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SYBR+Green+I实时PCR对猪细小病毒体外复制动态研究

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４５８。蟋》２０１１年学术年会
收毒时间，为疫苗的生产提供了科学依据。该方法还可用于本病体外抗病毒药物的筛选、研制和作 用机制研究。
参考文献
【１】Ｍｏｌｉｔｏｒ ＴＷ，Ｏｒａｖｅｅｒａｋｕｌ Ｋ Ｚｈａｎｇ ＱＱ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｍｓ 【Ｊ】．Ｖｉｒ０１．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９１，３２：２０１－２１ １． ［２１ Ｓｏｎｇ Ｃ，Ｚｈｕ Ｃ，Ｚｈａｎｇ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｕｓｉｎｇ
（ｎｓ ｌ基因）全长均为１９８９ｎｔ，编码６６２个氨基酸；编码结构蛋白基因（ｖｐ ２基因）全长均为１７４０ｎｔ，编
码５７９个氨基酸。与ＧｅｎＢａｎｋ中ＰＰＶ全基因参考序列比较发现，ＨＮＺＫ－１株和ＨＮＡＹ株ｌｌＳ １基因、ｖｐ ２基因 与其它分离株同源性较高，经系统进化分析显示两毒株间同源性较高，与ｎａｎｊｉｎ９２００８０１株拥有较近的亲 缘关系；整体上我国的猪细小病毒流行毒株在进化树上比较接近。
讨论
目前判定猪细小病毒增殖效果的标准方法是测定其ＴＣＩＤ５０，但是该方法比较费时、费力，而且 不能精确定量。而荧光ＰＣＲ更加适合用于病毒的快速、特异定量检测，从而了解病毒体外增殖的动 态规律。笔者所建立的ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ
Ｉ实时ＰＣＲ可检测ＰＰＶ ＨＮＺＫ一１株在ＰＫ．１５细胞上感染后的复
制增殖状况，而且具有较好的特异性和敏感性。通过该方法，笔者也首次绘制了ＰＰＶ ＨＮＺＫ．１株在 ＰＫ．１５细胞上的增殖曲线，并利用病毒拷贝数定量的方法确定了ＨＮＺＫ—ｌ株最佳的接毒方法和接毒、
材料方法
根据ＧｅｎＢａｎｋ所公布的ＰＰＶ全基因序列设计３对特异性引物，将ＨＮＺＫ－１和ＨＮＡＹ株ＰＰＶ全部编码基 因及部分３’和５’末端序列组分３个重叠片段进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ产物纯化后进行序列测定并拼接成全 基因序列，通过基因软件进行病毒的系统进化分析。
结果
ＰＰＶ
ＨＮＺＫ－１和ＨＮＡＹ株全基因组全长分别为４６６８和４６１０个核苷酸。其中编码ＰＰＶｔ乍结构蛋白基因
讨论
本研究中ＨＮＺＫ－１株和ＨＮＡＹ株的ｎｓ ｌ基因有较高的同源性，与ＮＡＤＬ．２株相比两株病毒在氨基酸序
列上分别有６个和７个位点发生了变异，但这并没有引起ＮＳ １蛋白主要结构域和功能位点的改变。ＰＰＶ的
ＶＰ２蛋白能诱导产生中和抗体，是ＰＰＶ最主荽的中和抗原决定簇，决定ＰＰＶ的组织嗜性、宿主范围、血 凝性等。Ｂｅｒｇｅｒｏｎ等发现弱毒与强毒及皮炎型ＰＰＶ的ＶＰ ２蛋白的氨基酸序列之间存在着差异。Ｓｉｍｐｓｏｎ
（河南农业大学，河南郑州４５０００２）
目的
为获得猪细小病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ
ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ
ＰＰＶ）河南流行株基因组资料，研究其分子特征及变异程度，
进一步的为猪细小病毒病的防治提供基础科学依据，本研究对近年来新分离的两株猪细小病毒河南流行 株（ＨＮＺＫ．１株和ＨＮＡＹ株）进行了全基因克隆与序列分析。
Ｇｒｅｅｎ ｖｐ
２基
Ｉ实时ＰＣＲ方法，研究ＰＰＶ的体外复制规律，为疫苗的研制提供技术和理论依
材料方法
根据已经发表的猪细小病毒（ＰＰＶ）的ｖｐ ２基因序列，设计一对特异性引物，建立检测ＰＰＶ 的ＳＹＢＲ 究。
Ｇｒｅｅｎ
Ｉ实时ＰＣＲ方法。利用该方法对ＰＰＶ在体外感染ＰＫ．１５细胞上的复制动态进行研
结果
本研究建立了检测ＰＰＶ的ＳＹＢＲ
养猪生产与猪病防Biblioteka 专题ｏ４５７Ｔ０３００９９
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
Ｉ实时ＰＣＲ对猪细小病毒体外复制动态研究
＿－Ｅ）ｌｌ庆王新卫赵 军 陈 陆杨
顾
帅
霞常洪涛
（河南农业大学，河南郑州４５０００２）
目的
猪细小病毒几乎能在所有猪原代细胞和传代细胞上生长繁殖。目前主要通过免疫荧光方法或 细胞病变观察来了解病毒在体外的复制情况。但上述方法仅能反映病毒在空间Ｅ的复制状况，而 不能准确反映病毒在细胞内的增殖规律及向细胞外释放病毒的动态变化规律，往往错过收获病毒 的最佳时期。而实时ＰＣＲ方法可很好的克服这些问题，其能在不同时间点准确测定病毒复制的拷 贝数，从而了解病毒的体外复制动态。鉴于此，本研究在参考前人的基础卜建立检测ＰＰＶ 因的ＳＹＢＲ 据。
ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ｄｉｒｅｃｔ ＲＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．【Ｊ】．Ｖｉｒａｌ
ｏｎｅ－ｔｕｂｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ
Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００１，９１（２）：１４９—１５５．
Ｔ０３０１００
两株猪细小病毒河南流行毒的全基因克隆与序列分析
顾 帅
王川庆赵军
王新卫
陈
陆杨
霞常洪涛
ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ＮＳｌ ｇｅｎｅ
ａ
ｔａｑｍａｎ—ｂａｓｅｄ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ
ｐｒｏｂｅ
ＩＪ］．Ｖｉｒｏｌ Ｊ．２０１０．２：７（１）：３５３．
ａ
［３１ Ｂｉｓｓｅｔ ＬＲ，Ｂｏｓｂａｃｈ Ｓ，Ｔｏｍａｓｉｋ Ｚ，ｅｔ ａ１．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ
Ｇｒｅｅｎ
Ｉ实时ＰＣＲ方法，其最小检出量为１２个ＰＰＶ拷贝。模
板浓度在１０８范围内稀释呈良好的线性关系，与ＰＣＶ ２、ＰＲＲＳＶ、ＪＥＶ、ＣＳＦＶ、ＰＲＶ无交叉反应。 应用本方法对ＨＮＺＫ．１株在ＰＫ．１５细胞上的复制动态进行了研究，并首次绘制了病毒的体外增殖曲 线：细胞外病毒量在接毒初始的３６ｈ逐渐下降，随后开始逐步增加。接毒后８４ｈ培养液中病毒含量 （１．７３９ｘ１０１０拷贝）逐渐超过细胞内的病毒含量（１．３２１ｘ１０１０拷贝），在接毒后１０８ｈ培养液中病毒含 量达到最高点（７．６２６ ｘ１０１０拷贝），随即病毒含量开始快速下降。细胞内病毒粒子在接毒后２４ｈ内 为一对数增长期，然后为一缓慢增长期。至接种后７２ｈ达到复制最高点（１．４２５ｘ１０１０拷贝），接毒后 ８４ｈ略有降低（１．３２１ｘ１０１０拷贝），并维持至接毒后１０８ｈ。与病毒复制动态变化相对应的细胞病变是 从细胞聚集、开始形成蚀斑到约８０％的细胞病变产生。１０８ｈ之后随着细胞的大量死亡，细胞内、外 病毒数量都开始急剧减少。

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猪细小病毒6型SYBR Green I REAL-time PCR检测方法的建立

猪细小病毒6型SYBR Green I REAL-time PCR检测方法的建立

猪细小病毒6型SYBR Green I REAL-time PCR检测方法的建立引言猪细小病毒（Porcine circovirus，PCV）是一种广泛存在于猪群中的DNA病毒，可引发猪类细小病毒病（Porcine circovirus disease，PCVD）。

其中细小病毒6型（Porcine circovirus type 6，PCV6）是近年来新发现的一种细小病毒亚型。

为了准确快速地检测PCV6的存在，本文将介绍一种基于SYBR Green I REAL-time PCR技术的检测方法的建立。

研究目的本研究的目的是建立一种可靠、灵敏的检测方法，用于检测猪细小病毒6型的存在。

材料与方法样本准备从猪群中收集疑似感染PCV6的组织样本，包括肝脏、脾脏、肺等。

将样本分别用离心管保存，在-80℃的冷冻柜中保存。

DNA提取使用DNA提取试剂盒从组织样本中提取DNA。

按照试剂盒说明书的操作步骤进行，最后将提取得到的DNA溶解于TE缓冲液中。

SYBR Green I REAL-time PCR反应体系准备根据PCR反应需要准备SYBR Green I REAL-time PCR反应体系。

具体的反应体系如下：成分体积（μL）SYBR Green I PCR master mix xDNA模板x引物1（前向引物）x引物2（反向引物）xDEPC水x将反应体系分装在96孔PCR板中，轻轻离心，置于PCR仪中进行扩增。

PCR扩增程序•预变性：95℃，10分钟•变性：95℃，20秒•退火：55℃，30秒•扩增：72℃，30秒•20个周期后的72℃延伸5分钟•降温：4℃数据分析使用相应的PCR仪进行实时荧光检测，记录荧光强度数据。

根据荧光强度曲线，判断样本是否存在PCV6。

结果与讨论本研究建立了一种基于SYBR Green I REAL-time PCR技术的检测猪细小病毒6型的方法。

通过实验验证，该方法可以准确快速地检测到PCV6的存在。

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

｝ ６ ｉ床 兽 医
中国畜牧 兽医文摘
２ ０ １ ４ 年
Hale Waihona Puke ３ ０ 卷第９ 期
牛 口炎 的诊 断与防治
董福彪
（ 云南省墨江县团 田镇畜牧兽医工作站 ，云南普洱 ６ ５ ４ ８ ｏ ５ ）
牛 口炎 又 称 口膜 炎 ，为 口腔 黏 膜 表层 的 炎症 。临床 上 分 为卡 可对单纯性和真菌性 口炎做 出临床诊断。临床检查时 ，要仔 细， 使 用 开 口器 时要 细 心 ，不能 粗 暴 ，以防 再一 次对 口腔黏 膜造 成损 他 性 、口疮性 、水 疱性 、蜂窝 织 炎性 、伪膜 性 、溃 疡 性及 丘 疹性 等类型。临床以流涎、食欲不振或采食缓慢 、口腔恶臭 ，口腔黏 伤 。因为诸多的细菌性 的和病毒性 的全身感染性疾病常伴发不同 ｌ 炎 ，因此 ，对继 发性 口炎要 结 合 流行 病 学调 查 及 实验 室诊 膜 潮 红 、增 温 、肿 胀 和疼 痛 为特 征 。牛 只一 旦 感染 ，可影 响到 牛 类 型 Ｅ
的采食 ，影 响其 营养 摄取 及正 常 的生长 发 育 。
断 等对 原发 病进 行确 诊 。 ，
１ 病 因
牛 口炎分 为原 发 『 生 和继 发 陛２ 种。
在 口炎诊治过程中，尤其要注意与传染性 口炎 、口蹄疫 、恶 性 卡 他 热等 病 症 的鉴别 诊 断 。相 比较而 言 ，牛 传 染性 口炎是 由病
２ 临 床 症 状
含营养 的青绿饲料 ，同时，配合清洁饮水 ，康复效果更好 。 日常 饲 养 管 理 ，一 旦 有 类 似 口炎 症 状 出 现 。应 该 立 即 隔 离
口腔 炎 的原 因不 同 ，症 状也 不 同 。临 床上 分 为 卡他 性 、口疮 就诊 ，尽早 治 疗 ，对 于康 复 有着 积极 推 动 作用 。早期 ，轻症 病 患 性 、水 疱性 、蜂 窝织 炎性 、伪膜 性 、溃疡 性及 丘 疹性 等 类 型 。无 畜，可考虑使用如下药物冲洗 口腔 ，一般皆可痊愈。可用浓度为 论 是 哪 种 口腔 炎 ，其 共 同 的临床 症 状 都表 现 为流 涎 、食 欲 不振 或 ２ ％ ３ ％的食盐水或者是硼酸液，也可用浓度为０ ． １ ％的高锰酸钾 ％的明矾溶液 ，任选其一即可。 采食 缓 慢 、口腔 恶臭 ， 口腔 黏 膜潮 红 、增 温 、肿 胀 和 疼痛 。卡他 溶液，或者是使用浓度为１ 性 口腔 炎 这些 症 状最 明显 ；１ ： ３ 疮性 口腔炎 时 ，在 口腔 黏膜 上 患有 对 于慢 性 口炎 ，可用 蛋 白银 溶 液 （ 药 用浓 度 为 １ ％～ ５ ％ ）或 白色 或 者 灰 白色 呈小 圆形 的坏 死 病灶 ，其 周 边 围着 红 色边 缘 ；患 者 是硝 酸银 溶液 （ 药用 浓度 为 ０ ． １ ％ ～０ ． ５ ％ ）进行 漱 口。 水疱 性 口腔炎 时 ，在 口腔 黏膜 、舌部 及 嘴唇 的 内侧 发 生透 明样 的 ５ 预 防措施 水 泡 ，经 ３— ４ ｄ ，水疱 破 溃 后 ，出现 暗红 色 的烂 斑 。在患 口蹄疫 方 面 。加 强饲 草 监管 ，确保 饲 喂草 料 洁净 、卫 生 ，严禁 饲
PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用赵丽;赵绪永;陈红英;崔保安【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)005【摘要】【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。

【方法】根据GenBank中的PPVVP2基因序列,设计并合成1对引物。

通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体中,构建重组质粒。

对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg2＋浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量PCR反应体系和标准曲线。

以阳性重组质粒为模板,建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。

应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验（HA）和常规PCR方法的检测效果进行比较。

【结果】在25μL扩增体系中,Mg2＋终浓度为4.5mol/L、SYBR Green染料浓度为20μmol/L、引物浓度为25μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。

所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20TCID50/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。

【结论】成功建立了PPVSYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。

【总页数】5页(P19-23)【作者】赵丽;赵绪永;陈红英;崔保安【作者单位】郑州牧业工程高等专科学校药物工程系,河南郑州450011;郑州牧业工程高等专科学校药物工程系,河南郑州450011;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2【相关文献】1.TMEM43基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 [J], 张海霞;赵克学;邓盈盈;梁浩勤;李倩;韩玉梅;马忠仁;冯若飞2.洪湖碘泡虫SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用 [J], 罗丹; 赵媛莉; 刘新华; 章晋勇3.牛病毒性腹泻病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 [J], 任亚初; 朱彤; 楚会萌; 程凯慧; 解晓莉; 张亮; 孙阳阳; 杨宏军4.牛轮状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 [J], 贾伟强; 常继涛; 范春玲; 曹禹; 周玉龙; 孟野; 胡林杰; 翟海瑞; 范增磊; 盛守志; 于力5.山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 [J], 张靖鹏;江锦秀;林裕胜;游伟;刘道泉;毛坤明;江斌;胡奇林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪流行性腹泻病毒SYBR_Green_I_实时荧光定量PCR_检测方法的建立

猪流行性腹泻病毒SYBR_Green_I_实时荧光定量PCR_检测方法的建立

·研究论文·摘 要：为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒（PEDV ）检测方法，本研究从GenBank 数据库中获取PEDV N 基因序列，扩增出PEDV N 基因标准质粒，并在N 基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物，成功建立了SYBR Green I 实时荧光定量PCR 检测方法。

经过一系列试验表明，该检测方法线性关系良好，R 2值为0.99；特异性强，敏感性高，最低可检测至2.23 copies/μL ，比普通PCR 灵敏约100倍；重复性好，组内变异系数为0.25%~0.43%，组间变异系数为0.67%~0.97%；对于各地区96份临床样品检测出PEDV 阳性率为25%。

本研究建立的实时荧光定量PCR 检测方法为PEDV 的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。

关键词：猪流行性腹泻病毒；N 基因；SYBR Green I ；荧光定量PCR中图分类号：S852.65 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2024）02-0174-07Development of SYBR Green I Real-Time PCR for Detection of Porcine EpidemicDiarrhea VirusDONG Sujie 1,2, KONG Ning 2, QIN Wenzhen 2, ZHAI Huanjie 2, ZHAI Xueying 2, YANG Xinyu 2,TONG Wu 2, ZHENG Hao 2, YU Hai 2, TONG Guangzhi 2, LI Youwen 1, SHAN Tongling 2(1. College of Animal Science and Technology, Tarim University, Alar 843300, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS,Shanghai 200241, China)猪流行性腹泻病毒SYBR Green I 实时荧光定量PCR检测方法的建立董苏洁1,2，孔 宁2，秦文珍2，翟焕杰2，翟雪滢2，杨心雨2，童 武2，郑 浩2，于 海2，童光志2，李有文1，单同领2（1.塔里木大学动物科学与技术学院，阿拉尔843300；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）Abstract: In order to develop an effi cient and sensitive detection method for Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), the PEDV N gene sequence was obtained from GenBank database and a pair of specifi c primers were designed from its conservative region for development of a SYBR Green I real-time PCR method. A series of experiments were performed for optimization and the optimal factors included the linear correlation coeffi cient at 0.99 and detection limit at 2.23 copies/μL, which was about 100 times more sensitive than conventional PCR. The coeffi cient of variation within groups was between 0.25%-0.43% and between groups was between 0.67%-0.97%, indicating its good repeatability. Total 96 clinical samples from various regions were tested using this method and the PEDV positive rate was 25% (24/96). The real-time PCR method developed in this study provided an eff ective tool for clinical diagnosis, epidemiological investigation and quantitative research of PEDV .Key words: Porcine epidemic diarrhea virus; N gene; SYBR Green I; real-time PCR收稿日期：2021-12-20基金项目：国家自然科学基金（31872478，32102665，31760741）；上海自然科学基金（19ZR1469100）作者简介：董苏洁，女，硕士研究生，兽医学专业通信作者：李有文，E-mail：**************；单同领，E-mail：*********************.cnChinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2024,32(2):174-180· 175 ·董苏洁等：猪流行性腹泻病毒SYBR Green I 实时荧光定量PCR 检测方法的建立第32卷第2期猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的传染性肠道疾病[1]。