第5章离子交换与色谱

第五章色谱原理5.1色谱的原理和分类5.1.1色谱色基本原理色谱技术是一种重要的分离和分析技术，其用于物质的分离始于二十世纪初。

1903年，俄国植物学家Tswett向填充碳酸钙的柱中注入植物色素的石油醚冲洗，发现柱中出现数条相互分离的色带，色谱法的命名就是由此发现开始的。

随后色谱技术得到不断发展。

Martin于1952年因创立气－液色谱分离方法而荣获诺贝尔奖。

气相色谱的出现极大地鼓舞了世界各地的科学工作者，激发了人们对分析色谱技术进行放大，使之用于制备目的和工业生产的研究兴趣。

资料表明，在50和60年代，分析和生产规模的气相色谱分离技术的研究十分活跃。

到了70年代，尤其是在美国制糖工业采用酶法转化技术生产高果葡糖浆以后，液相色谱技术就变成了一个热门的研究领域。

色谱在英文中只有一个名词Chromatography），但在中文中却有色谱和层析的名称。

色谱的主要装置如图所示;图色谱的主要装置图色谱实际是色谱分离精度高，设备简单，操作方便，根据各种原理进行分离的色谱法不仅普遍应用于物质成分的定量分析与检测，而且应用于生物物质的制备分离和纯化，成为生物下游加工过程最重要的纯化技术之一。

5.1．2色谱的分类1)流动相与固定相色谱法根据流动相的相状态分气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱法，而固定相有固体、液体和以固体为载体的液体薄层。

2)固定相的形状根据固定相或色谱装置形状的不同，液相色谱法又分为纸色谱法（Paper chromatography）、薄层色谱法（Thin－layer chromatography）和柱色谱法（Column chromatography）。

纸色谱法和薄层色谱法多用于分析目的，而柱色谱易于放大，适用于分离大量制备分离，是主要的色谱分离手段。

3)分离操作方式色谱法根据分离操作方式的不同可分为间隙色谱和连续色谱两大类。

间隙色谱技术通过合理选择固定相介质和冲洗剂可以得到广泛应用。

但是，在工业应用中更希望采用连续分离操作，尤其是分离过程必须与其他连续单元操作（如连续生化反应器）同时进行时更是如此。

离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）2、离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）蛋⽩质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH⼩于其等电点时，带净正电荷，⽽在缓冲液pH⼤于其等电点时，带净负电荷。

阴离⼦交换凝胶本⾝带有正电荷基团，阳离⼦交换凝胶本⾝带负电荷基团。

由于静电相互作⽤⽽使样品结合到凝胶上，再采⽤盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进⾏洗脱对于等电点⼩于5.0的酸性蛋⽩质，推荐使⽤阴离⼦交换，对于等电点⼤于7.0的碱性蛋⽩质，推荐使⽤阳离⼦交换。

两种模式：⼀种使⽬的蛋⽩结合凝胶，通过梯度洗脱；⼀种使⽬的蛋⽩不结合凝胶，⽽⼤部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有⽬的蛋⽩。

column chromatography（柱⾊谱）batch chromatography（批⾊谱）c、疏⽔作⽤⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽在⾼盐存在下，可以结合疏⽔凝胶，⽽在盐浓度降低时⼜可以解脱的原理实现分离。

d、亲和⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽与某些配基的特异性相互作⽤⽽进⾏分离。

例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋⽩-凝集素，抗原-抗体等。

近来发展了⾦属螯合亲和⾊谱，⽤于纯化表⾯含⾊氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋⽩质以及(His)6-tagged重组蛋⽩。

亲和⾊谱分为特异性亲和⾊谱和组别亲和⾊谱两类。

肝素、凝集素、染料、⾦属螯合亲和⾊谱均为组别亲和⾊谱（同⼀配基可以结合许多种蛋⽩质）。

e、反相⾊谱常⽤于蛋⽩质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极⾼，可以分离两种仅相差⼀个氨基酸的多肽。

如⾎管紧张素（angiotensin）的⼏个亚型通过反相⾊谱可以很好地分离。

同⼀个样品在同⼀Source 30 RPC柱上进⾏分离，由于⾊谱条件进⾏了改变，⾊谱图截然不同，说明反相⾊谱具有⾼度的选择性。

四、应⽤举例例⼀、⼀种抗HIV gp120单克隆抗体的Fab⽚断（E.coli中表达）分⼦量：50 kD等电点：11表达定位：周质（periplasmic）纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离⼦交换去除⼤部分杂质，疏⽔作⽤⾊谱进⼀步去除杂质，最后⽤凝胶过滤分离。

离子交换色谱原理
离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，简称IEC）是
一种常用的色谱分离技术，基于离子交换原理进行物质的分离。

在离子交换色谱中，站相通常由带电离子的树脂组成，称为离子交换树脂。

离子交换树脂具有一定的官能团，可以与带相反电荷的离子发生静电吸附或解离平衡。

当样品溶液经过离子交换树脂柱时，带相反电荷的离子会与树脂上的固定离子发生竞争吸附，从而实现不同离子之间的分离。

离子交换色谱根据离子交换的方式可分为阳离子交换色谱（Cation Exchange Chromatography，简称CEX）和阴离子交
换色谱（Anion Exchange Chromatography，简称AEX）。

在
阳离子交换色谱中，树脂上的固定离子为阴离子，吸附的是带正电荷的离子；而在阴离子交换色谱中，则相反。

在离子交换色谱中，采用不同的洗脱剂可以改变离子交换平衡，从而实现样品组分的分离。

常用的洗脱剂包括盐溶液、酸溶液或碱溶液，其浓度和pH值的调节可以改变离子交换树脂的吸
附和解吸特性。

离子交换色谱在生物医药、环境分析等领域有着广泛的应用。

通过调节离子交换树脂和洗脱剂的条件，可以实现对不同离子性物质的定量和质量分析。

同时，离子交换色谱也可以用于纯化和富集目标化合物，具有良好的分离效果和高选择性。

总结而言，离子交换色谱利用离子交换树脂栏柱，通过调节洗
脱剂的性质和条件，使样品中的离子与固定离子发生交换吸附和解吸反应，从而实现对样品中离子的分离和分析。

该技术在分析化学和生物化学中具有重要的应用价值。

离子交换色谱法分析化学离子交换色谱法是一种常用的分离和分析方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。

该方法基于离子交换剂与样品中离子之间的相互作用，实现对目标化合物的分离和分析。

本文将介绍离子交换色谱法的基本原理、实验操作步骤以及在化学分析中的应用。

一、离子交换色谱法的基本原理离子交换色谱法利用离子交换剂作为固定相，通过与样品中离子之间的相互作用，实现分离目标化合物。

离子交换剂是一种具有交换基团的功能性材料，通过基团与样品中离子进行交换，从而实现对目标化合物的分离。

根据不同的交换基团和固定相材料，离子交换色谱法可应用于不同类型化合物的分离和分析。

二、实验操作步骤1、准备实验仪器和试剂，包括色谱柱、流动相、样品溶液等。

2、将离子交换剂填充至色谱柱中，制成固定相。

3、将样品溶液注入进样器中。

4、开启泵，使流动相通过色谱柱，将样品中的离子与固定相中的交换基团进行交换。

5、通过检测器对分离后的离子进行分析和检测。

6、根据峰高、峰面积等参数计算目标化合物的含量。

三、离子交换色谱法在化学分析中的应用1、有机酸和碱的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定有机酸和碱的含量，如乳酸、柠檬酸、苯胺等。

通过选择合适的离子交换剂和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。

2、金属离子的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定金属离子，如钠、钾、钙、镁等。

通过选择含有适当功能基团的固定相，可实现对不同金属离子的分离和分析。

3、环境样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定环境样品中的阴、阳离子，如水样、土壤样品的分离和分析。

通过优化实验条件，可实现高分辨率分离和准确测定。

4、生物样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定生物样品中的离子，如氨基酸、多肽等。

通过选择合适的固定相和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。

5、其他领域的应用：离子交换色谱法还可应用于化学合成、药物分析、食品分析等领域。

通过选择合适的固定相和流动相，可实现对不同类型化合物的分离和分析。

方法摘要：离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。

当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。

溶液pH低于C产品组分等电点PI时，组分带正电荷，可以跟固定相上的阳离子交换，吸附在固定相上，用盐浓度梯度洗脱时，组分按照表面正电荷从少到多的顺序被洗脱下来。

紫外检测器检测280nm处的响应值，根据组分峰面积计算纯度。

范围：适用于本公司生产出的C产品的中间产品、原液、成品及稳定性样品的电荷异质性分析。

职责：操作人员：➢严格按照此规程要求进行操作。

岗位主管：➢起草文件，并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新；➢监督操作规程是否与实际过程一致，资源是否满足要求；➢培训，确保此操作规程的正确实施。

程序：1术语解释无2试剂和材料➢色谱柱：阳离子交换色谱柱，例如MabPac TM SCX-10，4.0×250mm，10µm（Thermo）➢试剂：N-（2-乙酰胺基）-2-氨基乙磺酸（ACES，分析纯），氯化钠（NaCl，色谱纯），盐酸（HCl，分析纯），磷酸氢二钠（Na2HPO4，色谱纯），磷酸（H3PO4，色谱纯），纯化水（自制）➢滤膜：孔径为0.45µm或以下注：所用试剂可被同等或更高级别的试剂替代，但应证明适用；所有材料遵循厂家有效期。

3仪器设备➢液相色谱仪：例如Agilent 1260➢天平，精确到mg➢pH计➢溶剂过滤装置➢离心机（转速10000 rpm以上）➢移液器（10-1000 µl）4溶液配制4.1流动相配制4.1.1流动相A：20 mM ACES，pH 6.20称取ACES 3.64 g，加入1000 ml 水搅拌至完全溶解，HCl调pH 6.20±0.02；经0.45 μm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脱气15min。

离子交换色谱的原理摘要：本文主要从基础原理与实验设计思路两个方面讲述了蛋白纯化实验中离子交换色谱的应用，并附有AKTA离子交换色谱操作案例。

基本原理离子交换色谱是蛋白纯化技术中常用的一种纯化方法，其原理是指被分离物质所带的电荷可与离子交换剂所带的相反电荷结合，这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的，在改变pH或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。

由于不同物质的电荷不同，其与离子交换剂的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而被分离出来。

离子交换剂是由不溶于水的网状结构高分子聚合物骨架构成，骨架上有许多共价结合的带电基团，如果侧链是带正电基团，就可与带负离子相结合，称为阴离子交换剂，吸附带负电蛋白质。

如果侧链是带负电的基团，则称为阳离子交换剂。

强离子交换树脂在宽pH范围内保持离子化，而弱离子交换树脂只在窄pH值内离子化。

类型名称英文符号阴离子交换剂二乙基氨乙基季氨基乙基季氨基三乙基氨乙基氨乙基DEAEQAEQTEAEAE阳离子交换剂羧甲基磺丙基磺甲基磷酸基CMSPSP大多数重组蛋白通过离子交换纯化。

离子交换色谱基于高分辨率，可直接放大并应用于工业。

该柱可以容易地再生，并且可以浓缩蛋白质。

大部分蛋白质的静电荷是负电荷，所以阴离子交换色谱是应用最广泛的。

实验设计介质的选择首先，在离子交换介质中要考虑目标分子的大小，因为目标分子会影响其与介质上带电官能团的接近程度，所以也会影响介质对目标分子的动载荷，从而影响其分离。

对于大多数纯化步骤来说，建议从开始的阶段使用强离子交换柱，可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。

对于已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。

而未知等电点的蛋白质，在实际操作中常采用这样的方法，先选择一个阴离子交换剂，再选择一个中性的pH缓冲液，将蛋白质样品透析至pH7.0，然后过阴离子交换柱。

根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液pH。

第五章 习题及答案1. 色谱柱主要有哪几种？各有什么特点？各适用于何种类型物质的分析？答：气相色谱，液相色谱，薄层色谱，超临界色谱和高效毛细管电色谱。

气相色谱适用于沸点低于400℃的各种有机或无机气体的分离分析。

液相色谱适用于高沸点、热稳定性差及具有生理活性物质的分离分析。

薄层色谱是简单的经典色谱方法。

超临界色谱主要用于分离高沸点大分子试样。

高效毛细管电色谱适合从无机离子到生物大分子，从荷电粒子到中性分子的分离分析。

2. 速率理论阐明了什么问题？速率方程式中的各项分别表示什么意义？答：速率理论将塔板理论中的塔板高度概念与组分在两相中的扩散和传质联系起来，指出分离过程中峰展宽的原因是由于有限的传质速率和传质阻力的存在所引起的动力学效应的影响所致。

u C u BA H ⋅++=A ：涡流扩散项；uB：分子扩散项；u C ⋅：传质阻力项。

3. 根据速率理论，可从哪几个方面来提高柱效？答：减小固定相颗粒粒度，选择摩尔质量小的气体作载气，降低传质阻力。

4. 色谱分离过程中的热力学因素和动力学因素分别由那两个参数表现出来？两个色谱峰的保留时间相差较大，就一定分离完全了吗？ 答：保留时间和峰宽；不一定。

5. 某物质色谱峰的保留时间为65 s ， 半峰宽为5.5 s 。

若柱长为3 m ， 则该柱子的理论塔板数为多少？ 答：774)5.55.6(54.5)(54.5222/1=⨯==Y t n R6. 计算当两组分的分配系数比为1.05时，柱的有效塔板高度为0.1 mm 时，需要多长的色谱柱才能将两组分完全分离？ 答：先求7. 某试样中，难分离物质对应的调整保留时间分别为40 s 和45 s ， 填充柱的塔板高度近似为1 mm 。

假设两者的峰底宽度相等，若要完全分离（R=1.5），柱长应为多少？答：8. 某一气相色谱柱，速率方程中A 、B 、和C 的值分别是0.08 cm ， 0.36 cm 2·s -1和4.3×10-2 s ，计算最佳线速度和最小塔板高度。

离子交换色谱法的原理
答：离子交换色谱法的原理是：
离子交换是利用一种不溶性高分子化合物，它的分子中具有解离性基团(交换基)，在水溶液中能与溶液中的其他阳离子或阴离子起交换作用。

此种交换反应都是可逆的，一般也都是遵循化学平衡的规律。

虽然交换反应都是平衡反应，但在色谱柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正反应方向进行，直至完全，因此可以把离子交换剂上的原有离子全部洗脱下来。

当一定量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少，因此也可以全部被交换而吸着在交换剂上，根据这一原理可以用离子交换法直接从植物提取液中交换含游离离子基团的酸、碱及两性成分，使与糖类等无游离离子基团的中性物质分开，而被吸着的物质也可用另一洗脱液洗脱下来，这就是常用的离子交换法。

最新精选全文完整版（可编辑修改）生化分离技术（Techniques in Bio-separation）课程代码：09410053学分：2学时：32 （其中：课堂教学学时： 32 实验学时：0）先修课程：分析化学、生物化学适用专业：生物技术、生物工程、制药工程教材：《生化分离技术》，田亚平编著，化学工业出版社，2010一、课程性质与课程目标（一）课程性质（需说明课程对人才培养方面的贡献）生化分离技术是描述生物产品分离过程中所采用方法和手段的一门科学，是生物技术及相关专业的一门重要专业必修课程,培养学生设计和实施与生化分离提纯相关的产品研究、开发和生产的能力，并能够对具体问题进行分析和解决的能力。

（二）课程目标通过本课程的学习，使学生重点掌握通过本课程的学习，使学生掌握常见生化分离手段的基本原理与方法，如沉淀、过滤、色谱及电泳分离等及其在实际生产中的应用。

知识目标1、理解并掌握生物样品前处理的基本原理、分类和一般实验操作方法；2、理解并掌握沉淀技术的基本原理、分类和一般实验操作方法；3、理解并掌握离心技术的基本原理、分类和一般实验操作方法；4、理解并掌握萃取技术的基本原理、分类和一般实验操作方法；5、理解并掌握色谱分离的基本原理、分类和一般实验操作方法；6、理解并掌握电泳分离的基本原理、分类和一般实验操作方法。

能力目标7、具备开展常见生物分离纯化手段单元操作能力；8、具备根据生物样品和目的组分的理化性质，设计实验方案进行规模分离纯化的能力；9、具备较强的专业英语阅读能力和自主学习意识。

二、课程内容与教学要求（按章撰写）第一章绪论（Introduction）（一）课程内容（1）生化分离技术发展的历史和地位（History and current status of bioseparation）（2）生化分离技术的应用范围（Applications of bioseparation）（3）生化分离技术方案设计与选择（Program design and selection in bioseparation）（二）教学要求（1）了解生化分离技术的种类和技术应用和研发的新近趋势；（2）重点掌握生化分离的基本原则（3）重点掌握生化分离具体方案设计时理论的灵活运用(本章难点)第二章生物样品的预处理（Pre-treatment of biological samples）（一）课程内容（1）细胞的破碎与分离（Cell separation and disruption）（2）沉淀方法分类（Classification of precipitation）（3）沉淀技术应用（Application of precipitation in biochemical separation）（4）离心基本原理（Basic principles of centrifugation）（6）超离心技术（Ultra-centrifugation）（二）教学要求（1）了解生物样品预处理技术的新近发展趋势；（2）重点掌握生物样品预处理的方法和基本原理；（3）重点掌握沉淀、离心分离等技术在具体应用中的技术特点(本章难点)。