甘蓝型油菜矮杆基因Bnrgads的克隆和功能分析

张　蕾，阮羽萱，潘　娇，等．甘蓝型油菜响应干旱胁迫的转录组分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（５）：５１－５５．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．０５．００７甘蓝型油菜响应干旱胁迫的转录组分析张　蕾，阮羽萱，潘　娇，陈　敏，刘博宇，阮　颖，黄　勇（湖南农业大学生物科学技术学院／湖南省作物表观遗传与发育重点实验室，湖南长沙４１０１２８） 摘要：甘蓝型油菜（ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）是我国主要油料作物之一，为国家粮油安全提供了重要保障。

干旱严重限制了油菜种植规模扩大、产量与品质提升。

为挖掘甘蓝型油菜抗旱的关键基因，阐明油菜耐旱机制，本研究以甘蓝型油菜湘油１５为对象，通过实验室模拟干旱处理后的叶片为材料进行转录组测序（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）、生物信息分析并ｑＲＴ－ＰＣＲ验证。

发现转录组样本平均Ｃｌｅａｎｂａｓｅａｓ约为９．６Ｇ，且各样品碱基百分比（Ｑ３０）大于９３．２１％，比对到参考基因组上的Ｒｅａｄｓ在８９％以上。

干旱处理４ｈ后，湘油１５出现了４４０个差异表达基因（ＤＥＧｓ），其中１４８个基因上调，２９２个基因下调。

随机选取１０个基因（上调与下调各５个）进行ｑＲＴ－ＰＣＲ验证，其中９个基因的ｑＲＴ－ＰＣＲ结果与ＲＮＡ－Ｓｅｑ结果相符，仅１个基因表达趋势相反，相似度可达９０％，证实转录组测序结果的可靠性。

结果表明甘蓝型油菜湘油１５主要通过光合作用、碳代谢和渗透调节等途径调节抗旱能力，为进一步阐明油菜耐旱机制奠定了基础。

关键词：甘蓝型油菜；干旱胁迫；转录组分析；差异表达基因 中图分类号：Ｓ６３４．３０１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２３）０５－００５１－０５收稿日期：２０２２－０６－２１基金项目：国家自然科学基金面上项目（编号：３１９７１８３４）；湖南省教育厅优秀青年项目（编号：１９Ｂ２６６）。

作者简介：张　蕾（１９９８—），女，湖南衡阳人，硕士研究生，从事植物分子生物学研究。

甘蓝型油菜REVEILLE家族鉴定及诱导表达分析刘蓉;田闵玉;李光泽;谭成方;阮颖;刘春林【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2024(40)6【摘要】【目的】REVEILLE家族基因具有重要生物学功能,而在甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中该家族基因研究较少,深入认识甘蓝型油菜中RVE家族基因功能及其与非生物胁迫的关系。

【方法】利用生物信息学方法,在甘蓝型油菜、白菜(Brassica rapa)和甘蓝(B.oleracea)中分别鉴定到33、16和16个RVE基因,并对其系统进化、染色体定位、基因结构和理化性质以及启动子顺式元件进行分析。

【结果】所有的RVE蛋白被分为两个亚家族。

33个BnaRVE分别定位在18条A 亚基因组的染色体和15条C亚基因组的染色体上。

大部分成员属于较稳定的疏水蛋白;多数Ka/Ks值小于1,说明该家族受到强烈的纯化选择作用。

基因结构变异较大,内含子数目在4-11之间。

共线性分析结果表明,甘蓝型油菜和拟南芥、白菜、甘蓝存在大量的同源基因。

大部分甘蓝型油菜RVE家族成员在子叶和叶都有表达且表达量最多。

BnaRVE启动子上含有大量与激素和生物逆境相关的元件,通过定量PCR分析,4个BnaRVE在ABA与MeJA诱导和低温胁迫下的表达量显著上调。

【结论】在甘蓝型油菜基因组中鉴定出33个BnaRVE家族成员。

不同基因在不同发育时期和不同组织中表现出不同的表达模式。

不同基因对各种胁迫存在响应,且表达模式不一。

RVE家族成员对ABA、MeJA和冷胁迫具有正向响应功能。

【总页数】11页(P161-171)【作者】刘蓉;田闵玉;李光泽;谭成方;阮颖;刘春林【作者单位】作物代谢调控与代谢工程实验室、湖南农业大学农学院;作物表观遗传调控与发育湖南省重点实验室、湖南农业大学生物科技学院【正文语种】中文【中图分类】Q94【相关文献】1.甘蓝型油菜光敏色素(PHY)家族基因的鉴定及表达分析2.甘蓝型油菜BnFUL基因家族全基因组鉴定与表达分析3.甘蓝型油菜WOX基因家族的鉴定与表达分析4.甘蓝型油菜MAP70基因家族全基因组鉴定与表达分析5.甘蓝型油菜HIPPs基因家族的鉴定与表达分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(1): 27 39/ ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail:***************本研究由江西省自然科学基金项目(20202BABL205016), 湖北省自然科学基金重点(杰青)项目(2018CFA075), 优质高产多抗油菜新品种选育项目(2018ABA087)和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-13)资助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Jiangxi Province (20202BABL205016), the Hubei Provincial Natural Science Foundation (Outstanding Youth) (2018CFA075), the Breeding of New Rapeseed Varieties with High Quality, High Yield and Multiple Resistance (2018ABA087), and the China Agriculture Research System (CARS-13).*通信作者(Corresponding author): 师家勤,E-mail:*******************同等贡献(Contributed equally to this work)第一作者联系方式:E-mail:*****************Received (收稿日期): 2020-12-27; Accepted (接受日期): 2021-04-14; Published online (网络出版日期): 2021-06-15. URL: https:///kcms/detail/11.1809.S.20210615.1402.008.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.04281甘蓝型油菜角果数突变体基因的定位及候选基因分析赵改会1,** 李书宇2,** 詹杰鹏1 李晏斌3 师家勤1,* 王新发1 王汉中11中国农业科学院油料作物研究所, 湖北武汉 430062; 2 江西省农业科学院作物研究所, 江西南昌 330200; 3武汉市农业技术推广中心, 湖北武汉 430400 摘 要: 角果数是油菜单株产量重要的构成因子之一, 其优异等位基因的发掘和利用对产量的提高至关重要。

基因工程与油菜育种李彦龙（河西学院农业与生物技术学院甘肃张掖 734000）摘要：转基因油菜的农艺性状明显优于普通油菜，表现在抗病虫性、抗逆性等优良特性上。

反式烯脂酰-CoA 还原酶(trans-2，3-enoyl-CoA reductase， ECR)是催化超长链脂肪酸(VLCFAs)合成的脂肪酰-CoA 延长酶之一。

根据已报道拟南芥ECR 基因设计引物，采用RACE (rapid amplification of cDNA ends)方法从甘蓝型油菜中克隆ECR 的全长cDNA 序列和对应的基因组序列，命名BnECR 。

根据编码区预测BnECR 前体蛋白为一个310 个氨基酸残基的多肽链，包含ECR 蛋白的重要功能位点K144、R145 及一NAD(P)H 结合基序G225SGGYQIPR/HG234。

BnECR 在高芥酸材料种子发育中后期的表达量显著高于低芥酸种子，表明BnECR 可能参与甘蓝型油菜芥酸的合成。

BnECR 克隆到酿酒酵母的穿梭表达载体中，分别转化野生型酵母By4743 和突变体菌株YDL015c，添加半乳糖诱导表达。

关键词：油菜，选育，克隆，芥酸1转基因油菜后代的农艺性状表现及其抗虫性研究油菜作为重要的食用油来源及工业原料，其发展和生产一直受到人们的重视，2006年，我国油菜种植面积已达到666.7万hm2。

但是由于国内油菜籽产量与食用油消耗量差口较大，1999/2000年度我国油菜籽进口量一度创下385.5万t的历史最高纪录，2003/2004年度油菜籽进口量也维持在41.8万t左右。

因此，扩大油菜种植面积，提高油菜单产已成为我国油菜生产的当务之急。

目前，影响油菜生产的因素除通过政策调整提高农民种植油菜的积极性外，病虫害对油菜生产发展的制约也不容忽视。

特别是虫害，常年的虫害发生面积都很大，全球每年因虫害对农业生产所造成的损失仍高达20%～30%[1]。

在我国油菜菜粉蝶[Artogeia(pieris)rapae(Linnaeus)]的发生面积就占油菜播种面积的20%以上。

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(9): 1563−1568/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@基金项目: 国家重点基础研究发展计划(973计划): 油菜籽油脂形成的分子生物学机制及其代谢调控(2006CB101600) 作者简介: 肖钢(1978−), 男, 博士研究生, 从事油菜遗传育种研究。

0731-*******, E-mail: sanjian123@*通讯作者(Corresponding author): 官春云(1938–), 男, 教授, 主要从事油菜遗传育种研究。

E-mail:guancy2000@Received(收稿日期): 2007-12-04; Accepted(接受日期): 2008-02-10.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01563甘蓝型油菜油酸脱氢酶基因(fad2)多个拷贝的发现及分析肖 钢1,2 张宏军1,2 彭 琪1 官春云1,2,*(1 湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室, 湖南长沙 410128; 2湖南农业大学油料作物研究所 / 国家油料作物改良中心湖南分中心, 湖南长沙 410128)摘 要: 以甘蓝型油菜湘油15为材料, 随机挑选56个来自基因组的fad2基因克隆、47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA 克隆和9个授粉27 d 后种子中fad2 cDNA 克隆进行双向测序。

基因组中56个fad2序列的碱基同源性为91.0%~99.9%, 从中得到11个差异序列, 即11个不同的fad2基因拷贝。

将其翻译成氨基酸序列发现, 6个拷贝在编码区中出现多个终止密码子, 另外5个的同源性为90.60%~99.74%, 与47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA 序列进行比较, 发现fad2基因没有内含子。

从种子中的9个fad2 cDNA 克隆序列中找到2个有差异的cDNA, 它们的编码区中没有终止密码子, 说明在种子中有多个fad2基因表达。

甘蓝型油菜矮秆突变材料99CDAM的发现及遗传分析梅德圣;王汉中;李云昌;胡琼;李英德;徐育松【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2006(28)7【摘要】随着杂种优势的利用,油菜株高增加了20 cm以上,导致油菜生长后期倒伏的风险加大,通过利用特殊矮秆基因来控制株高将是解决倒伏问题的有效方法.在甘蓝型油菜自交多代品系中发现了一个株高85 cm左右的矮秆突变株99CDAM,该突变株具有开花早、分枝多等优良特性,产量性状和品质性状较好,并能稳定遗传,具有重要的育种利用价值.对99CDAM和高秆品系2091、7045和7350的正反交F1以及99CDAM和2091杂交的F2代、BC1代及F2:3家系的遗传分析结果:99CDAM的矮秆性状主要受3对隐性基因控制,存在母体细胞质效应,与以往的甘蓝型矮秆油菜有明显的区别.【总页数】7页(P851-857)【作者】梅德圣;王汉中;李云昌;胡琼;李英德;徐育松【作者单位】中国农业科学院油料作物研究所国家油料作物改良中心,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所国家油料作物改良中心,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所国家油料作物改良中心,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所国家油料作物改良中心,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所国家油料作物改良中心,武汉,430062;中国农业科学院油料作物研究所国家油料作物改良中心,武汉,430062【正文语种】中文【中图分类】Q6【相关文献】1.甘蓝型油菜芽黄突变体特异种质的发现及遗传分析 [J], 潘跃平;金永庆;戴忠良;毛忠良;吴国平;秦文斌2.小麦矮秆突变体矮秆基因的遗传分析 [J], 张祥池;郝燕冉;魏凡;张志锋;魏佳佳;付帅;安浩军;王睿辉3.甘蓝型油菜矮秆突变体的遗传及其矮秆基因的RAPD标记 [J], 黄天带;吴江生;王令强;华玉伟4.甘蓝型油菜半矮秆突变体dw-1的遗传分析与激素响应特性 [J], 宋稀;蒲定福;田露申;余青青;杨玉恒;代兵兵;赵昌斌;黄成云;邓武明5.小麦矮秆突变体je0098的遗传分析与其矮秆基因定位 [J], 付美玉;徐延浩;刘录祥;熊宏春;周春云;郭会君;谢永盾;赵林姝;古佳玉;赵世荣;丁玉萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

白菜型冬油菜BrADS2基因的克隆、表达分析与亚细胞定位目录一、内容描述 (3)1. 研究背景与意义 (3)2. 主要研究内容与目标 (5)二、材料与方法 (6)1. 材料来源 (7)拟克隆BrADS2基因的油菜品种 (8)用于表达分析的细胞系或组织样本 (9)2. 实验设计与方法 (10)BrADS2基因的克隆策略 (11)聚合酶链式反应(PCR)技术 (11)DNA测序与序列分析 (12)基因表达分析的实时荧光定量PCR(qPCR) (13)蛋白质亚细胞定位的实验方法 (13)三、BrADS2基因的克隆与序列分析 (15)1. 基因克隆 (16)引物设计与合成 (16)PCR扩增与克隆片段纯化 (17)测序与比对分析 (18)2. 序列特征分析 (19)氨基酸序列分析 (20)同源比对与系统发育树构建 (21)特异性分析 (22)四、BrADS2基因的表达分析 (23)1. 总RNA提取与纯化 (25)2. cDNA合成与质量检测 (26)3. 基因表达水平的qPCR测定 (27)4. 表达模式分析 (28)不同组织中的表达差异 (29)不同生长阶段的表达变化 (30)冷胁迫下的表达响应 (31)五、BrADS2蛋白的亚细胞定位 (32)1. 蛋白质提取与纯化 (33)2. 荧光标记与观察 (34)荧光蛋白的诱导表达与纯化 (35)荧光显微镜观察 (36)3. 定位分析 (37)亚细胞结构定位 (38)功能结构域的定位 (38)六、讨论 (39)1. BrADS2基因在油菜中的功能可能 (40)2. 亚细胞定位对BrADS2蛋白功能的意义 (42)3. 基因表达与性状关联分析的潜在应用 (42)七、结论 (43)1. BrADS2基因克隆与序列分析结果总结 (44)2. 基因表达与亚细胞定位的结果分析 (45)3. 对油菜遗传改良的潜在贡献 (46)八、致谢 (48)一、内容描述基因克隆：此部分将描述如何从白菜型冬油菜中成功克隆出BrADS2基因。

特早熟春性甘蓝型油菜sBnFLD基因的克隆及表达罗玉秀;张生萍;许唱唱;马小岗;杜德志【摘要】[目的]克隆特早熟春性甘蓝型油菜A基因组上的sBnFLD基因,并对其进行表达研究,为该基因的功能及其在成花转变中的作用研究奠定基础.[方法]根据GenBank中已报道的拟南芥和白菜型油菜FLD同源基因的保守序列设计引物,采用PCR和RT-PCR扩增特早熟春性甘蓝型油菜86号品系(光周期不敏感)的FLD同源基因,用qRT-PCR技术检测sBnFLD基因在86号品系不同发育时期茎、叶和茎尖中的表达情况.[结果]克隆出了sBnFLD基因,命名为sBnFLD,在GenBank中的登录号为KR003079.1.sBnFLD基因cDNA全长2 376 bp,有3个内含子,4个外显子,编码791个氨基酸残基,分子量86.5 ku,等电点8.5;sBnFLD为非分泌蛋白和非膜蛋白;sBn-FLD蛋白N端有2个保守的结构域α螺旋结构域(SWIRM)和NAD(P)-binding-8结构域,该蛋白有多个α螺旋和β折叠.生物信息学分析显示,sBnFLD蛋白与已报道的甘蓝型油菜未知蛋白(CDX73929.1)和电子克隆的白菜型油菜FLD(XP 009135110.1)氨基酸序列相似性达99％,与拟南芥FLD氨基酸序列相似性达87％.qRT-PCR分析结果显示,sBnFLD基因在油菜苗期和现蕾初期茎、叶、茎尖中均有表达,但在蕾期茎尖中表达量最高.[结论]克隆出的sBnFLD基因为甘蓝型油菜的FLD同源基因,该基因在春性特早熟甘蓝型油菜开花调控中可能起着重要的调节作用.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(044)011【总页数】7页(P90-96)【关键词】春性甘蓝型油菜;基因克隆;FLD同源基因;开花时间【作者】罗玉秀;张生萍;许唱唱;马小岗;杜德志【作者单位】青海大学生态环境工程学院,青海西宁810016;青海大学生态环境工程学院,青海西宁810016;青海大学生态环境工程学院,青海西宁810016;青海大学农林科学院,青海西宁810016;青海大学农林科学院,青海西宁810016【正文语种】中文【中图分类】S565.4开花是植物从营养生长向生殖生长转变的重要发育过程。

甘蓝型油菜FAE1基因启动子的克隆和瞬时表达载体的构建及功能分析胡浩; 王茂华; 刘绵学; 杨毅【期刊名称】《《四川师范大学学报（自然科学版）》》【年(卷),期】2011(034)005【总页数】5页(P719-723)【关键词】FAE1启动子; 瞬时表达; 荧光素酶【作者】胡浩; 王茂华; 刘绵学; 杨毅【作者单位】四川大学生命科学学院四川成都610064; 四川大学生物资源与生物环境教育部重点实验室四川成都610064【正文语种】中文【中图分类】Q78植物油是重要的农产品之一，现已发现在植物油中存在的脂肪酸有上千种.近几十年来，人们在许多油料作物脂肪酸成分改造方面取得了巨大的成果.通过经典的育种技术，如诱变、筛选、杂交等方法来获得一些应用价值高、性状优良的作物品系.近年来，随着分子生物学和基因工程技术的发展，油料作物特别是油菜中许多参与各种脂肪酸合成的酶基因相继被分离和克隆，加快了对油菜的脂肪酸成分改造的步伐.芥酸(erucic acid，C22：1，△13)属于超长链脂肪酸(very long chain fatty acid，VLCFAs).天然的油菜通常富含芥酸(通常为45%～60%).而植物芥酸的合成是在内质网上脂肪酸延长酶1(Fatty Acid Elongase 1)的作用下进行的.通过对甘蓝型油菜超长链脂肪酸突变体的遗传学研究，发现18C以上的脂肪酸的延长可能受到FAE1基因的调控.因此要通过基因工程改变芥酸的含量无疑要借助于对该延长酶基因的调控.而基因的调控主要表现在转录水平上，所以对FAE1基因启动子的研究就有了重要的意义.脂肪酸延长酶1(FAE1)是广泛存在于植物中并定位于内质网上的一种能催化脂肪酸碳链延长的酮脂酰CoA合成酶，研究FAE1的启动子的功能及其影响的环境因子，是非常必要的过程［1－2］.高等植物基因表达，是当前分子生物学研究的热点之一，广受关注［3－7］.ABA在植物的生理活动过程中扮演着重要的角色［8－11］，参与调节植物生长发育和环境胁迫应答等诸多生理过程.本实验利用PCR方法克隆到甘蓝型油菜中FAE1基因的启动子.通过网站预测分析，FAE1具有基本的ABA信号响应元件ABRE(abscisic acid－responsive elements：PyGACACGTGG).在此基础上构建FAE1启动子与荧光素酶报告基因(Luciferase：LUC)融合的瞬时表达载体，通过PEG介导法将瞬时表达载体转化入油菜叶肉原生质体，对报告基因LUC定量分析，进行启动子的瞬时表达作用的研究.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料甘蓝型油菜“蜀杂九号”恢复系父本84100－18(Brassica napus L.)，种子由四川大学王茂林提供.1.1.2 菌株和质粒 E.coli JM109，质粒PBI221由德国慕尼黑工业大学植物研究所Erwin Grill惠赠.质粒PBI221－LUC：BamHⅠ和Ecl136Ⅱ双酶切PBI221质粒GUS基因，连接具有相同粘性酶切位点的LUC报告基因.1.1.3 主要试剂 rTaq酶，琼脂糖DNA胶回收试剂盒为天根公司产品;PCR产物纯化试剂盒购于天泰生物公司;各种限制性内切酶，T4 DNA连接酶为MBI－Fermentas公司产品;Taq DNA Polymera，pMD18－T载体购与TAKARA公司;PCR引物由英骏公司合成.1.2 方法1.2.1 甘蓝型油菜总DNA提取取油菜幼嫩叶片，液氮中研磨，用CTAB法提取甘蓝型油菜总DNA.1.2.2 引物设计根据NCBI数据，序列号AF275254，设计下列引物，进行PCR扩增：上游P1：5'－GAGAAGGATGTAAATAGTTGGGAAGT－3'下游 P2：5'－GGAGAATAGTAGAGGAAGC GATGAG－3'1.2.3 甘蓝型油菜FAE1基因启动子的克隆，测序和同源性分析以上述提取的总DNA为模板，使用引物P1，P2和Taq酶进行扩增，PCR反应条件为：94℃5 min;94℃ 30 s，60℃ 40 s，72℃ 80 s，35个循环;72℃10 min.目的片段扩增后命名为FP，胶回收PCR产物连接pMD18－T载体，挑取阳性重组质粒送英骏公司测序.结果使用Vector NTI软件进行拼接，拼接结果使用NCBI的Blast功能对GenBank中的核酸序列进行同源性比对.1.2.4 瞬时表达载体的构建先后用HindⅢ、BamHⅠ对pBI221－LUC质粒以及pMD18－FP进行双酶切，然后分别回收载体片段以及FP片段，然后再用T4－DNA连接酶将两个片段连接，16℃反应12 h，转化大肠杆菌细胞，以氨苄霉素培养基筛选重组单克隆菌落.瞬时表达载体pBI221－LUCFAE1构建原理如图1所示.1.2.5 拟南芥原生质体的收集、转化和报告基因LUC的检测按照YANG的方法，收集拟南芥原生质体并用PEG介导质粒PBI221－FP－L的转化，转化1～4 h后，将已转化的原生质体按0、1、10和100 μmol/L的浓度梯度分别加入诱导因子ABA，每份样品做3个重复样本，25℃、50 r/min培养10 h.检测报告基因荧光素酶LUC的表达情况.2 结果与分析2.1 FAE1基因启动子的克隆以甘蓝型油菜总DNA为模板，P1和P2为引物进行FAE1基因启动子的扩增，电泳检测可见在1 000～2 000 bp中间有明显的DNA 条带，如图2，将回收的片段连接于pMD18－T，再挑取菌落做PCR.处于对后续试验中所需要的酶切位点的考虑，在阳性克隆中筛选出目标条带正向连接的质粒，即启动子的上游靠近pMD18－T上HindⅢ 酶切位点，下游靠近pMD18－T上BamHⅠ酶切位点.然后进行酶切检测，可以看见在3 000 bp和1 000多bp处看见两条明显条带如图3，因此说明pMD18－FP中间载体构建成功.将pMD18－FP送去测序，结果正确.经Gen-Bank数据库比对后发现与已知油菜FAE1基因启动子有99%以上的同源性.2.2 克隆片断序列及分析测序结果表明，克隆到的DNA片段长度为1 328 bp见图4.将该序列与GenBank中登陆的核苷酸序列(GenebankID：AF275254)进行同源性比较，具有高达99.7%的同源性.1～1 233 bp为FAE1基因的启动子区域.经PLACE数据库的查询，推测转录起始位点位于DNA片段的1 232 bp的CGG 中的G开始，其上游含有5个TATA盒、3个CAAT盒、1个W盒、2个 TGA－element、1个ABRE、1个GARE等多种顺式作用元件.主要元件的分布位置和核心序列见表1.表1 FAE1基因启动子顺式作用元件的分布Table 1 Distributions of cis-acting element of Toc33 gene promoter顺式作用元件的名称分布位置核心序列TATABOX －366，－232，－166，－142，－25TATA CAATBOX －641，－569，－528，－245 CAAT WBOX －301 TTGACC TGA－element －908，－830 AACGAG ABRE －547 CACGTG GARE －1048 TCTGTTG2.3 瞬时表达载体的构建用HindⅢ、BamHⅠ酶切pMD18－FP，得到约1 300 bp和2 700 bp的片段，回收1 300 bp的小片段;同样的酶切pBI221－LUC载体，得到800 bp和5 000 bp左右的条带，回收大片段.用T4－DNA连接酶连接.这样，FP就取代了pBI221－LUC载体上原来的35S启动子，从而构建成PBI221－FP－LUC瞬时表达载体.然后再用HindⅢ、BamHⅠ酶切验证构建好的载体，发现在1 300 bp和5 000 bp左右有明显条带.如图5所示，表明载体pBI221－FP－LUC构建成功.2.4 瞬时表达与报告基因的检测制备并收集好的油菜原生质体，采用FDA染色后，具有活性的呈浑圆形，发绿色荧光，每份样品中，要至少2×105个活性原生质体才能保证报告基因的正常检测，所以在计数板上记数，并根据实际浓度计算出每个样品需要的原生质体的体积，一部分不进行质粒转化的原生质体用作负对照，其余的转化后按ABA不同的浓度梯度诱导表达(0、1、10、100 μmol/L).LUC基因检测的结果表明，报告基因LUC的表达量有明显变化，呈逐步下降趋势：ABA浓度为0 μmol/L时表达量最高，随后ABA浓度增加，LUC表达量下降到最低水平，但是仍然高与本底水平.多次实验都得到相似的实验结果.结果显示：高浓度ABA(100 μmol/L)处理FAE1启动子，使报告基因表达量降低7～8倍，如图6所示.3 讨论油菜原生质体瞬时表达的结果显示，导入了pBI221－FP－LUC后，报告基因LUC的表达量比本底水平高出了几倍，说明FAE1的启动子启动了LUC的表达，但是随着ABA的加入，这个表达量呈现逐步下降趋势，说明ABA对FAE1启动子具有负调控的作用.但是尚不清楚其具体的作用机制及启动子区域的关键位置.因此，在今后的研究中将继续缩小作用元件的搜索范围，对区域内关键元件进行单个碱基突变，针对各个元件进行研究，确定真正起作用的序列位置.ABA在植物很多生理调节过程中起着重要的作用，比如气孔的关闭、种子的休眠等，通过对FAE1的启动子的序列分析，发现－548位存在着一个ABA应答元件(ABRE)，序列为CACGTG.ABRE元件的存在很大程度上可以解释LUC的表达量减少的情况.另外除了启动子必有的TATA盒和CAAT盒之外，FAE1启动子还含有其他的一些顺式作用元件，比如TGA－element元件就与植物的光照调控有关，GARE元件就与植物的赤霉素调控有关，也就是说还有诸多影响其转录调控的因子.关于油菜 FAE1基因启动子的功能，还有待于进一步研究.参考文献［1］James Jr D W，Lim E，Keller J，et al.Directed tagging of the arabidopsis fatty acid elongation(FAE1)gene with the maize transposon activator K［J］.Plant Cell，1995，7(3)：309－319.［2］Anthony A M，Mercedes W，Ljerka K.Accumulation of very－long－chain fatty acids in membrane glycerolipids is associated with dramatic aAlterations in plant morphology［J］.Plant Cell，1998，10：1889－1902. ［3］Giuliana G，Chiara T，Roberto M.Regulation of novel members ofthe arabidopsis thaliana CCAAT－binding nuclear factor Y 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