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高亲水性强阳离子交换色谱填料的制备及其在蛋白质分析中的应用_刘吉众

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2013年4月Vol．31No．4April2013ChineseJournalofChromatography310～316

色谱固定相专栏·研究快报DOI：10．3724/SP．J．1123．2012．12005

*通讯联系人．Tel：（010）62557910，E-mail：zhaorui@iccas．ac．cn．基金项目：国家自然科学基金项目（21075125，21105105）．收稿日期：2012-12-03

高亲水性强阳离子交换色谱填料的制备及其在蛋白质分析中的应用

刘吉众1，黄嫣嫣1，杨博2，常建华2，刘国诠1，赵睿1*（1．中国科学院化学研究所，中国科学院活体分析化学重点实验室，北京100190；2．西安交大保赛生物技术股份有限公司，陕西西安710054）

摘要：以具有双孔结构的聚甲基丙烯酸环氧丙酯（PGMA）微球为基质，以葡萄糖进行表面亲水改性，制备了强阳离子交换色谱填料，并将其用于复杂生命体系中生物大分子的快速而高效的分离、分析与纯化。葡萄糖亲水改性增进了填料的生物相容性，提高了蛋白质样品的回收率；双孔结构及较高的比表面积赋予填料良好的柱渗透性和样品负载量。以标准蛋白质为样品，考察了该填料对生物样品的分离性能。以100mm×4.6mm的色谱柱分离4种蛋白质，在6min内实现了基线分离；以溶菌酶为样品，填料的吸附容量为39.5g/L，在蛋白质快速分离纯化分析中显示了良好的应用前景。关键词：强阳离子交换；固定相；聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球；葡萄糖改性；蛋白质分析中图分类号：O658文献标识码：A文章编号：1000-8713（2013）04-0310-07

Preparationofhighlyhydrophilicstrongcationexchangersandtheirapplicationsinproteinanalysis

LIUJizhong1，HUANGYanyan1，YANGBo2，CHANGJianhua2，LIUGuoquan1，ZHAORui1*（1．CASKeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforLivingBiosystems，InstituteofChemistry，ChineseAcademyofSciences，Beijing100190，China；2．Xi’anJiaodaBio-SepTechnologiesCo．Ltd，Xi’an710054，China）

Abstract：Basedontheneedsofnewpackingmaterialsforrapidandefficientseparation，purificationandanalysisofbiomacromolecules，anovelsulfonicacid-typestrongcationexchangeresin（SP-G-PGMASCXresin）wasprepared．Theporouspoly（glycidylmethacrylate）microspheres（PGMA）wereselectedasthematrixandglucosewasusedasthehydrophilicmodifiertoblockthehydrophobicdomainsofPG-MAbeads．GlucosemodificationonPGMAbeadsimprovedthebiocompatibilityandreducedthenon-spe-cificadsorptionsoastoincreasetherecoveriesofprotein．ThePGMAbeadspossesstheporousstructureandtherelativelyhighspecificsurfacearea，whichmakethePGMA-basedresinsgoodpermeabilityandhighloadingcapacity．TheapplicationofsuchSP-G-PGMASCXresinforthechromatographicseparationofbiomacromoleculeswasexplored．Fourbasicproteinswerebaselineseparatedwithin6minwiththecolumnsizeof100mm×4.6mm．TheadsorptioncapacityoflysozymeonSP-G-PGMASCXresinwasdeterminedas39.5g/L．Theresultsmakethematerialpromisingfortheseparationandpurificationofbiomacromolecules．Keywords：strongcation-exchange；stationaryphase；poly（glycidylmethacrylate）microspheres；glu-cosemodification；proteinanalysis

随着生命科学和生物工程技术的飞速发展，复杂生命体系中活性生物大分子的分离、分析和纯化已成为分析化学和分离科学面临的一个重要任务［1，2］。蛋白质是生命活动的主要物质基础。研究

蛋白质必须将其从复杂的生命体系中分离出来并保持其原有的生物活性。在生物工程下游技术中，既要第4期刘吉众，等：高亲水性强阳离子交换色谱填料的制备及其在蛋白质分析中的应用

求分离介质具有高的分离效率，又需要尽可能快的分离速度，以提高生产的时空效率。因此，发展生物大分子，尤其是蛋白质的分离、纯化与分析新材料和新技术已成为生物工程技术的一个研究热点［3－5］。图1SP-PGMASCX树脂制备流程图Fig．1ChemicalschemeforthepreparationoftheSP-PGMASCXresin离子交换色谱［6－8］（IEC）因其良好的生物相容性、温和的洗脱模式，且能够在分离过程中最大限度地保持生物分子的活性，而在生物大分子的分离纯化中发挥着重要的作用［9－12］。相比于传统的多糖类基质IEC填料机械强度差，局限于中、低压分离的缺点，聚合物型IEC基质［13］具有高的机械强度和良好的化学稳定性，可实现中、高压快速分离［14］，在生化样品分离纯化中具有广阔的应用前景。但是目前常见的聚合物型高效IEC填料多以表面改性的交联聚苯乙烯（PS）微球为基质，表面疏水性强，生物相容性较低，在生物大分子分离中极易造成非特异性吸附而影响产物的回收率和生物活性。尽管表面化学修饰和改性技术可以使其疏水性得到改善［15］，但非特异性吸附的消除仍是一个难题。因此，基于亲水性功能单体，发展新型交联高聚物基质的IEC填料是必然的选择［14］。聚甲基丙烯酸环氧丙酯（PG-MA）的环氧基团具有很高的反应活性，环氧基水解产生的二醇基团可提高其生物相容性［16］，用于生物大分子的快速分离与分析。Zhao等［17，18］利用无孔PGMA微球作为亲和色谱基质，用于多肽的高效筛选，基于其低非特异性吸附，获得了高选择性的多肽探针。Zhou等［19］利用反胶团溶胀法制备了超大孔PGMA微球，非常适于生物大分子的快速高效分离。此外，PGMA还被成功用于生物传感器的表面修饰，以进行肝素与抗凝血酶III的动态相互作用研究［20］。虽然PGMA基质在生化分离分析中显示了较好的应用前景，但其骨架中的疏水性结构仍会不同程度地对生物大分子产生非特异性吸附。因此，需要通过表面接枝修饰等方法消除非特异性吸附，以进一步增强其生物相容性。本研究针对生物大分子的高效、快速分离和高活性回收，以微米级直径、全PGMA双孔微球为基质，进行了PGMA表面亲水改性，据此构建了具有良好生物相容性的高效强阳离子交换液相色谱填料，并用于模型蛋白质分离分析的研究。

1实验部分

1．1试剂

甲基丙烯酸环氧丙酯（GMA）购自苏州安利化工厂；甲基丙烯酸乙二醇双酯（EDMA，纯度98%）购自Sigma-Aldrich公司，使用前经减压蒸馏以除去阻聚剂；十二烷基磺酸钠（SDS）、1-辛醇购自天津津科精细化工研究所；偶氮二异丁腈（AIBN）购自华北特种化学试剂发展中心，经乙醇重结晶纯化后使用；单分散PGMA微球为中国科学院化学研究所赵睿研究员课题组自制，粒径10μm，孔径200nm；其他试剂均为分析纯，购自北京化工厂。蛋白质样品，包括核糖核酸酶A（RNaseA，来源于牛胰脏）、α-胰凝乳蛋白酶原A（α-ChyA，来源于牛胰脏）、细胞色素C（CytC，来源于马心）和溶菌酶（Lys，来源于鸡蛋白），均购自Sigma公司。超纯水

取自Milli-QGradient超纯水系统。1．2PGMA基质强阳离子交换填料的制备

将PGMA微球悬浮在0．lmol/L硫酸溶液中、60℃下搅拌反应12h，进行微球表面环氧基水解，产物用超纯水洗涤后真空干燥备用。取一定量水解后的PGMA-EDMA微球，在碱性条件下加入一定比例量的烯丙基缩水甘油醚搅拌反应，即制得烯丙基化PGMA-EDMA微球。配制3mol/L的焦亚硫酸钠溶液，用浓NaOH溶液调节pH至6.5。将烯丙基化PGMA-EDMA微球分散于焦亚硫酸钠溶液中，在氮气保护下于室温条件下进行反应，产物用乙醇、超纯水充分清洗后，即制得磺酸基强阳离子交换微球（SP-PGMASCX树脂）。制备流程见图1。1．3葡萄糖亲水改性SP-PGMASCX树脂的制备

取一定量的PGMA微球加入至葡萄糖溶液中，在搅拌下加入含有KBH4的NaOH溶液，室温下反应24h，产物用超纯水洗涤并真空干燥，即制得葡萄糖接枝的PGMA-EDMA微球。以此微球按照1.2节

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第六章 层析技术

第六章 层析技术


常用术语
固定相：是由层析基质组成的，其基质包括固体
物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固 定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与相关 的化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。
流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向 一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层 析时，流动相又称洗脱液或洗涤剂。在薄层层析 时流动相又称展层剂。
几个概念
吸附剂 吸附剂的选择主要依据吸附剂本身和被吸附物
质的极性，为活性多孔固体，表面积大、颗粒均 匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。
常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基 磷灰石等。
• 羟基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2]
表面有Ca2+和PO43-两种带电基团。酸性和中性蛋 白质可与Ca2+结合，碱性蛋白质可与PO43-结合。
*气体作为流动相
*吸附在固体上的液体为固定相
按两相所处的状态分为： 液相色谱 液-固层析 液-液层析 气相色谱 气-固层析 气-液层析
（2）按层析原理分类
吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶排阻层析
（3）按操作形式不同分类：
柱层析
纸层析
薄层层析
Liquid Chromatography
突出贡献: 预测气相色谱(1952年应用);提出用细小颗粒 作填料,而两端可以加压(HPLC).
1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现， 诺贝尔化学奖
1952年，马丁同詹姆斯(James)一起，把分配层析应 用在分离气体上。各种气体或蒸汽的混合物可以利用氮 或氦一类情性载气的气流通过吸收性固体的表面。混合 的气体通过后，在另一端实现分离。
洗脱体积（Ve）：
是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体积。
HILIC

HILIC

亲水相互作用色谱（HILIC）1.简介亲水色谱Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。

它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。

而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。

HILIC 的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。

2.适用范围普通反相色谱难以保留的物质，强极性、亲水性物质。

3.使用(1)极性小物质先被洗脱，极性大物质、亲水性物质强保留后洗脱。

梯度洗脱时流动相极性逐渐增加。

(2)常用流动相：乙腈/水（缓冲盐）体系。

(3)常用缓冲盐溶液：甲酸胺溶液或醋酸铵溶液（一般10mM）。

(4)进样：常用进样溶剂为75/25乙腈/甲醇。

(5)平衡：开始进样前，用20倍柱体积的起始流动相平衡色谱柱。

(6)流动相中总是至少保持5%的极性溶剂以保证填料始终被水浸润，至少保持有机溶剂的比例不低于40%。

4.清洗与再生用50/50的乙腈/水清洗以去除极性污染物。

如果清洗无效，可用5/95的乙腈/水清洗色谱柱。

5.保存柱子保存在95%乙腈中。

不要将色谱柱保存在缓冲盐流动相中，如果流动相中含有缓冲盐，先用10倍柱体积的HPLC级水清洗色谱柱然后换上95%乙腈保存。

6.注意事项(1)不要使用磷酸盐缓冲体系，因为磷酸盐缓冲盐在HILIC色谱模式下会析出。

(2)避免使用水或DMSO做进样溶剂，尽量用100%乙腈溶解样品进样。

食品中那非类物质的测定(90种)

食品中那非类物质的测定(90种)

附件食品中那非类物质的测定（BJS 201805）1 范围本标准规定了食品（含保健食品）基质中90种那非类物质的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。

标准中方法一超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法，适用于饮料、果冻、蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、酒类及咖啡等食品（含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊、软胶囊等剂型）中90种那非类物质的定性和定量测定。

标准中方法二超高效液相色谱-串联高分辨质谱法，适用于饮料、果冻、蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、酒类及咖啡等食品（含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊、软胶囊等剂型）中90种那非类物质的筛查和定性确证。

方法一超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法2原理试样经甲醇超声提取，过滤后，滤液供超高效液相色谱—三重四极杆串联质谱仪测定，外标法定量。

3试剂和材料注：水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂3.1.1 甲醇（CH3OH）：质谱级。

3.1.2 甲酸（HCOOH）：质谱级。

3.1.3 乙酸乙酯（C4H8O2）：分析纯。

3.1.4 盐酸（HCl）：分析纯。

3.2 试剂配制3.2.1 0.1%甲酸水溶液：取甲酸1mL用水稀释至1000mL，用滤膜（4.3）过滤后备用。

3.2.2 盐酸甲醇溶液（1+99）：取盐酸1mL用甲醇稀释至100mL。

3.2.3 甲醇水溶液（1+1）：将甲醇与水等体积混合。

3.3 标准品西地那非等90种物质标准品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见附录A表A.1，纯度≥98%。

3.4 标准溶液配制—1 —3.4.1标准储备液（200 μg/mL）：分别精密称取Lodenafil carbonate（46罗地那非碳酸酯）、Sildenafil dimer impurity（63西地那非二聚体杂质）、Vardenafil dimer（69伐地那非二聚体）标准品（3.3）各10mg，用盐酸甲醇溶液（1+99）溶解并稀释至50mL，摇匀；分别精密称取其余87种标准品（3.3）各10 mg，用甲醇溶解并稀释至50mL，摇匀，制成浓度为200 μg/mL标准储备液。

色谱柱常用填料

色谱柱常用填料

保护柱填料一般与分析柱填料相同。

Hypersil 填料Hypersil 填料是基于粒度为3um 、5um和10um, 孔径为120A的硅胶为基质的HPLC填料其生产过程的质量控制标准非常严格全世界数千个实验室使用Hypersil色谱柱已长达20多年很多应用实例可以从多种文献及著名杂志上查到。

大量的试验测试已经证实Hypersil ODS2填料是替代Waters Spherisorb ODS2的最佳填料无论是在酸性还是碱性样品的分析上选择性与峰型几乎与其保持一致。

Hypersil BDS填料尽管常规填料色谱柱具有优异的选择性和较长的色谱柱寿命且对于简单的两元流动相如甲醇/水当样品为酸性中性和弱碱性化合物时均可获得较佳的峰不对称度但当分析药物等样品中的强极性含氮的化合物时样品峰型就极差拖尾严重并导致定量分析精度下降时常会出现一些小峰埋没于前一拖尾峰的尾巴中造成该现象的原因是固定相上尚有残余的硅羟基尽管很多厂家对硅胶表面作了第二次反应即所谓的封尾以减小残余硅羟基的作用但往往都不能完全消除残余的硅羟基的影响Hypersil公司开发的将残余的硅羟基降至极限的Hypersil BDS (Base Deactived Silica碱钝化硅胶)系列产品并用现代衍生反应技术生产出特别适用于碱性化合物的真正均一反相填料。

Hypersil BDS 填料的特征*对碱性化合物有更好的峰型*更长的柱寿命*更好的稳定性*同碱性化合物一样酸性和中性化合物也有非常优异的峰型真正的通用柱填料。

尽管常规填料色谱柱具有优异的选择性和较长的色谱柱寿命。

且对于简单的两元流动相(如甲醇/水)，当样品为酸性、中性和弱碱性化合物时均可获得较佳的峰不对称度。

但当分析药物等样品中的强极性含氮的化合物时，样品峰型就极查，拖尾严重，并导致定量分析精度下降，时常会出现一些小峰埋没于前一拖尾峰的尾巴中，造成该现象的原因是固定相上尚有残余的硅羟基。

尽管很多厂家对硅胶表面作了第二次反应，即所谓的“封尾”，以减小残余硅羟基的作用，但往往都不能完全消除残余的硅羟基的影响。