Ｑ旦筮笪鲞筮！Ｑ翅￡！也』Ｑ也丛！坐趔：塑尘型２Ｑ塑，坠！笪，盟垒！Ｑ变，即ＣＹＰｌＢｌ碱基的３１９位Ｃ变为Ｇ，导致其ｍＲＮＡ的１０７位编码亮氨酸的密码子ＣＴＧ变为编码缬氨酸的密码子ＧＴＧ，经ＮＣＢＩ数据库的单核苷酸多态（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）Ｂｌａｓｔ分析，提示其并非是一个单核苷酸多态（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）ｏ二、Ｌ１０７Ｖ的ＰＣＧ患者临床特征患者男性，９岁，无青光眼家族史，因家长发现其双眼球发白４年而到本院就诊。

人院确诊为ＰＣＧ后，分别行双眼抗青光眼手术治疗。

经复查发现患者左眼眼压控制不理想，次年行第２次抗青光眼手术，术后间断使用一种降眼压滴眼液。

治疗后视力：右眼０．２，左眼眼前２０ｃｍ手动；右眼角膜透明，前房中央轴深４个角膜厚度，瞳孔直径约１．５ｍｍ，虹膜部分后粘连，光反应迟钝，眼底盘／杯比值０．８，眼压１８ｍｉｌｌＨｇ；左眼角膜全层混浊，余结构窥视不清，眼压２３ｍｍＨｇ；右眼角膜横径１５．５ｍｍ，竖径１６．０１３ｆｌｉｒｔ；左眼角膜横径１８．０ｎｌｌｌｌ，竖径１７．０ｍｍ。