鼠李糖乳杆菌在酸奶中应用研究

鼠李糖乳杆菌是什么
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)是从健康人肠道分离出的1株乳杆菌，是人类研究最广泛的益生菌之一。

它是全球研究最多的一种益生菌，属于第三代益生菌。

目前全球已有四十多个国家和地区有鼠李糖乳杆菌产品生产和销售。

鼠李糖乳杆菌是益生菌，从属于乳杆菌属，有调节微生态平衡、增强宿主肠道抵抗力、预防和治疗腹泻、消除过敏的功能，可用于各种食品、保健食品和微生态制品或豆制品等。

鼠李糖乳杆菌有什么作用
鼠李糖乳杆菌能够耐受动物消化道环境，在人和动物肠道内定植，起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素及提高机体免疫力等功效。

高纯度的鼠李糖乳杆菌对于过敏体质有很好的缓解作用。

1、平衡和改善胃肠道功能
2、增强人体自身免疫能力
3、促进双歧杆菌和嗜酸乳杆菌生长和作用
4、预防和帮助治疗腹泻
5、预防呼吸道感染
6、排出毒素
7、预防龋齿
8、预防过敏
奶粉中添加鼠李糖乳杆菌有什么好处
鼠李糖乳杆菌常用于酸奶、酸奶饮料、牛奶、奶粉、奶酪，果汁饮料、胶囊等制作。

比如来自新西兰的奶粉品牌萌力优（molyneux）就添加了鼠李糖乳杆菌（HN001）。

这种优质益生菌能在宝宝的肠道中存活，起到提高宝宝免疫力、预防过敏及哮喘、维护肠道健康的作用。

同时还添加高品质益生菌乳双歧杆菌（HN019），具备优异的免疫赋活作用。

鼠李糖乳杆菌功能特性的研究进展
贺璟;聂乾忠;邓洁红
【期刊名称】《农产品加工·学刊》
【年(卷),期】2012(000)003
【摘要】鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG,ATTCC53103)是从健康人体的肠道中分离得到的,是全球最受关注、研究最广泛的益生菌之一.该菌能够耐受动物消化道环境,能够在人体和动物肠道内定植,起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿和提高机体免疫力等作用.
【总页数】4页(P117-120)
【作者】贺璟;聂乾忠;邓洁红
【作者单位】湖南农业大学食品科技学院,湖南长沙410128;湖南农业大学食品科技学院,湖南长沙410128;湖南农业大学食品科技学院,湖南长沙410128
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.3
【相关文献】
1.鼠李糖乳杆菌生物学特性及功能特性研究进展 [J], 陈宇强;曾敏;潘丽媚
2.多功能蛋白Prohibitin功能特性及其与心血管疾病关系的研究进展 [J], 孙鑫鑫;杨迪成;袁忠祥
3.鼠李糖乳杆菌对肠道屏障功能的影响机制研究进展 [J], 唐昱婷;汤加勇;赵华
4.鼠李糖乳杆菌对肠道屏障功能的影响机制研究进展 [J], 孟祥庆
5.鳄梨中主要功能成分及其功能特性研究进展 [J], 周先艳;朱春华;高俊燕;李进学;凌鹏;岳建强
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292020年第33卷第11期 粮食与油脂乳酸菌发酵核桃乳的研究进展赵 晶1，张 筠1，陈喜君2，杨国力2（1. 黑龙江东方学院，黑龙江哈尔滨 150086；2. 黑龙江众生生物工程有限公司，黑龙江哈尔滨 150028）摘 要：概述了发酵核桃乳的营养保健价值、发酵用菌及其功能成分的研究现状，为发酵核桃乳的深入研究提供理论依据。

关键词：乳酸菌；发酵核桃乳；健康饮品；功能成分Research progress on walnut milk fermented by lactic acid bacteriaZHAO Jing 1, ZHANG Yun 1 , CHEN Xi-jun 2, Y ANG Guo-li 2(1. East University of Heilongjiang, Harbin 150086, Heilongjiang, China;2. Johnsun Biological Engineering CO., Ltd, Harbin 150028, Heilongjiang, China)Abstract: The research status of nutritional value, strain and the functional components of the fermented walnut milk were summarized, and the theoretical basis for the deep study of the fermented walnut milk was provided.Key words: lactic acid bacteria ; fermented walnut milk ; healthy drink;functional component 中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1008-9578（2020）11-0029-03收稿日期：2020-02-05基金项目：黑龙江东方学院项目（HDFHX160106）作者简介：赵晶，女，硕士，研究方向为功能性益生菌开发及利用。

DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.026326引用格式:陈大卫,梁娇娇,程月,等.鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵乳在非酒精性脂肪肝细胞模型中对人肝细胞L-02的益生作用[J].食品与发酵工业,2021,47(11):61-67.CHEN Dawei,LIANG Jiaojiao,CHENG Yue,et al.Probiotic function of Lac-tobacillus rhamnosus hsryfm 1301fermented milk on human hepatocyte L-02in NAFLD cell model[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(11):61-67.鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵乳在非酒精性脂肪肝细胞模型中对人肝细胞L-02的益生作用陈大卫1,梁娇娇1,程月1,瞿恒贤1,陈春萌1,任晨瑜1,张臣臣1,关成冉1,马文龙1,陈霞1,李启明2,顾瑞霞1∗1(扬州大学食品科学与工程学院江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室,江苏扬州,225127)2(新希望乳业股份有限公司,四川成都,610023)摘㊀要㊀建立由游离脂肪酸(free fat acid ,FFA )诱导的体外人肝细胞L-02非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fat-ty liver disease ,NAFLD )模型,探究益生菌发酵乳在模型中对人肝细胞的益生作用㊂利用FFA (油酸ʒ棕榈酸=2ʒ1,摩尔比)诱导人肝细胞脂肪变性,通过细胞存活率㊁胞内甘油三酯(triglyceride ,TG )和总胆固醇(total choles-terol ,TC )含量㊁培养液中天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase ,AST )和谷丙转氨酶(alanine amin-otransferase ,ALT )含量及细胞凋亡率等指标来评价脂肪变性模型,探讨鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵乳干预大鼠4周后的血清在模型中对人肝细胞L-02的影响㊂结果表明,当模型中FFA 的浓度为1.5和2mmol /L 时,人肝细胞的存活率显著低于未添加(P <0.05),均低于32%,细胞数量明显减少且形状发生变化;当FFA 浓度为1mmol /L 时,人肝细胞存活率较高,为86.37%,脂滴数量达到最高,此时建立的NAFLD 细胞模型中胞内TG 含量和培养液中AST 含量分别为5.73mmol /L 和113.50U /L ,均显著高于未添加(P <0.05),而胞内TC 含量及培养液中ALT 含量则无显著性差异(P >0.05),且细胞凋亡率差异较小㊂鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵乳干预大鼠后的血清降低了NAFLD 模型中肝细胞的脂滴数量,胞内TG 含量及大鼠血清细胞培养液中AST 含量均显著低于未干预菌株的对照组大鼠血清(P <0.05),分别为1.95mmol /L 和93.33U /L ;细胞凋亡率较对照组下降了2.96%,正常细胞数量上升了4.50%㊂利用1mmol /L 的FFA 可以建立人肝细胞L-02的NAFLD 模型,鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵乳干预后的大鼠血清对模型中人肝细胞L-02的脂肪变性具有改善作用㊂关键词㊀鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301;发酵乳;人肝细胞L-02;游离脂肪酸;非酒精性脂肪性肝病第一作者:博士,副教授(顾瑞霞教授为通讯作者,E-mail:guruixia1963@)㊀㊀基金项目:国家自然科学基金青年项目(31701627,31801565);国家自然科学基金面上项目(31972094);江苏省高等学校自然科学研究重大项目(19KJA140004);江苏省高等学校自然科学研究面上项目(17KJB550009); 十三五 国家重点研发计划课题项目(2019YFF0217602);成都市重大科技应用示范项目(2019-YF09-00055-SN)收稿日期:2020-12-01,改回日期:2021-02-04㊀㊀非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver dis-ease,NAFLD)是由非酒精消耗或其他原因引起的肝脏脂质过量,造成肝细胞中脂滴积聚,肝脏呈现肿大的现象,会对人体健康产生较大的影响[1]㊂目前,NAFLD 的药物治疗主要是通过预防肝细胞的氧化㊁减少肝细胞的促炎因子及血脂水平等方式进行[2-3],但其存在一定的副作用[4]㊂通过膳食干预也能有效改善肝脏的脂肪变性和炎症反应,并具有良好的益生作用[5],因此,膳食干预是人们进行辅助治疗NAFLD 的重要途径㊂益生菌及其发酵乳制品不仅可以通过调节肠道微生态平衡等来增强机体的抗氧化能力和免疫能力[6-7],还可以通过降低肝细胞的甘油三酯(triglyc-eride,TG)㊁总胆固醇(total cholesterol,TC)含量以及调节脂肪变性和炎症因子水平等来改善机体的NAFLD 症状[8-10]㊂而临床研究也发现,益生菌可以通过改善患者血清中的天门冬氨酸氨基转移酶(as-partate aminotransferase,AST )㊁肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)㊁白细胞介素-6(inter-leukin-6,IL-6)水平及降低脂肪肝指数等来达到辅助治疗NAFLD 的效果[11-14],但具体的作用机制尚不明确㊂目前,NAFLD 的机制研究大多数采用动物和肝癌细胞株HepG2来进行[15],但动物模型造模周期长㊁成本高㊁稳定性较差;同时,肝癌细胞株HepG2与人肝细胞存在较大的差距[16]㊂与之相比,人肝细胞系L-02具有造模周期短㊁个体差异小等优势[17]㊂来源于广西巴马长寿人群的鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳对由高血脂症引起的大鼠肝脏细胞脂肪变性具有良好的改善作用[18],但对于人肝细胞的作用效应和机制尚不明确㊂研究显示,将样品在大鼠体内经过一系列的生物转化,再作用于细胞的研究结果较样品直接添加到细胞中更为准确[19]㊂本文利用油酸和棕榈酸的混合物游离脂肪酸(free fat acid,FFA)建立体外人肝细胞L-02NAFLD模型,探讨鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳干预大鼠后的血清在模型中对脂肪变性的人肝细胞L-02的益生作用,并建立一种更接近于人肝细胞的体外NAFLD细胞变性模型㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料与试剂Wistar雄性大鼠,6周龄,体重(200ʃ20)g,扬州大学比较医学中心,动物生产许可证号SCXK(苏) 2017-0007,实验动物使用许可证号SYXK(苏)2017-0044;基础饲料(面粉㊁米粉㊁玉米㊁鼓皮㊁豆料㊁鱼粉及骨粉的质量分数分别为20%㊁10%㊁20%㊁26%㊁20%㊁2%㊁2%),江苏省协同医药生物工程有限责任公司;鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosu s)hsryfm 1301,江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室;人肝细胞株L-02,苏州北纳创联生物技术有限公司㊂胎牛血清,杭州四季青生物有限公司;RPMI-1640培养液,美国Hyclone公司;无脂肪酸牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),德国Ruibio公司;细胞冻存液㊁胰酶消化液(质量分数为0.25%)㊁RI-PA裂解液,上海碧云天生物技术有限公司;油酸钠(oleic acid,OA)㊁油红O试剂盒㊁AV/PI凋亡试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;棕榈酸钠,美国Sigma公司;CCK8(Cell Counting Kit-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒,日本同仁公司;甘油三酯(triglyceride, TG)㊁总胆固醇(total cholesterol,TC)㊁天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)㊁丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)试剂盒,美康生物科技股份有限公司㊂1.2㊀仪器与设备HERAcell150CO2培养箱㊁Multiskan Sky1510全波长酶标仪,美国ThermoFisher科技有限公司;IX2-ILL100荧光倒置显微镜,日本Olympus公司;7020全自动生化分析仪,日本日立公司;5804R高速冷冻离心机,德国Eppendorf股份公司;LSRFortessa流式细胞仪,美国BD公司㊂1.3㊀试验方法1.3.1㊀细胞培养将复苏的人肝细胞L-02置于完全培养液中(RP-MI-1640培养液和胎牛血清的体积分数分别为90%和10%),于37ħ,体积分数为5%CO2的培养箱中培养,每24h更换1次培养液,待细胞生长至对数期时(细胞面积>80%),用胰酶消化液消化传代,取5代后的细胞进行后续试验㊂1.3.2㊀NAFLD细胞模型中FFA的添加浓度1.3.2.1㊀不同FFA浓度对细胞存活率的影响取100μL浓度为5ˑ104个/mL的人肝细胞L-02悬液接种于96孔培养板中,在37ħ,体积分数为5%CO2的培养箱中培养24h后弃去培养液;利用含质量分数为1%的BSA完全培养液将5mmol/L FFA 分别稀释至0㊁0.25㊁0.5㊁0.75㊁1㊁1.5和2mmol/L;以未添加FFA为对照组,添加不同浓度的FFA为模型组,每组3个复孔,CO2培养箱培养24h后加入10μL CCK8试剂,37ħ孵育1h后于490nm处测定OD值,按公式(1)计算细胞存活率:细胞存活率/%=模型组OD值对照组OD值ˑ100(1) 1.3.2.2㊀不同FFA浓度对细胞脂滴的影响取1mL浓度为5ˑ105个/mL的人肝细胞L-02悬液接种于6孔培养板中,在37ħ,体积分数为5% CO2的培养箱中培养24h后弃去培养液,以未添加FFA为对照组,添加1.3.2.1小节中不同浓度的FFA 为模型组,每组3个复孔,CO2培养箱培养24h后,釆用油红O染色法观察细胞内脂滴变化情况㊂1.3.3㊀NAFLD细胞模型的评价1.3.3.1㊀细胞内TG㊁TC含量的测定取1mL浓度为5ˑ105个/mL的人肝细胞L-02悬液接种于6孔培养板中,以不添加FFA为对照组,添加最佳浓度的FFA为模型组,每组3个复孔,在37ħ,体积分数为5%CO2的培养箱中培养24h后弃去培养液,胰酶消化液消化3min后,用完全培养液终止消化,1000ˑg离心5min,PBS溶液清洗2遍,每管加入1mL RIPA细胞裂解液,吹打均匀,置于冰上裂解4h后,12000ˑg离心10min取上清液,采用全自动生化分析仪测定上清液中TG和TC 含量㊂1.3.3.2㊀细胞培养液中AST㊁ALT酶活力的测定从1.3.3.1小节培养24h后的6孔培养板中取出细胞上清液,以不添加FFA为对照组,4000ˑg离心5min,测定培养液中AST和ALT的含量㊂1.3.3.3㊀细胞凋亡率的测定取1mL浓度为5ˑ106个/mL的人肝细胞L-02悬液接种于6孔培养板中,在37ħ,体积分数为5% CO2的培养箱中培养24h,对照组加入含1%的BSA 的完全培养液,模型组加入最佳浓度的FFA,每组3个复孔,培养24h后加入500μL胰酶消化液消化3min后,加入完全培养液终止消化,1000ˑg离心5min,去上清液收集细胞;用100μL1ˑbuffer轻轻吹打细胞后,分别加入4μL异硫氰酸荧光素和4μL碘化丙啶,轻轻涡旋混匀,室温避光孵育15min后每管加入400μL1ˑbuffer,混匀,测定细胞凋亡率㊂1.3.4㊀鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳的制备将在MRS液体培养基中活化2代后的鼠李糖乳杆菌hsryfm1301按3%的接种量接种至热处理后质量分数为12%的脱脂乳中,42ħ发酵至活菌数为109 CFU/mL,进行活菌计数,4ħ贮藏备用㊂1.3.5㊀大鼠血清的制备试验期间保持动物房通风㊁透光,室温为(23ʃ1)ħ,湿度为(50ʃ5)%,22只Wistar雄性大鼠用基础饲料正常饲喂1周后,按各组间平均体重无显著差异分为对照组和益生菌干预组,每组11只㊂干预组喂食基础饲料,并按1mL/100g的量灌胃鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳,对照组喂食基础饲料及等量的质量分数为0.9%的生理盐水,每天上午灌胃1次,记录每天的进食量及每周的体重,以便调整灌胃量㊂4周后眼球取血,4ħ孵育30min,3500ˑg离心20min,合并同组大鼠血清,56ħ灭活30min除去血清中的杂抗体等物质,并利用0.22μm滤孔过滤除菌,避免细胞受到污染[17,20],-80ħ保存备用㊂所有实验程序严格按照‘实验动物的护理和使用指南“进行㊂1.3.6㊀鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳干预后的大鼠血清对模型中细胞的益生作用利用RPMI-1640培养液分别将对照组和干预组的大鼠血清稀释至10%[17],然后取1mL加至细胞模型中,每组3个复孔,于37ħ,体积分数为5% CO2的培养箱中培养24h,PBS溶液清洗2遍;观察各组细胞内脂滴的变化,并测定细胞中TG㊁TC含量㊁细胞凋亡率以及血清细胞培养液中AST和ALT的含量㊂1.4㊀数据处理与分析数据均采用Sigmaplot10.0㊁SPSS21.0软件进行统计和分析,结果以均值ʃ标准差(MeanʃSD)表示,以单因素方差分析进行显著性检验,P<0.05表示差异具有统计学意义㊂2㊀结果与分析2.1㊀NAFLD细胞模型中FFA的添加浓度通过测定模型中人肝细胞L-02的存活率及观察细胞内脂滴变化情况来确定模型中FFA的最佳添加浓度,结果如表1和图1所示㊂表1㊀不同浓度的FFA对细胞存活率的影响(n=3)Table1㊀Effect of different concentration of FFAon the survival rate of cellsFFA浓度/(mmol㊃L-1)OD值细胞存活率/% 0(对照组) 1.04ʃ0.01a100.00ʃ0.00a 0.250.98ʃ0.02b94.34ʃ1.58b 0.500.97ʃ0.02b92.88ʃ1.92b0.750.94ʃ0.01c88.78ʃ1.31c1.000.90ʃ0.01d86.37ʃ0.49c1.500.33ʃ0.01e31.98ʃ0.54d2.000.20ʃ0.00f19.48ʃ0.02e ㊀㊀注:不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)(下同)a-0mmol/L(对照组);b-0.25mmol/L;c-0.5mmol/L;d-0.75mmol/L;e-1mmol/L;f-1.5mmol/L;g-2mmol/L图1㊀不同浓度的FFA对细胞脂滴的影响(ˑ400)Fig.1㊀The effect of different concentration of FFAon the lipid droplets in cells由表1可知,当模型中FFA的浓度分别为0.25㊁0.50和0.75mmol/L时,人肝细胞L-02的存活率较高,均大于88.78%;而随着FFA浓度的不断增加,细胞的存活率随之下降,当FFA浓度大于1mmol/L 时,细胞的存活率显著下降(P<0.05),由1mmol/L时的86.37%分别下降至1.5mmol/L时的31.98%和2mmol/L时的19.48%㊂由图1可知,人肝细胞L-02经油红O染色后,未添加FFA的细胞边缘清晰,核膜完整,细胞内未见红色脂滴;而随着FFA浓度的增加,细胞内脂滴数量呈逐渐增多,且体积呈逐渐增大的趋势㊂当FFA浓度大于1mmol/L时,肉眼可见的细胞数量大幅度减少,细胞形状发生变化,表明当添加的FFA超过一定浓度时,会严重损伤细胞;但当浓度低于1mmol/L时,脂肪变性不充分,脂滴数量较少;当FFA浓度为1mmol/L时,细胞脂肪变性充分,脂滴数量较多,结合细胞存活率的试验结果,选取1mmol/L作为模型中FFA的最佳添加浓度㊂2.2㊀NAFLD细胞模型由表2可知,添加了1mmol/L FFA的模型组人肝细胞L-02培养24h后,细胞内TG含量为5.73 mmol/L,显著高于对照组(P<0.05);同时,培养液中AST含量为113.50U/L,显著高于对照组的73.67U/L(P<0.05),表明1mmol/L的FFA造成了细胞的脂肪变性,与NAFLD大鼠模型特征较为一致[21]㊂表2㊀脂肪变性细胞内TG㊁TC及细胞培养液中AST和ALT的含量(n=3)Table2㊀Content of TG,TC in the steatosis cells and AST,ALT content in the cell culture medium指标TG 含量/(mmol㊃L-1)TC含量/(mmol㊃L-1)AST含量/(U㊃L-1)ALT含量/(U㊃L-1)对照组 2.31ʃ0.15a0.04ʃ0.01a73.67ʃ5.69a5.23ʃ0.58a 模型组 5.73ʃ0.08b0.05ʃ0.01a113.50ʃ8.02b5.44ʃ0.58a由图2可知,对照组人肝细胞L-02的早期凋亡率为1.82%,晚期凋亡率为1.79%,占总体细胞的3.61%;而模型组细胞早期凋亡率为1.88%,晚期凋亡率为2.14%,占总体细胞的4.02%,两组之间的细胞凋亡率差异较小,表明1mmol/L的FFA对细胞未造成严重损伤,与机体单纯性脂肪变性特征相符[22]㊂2.3㊀鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳干预后的大鼠血清对模型中细胞的益生作用2.3.1㊀大鼠血清对细胞脂滴的影响以未干预菌株发酵乳的大鼠血清作为对照组,研究鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳干预后的大鼠血清对NAFLD模型中人肝细胞L-02脂滴的影响,结果如图3所示㊂a-对照组;b-模型组图2㊀脂肪变性对细胞凋亡率的影响Fig.2㊀Effect of steatosis on the apoptosis rate of cellsa-对照组;b-益生菌干预组图3㊀大鼠血清对细胞脂滴的影响(ˑ400) Fig.3㊀Effect of rats serum on the lipid droplets in cells由图3可知,对照组大鼠血清作用脂肪变性的人肝细胞L-0224h后,细胞边缘较为明显,核膜完整,胞内出现红色脂滴且体积较大,出现脂肪变性现象;与对照组相比,干预组大鼠血清作用的细胞内胞浆丰富,胞内红色脂滴数量较少㊁体积较小,表明鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳干预的大鼠血清能有效改善细胞的脂肪变性㊂2.3.2㊀大鼠血清对细胞TG、TC含量及血清培养液中AST和ALT含量的影响鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳干预后的大鼠血清对模型中人肝细胞L-02胞内TG㊁TC含量的影响及血清培养液中AST和ALT的含量见图4和图5㊂由图4可知,干预组的大鼠血清作用于人肝细胞L-02后,细胞内TG 含量为1.95mmol /L,显著低于对照组的2.88mmol /L(P <0.05);TC 含量稍低于对照组,但无显著性差异(P >0.05)㊂图4㊀大鼠血清对细胞TG 和TC 含量的影响(n=3)Fig.4㊀The effect of rats serum on the content of TG and TC in cells图5㊀大鼠血清细胞培养液中AST 和ALT 的含量(n =3)Fig.5㊀The content of AST and ALT in the cell culture mediumof rats serum由图5可知,对照组的人肝细胞L-02培养液中AST 的含量为118.67U /L,干预组的血清细胞培养液中AST 的含量为93.33U /L,显著低于对照组(P <0.05);而ALT 的含量分别为5.59U /L 和5.83U /L,无显著性差异(P >0.05);表明鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵乳可通过降低细胞内TG 和AST 转氨酶的含量来减轻NAFLD 对细胞的损伤㊂2.3.3㊀大鼠血清对细胞凋亡率的影响鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵乳干预后的大鼠血清对人肝细胞L-02凋亡率的影响如图6所示㊂a-对照组;b-益生菌干预组图6㊀大鼠血清对细胞凋亡率的影响Fig.6㊀The effect of rats serum on the apoptosis rate of cells由图6可知,对照组中人肝细胞L-02的早期凋亡率为1.42%,晚期凋亡率为5.04%,正常细胞数量为91.2%;经干预组的大鼠血清作用后,人肝细胞L-02的早期凋亡率为0.89%,晚期凋亡率为2.61%,正常细胞数量高达95.7%㊂与对照组相比,干预组的细胞凋亡率相对下调了2.96%,正常细胞数量相对上调了4.5%,说明鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301发酵乳干预的大鼠血清能够降低人肝细胞L-02的凋亡率,缓解细胞损伤,对NAFLD 具有较好的改善作用㊂3㊀讨论由于人与动物之间生物代谢表达和活性不同[23],使得在动物试验中肝细胞脂肪变性的稳定性较差[14],因此建立一种理想的体外模拟人肝细胞的NAFLD 模型尤为重要㊂棕榈酸是饮食和血清中最丰富的游离脂肪酸,容易引发肝脏的脂肪变性[24-25],而油酸毒性较小,能够抵消棕榈酸对肝细胞的毒性[26],并具有增强棕榈酸酯化和稳定脂滴的能力[27]㊂因此,试验采用油酸和棕榈酸混合的FFA 建立人肝细胞L-02脂肪变性模型㊂当1mmol /L 的FFA 作用于人肝细胞L-02时,对细胞的存活率影响较小,同时还使得细胞内脂滴数量达到最大值,并显著增加了模型中细胞TG 含量及培养液中AST 含量(P <0.05),且细胞的凋亡率与对照组无显著性差异(P >0.05),符合NAFLD的特征指标[21]㊂表明成功建立的NAFLD 细胞模型,具有造模周期短㊁稳定性好等优势[28]㊂鼠李糖乳杆菌可以通过调节肠道微生物来改善机体的NAFLD症状[29]㊂鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳能够通过调节与脂质代谢相关的肠道微生物来改善大鼠血清的脂质代谢[18],而本文的研究还发现,鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳干预后的大鼠血清不仅可以显著降低细胞TG含量,还可以显著降低细胞培养液中AST的含量(P<0.05);CAUSSY 等[30]的研究发现,血清中来自肠道微生物的代谢产物在改善NAFLD症状过程中发挥着重要作用;而双歧杆菌㊁乳杆菌等益生菌可以通过调节机体血清中的脂质㊁转氨酶㊁炎症因子及抗氧化物质等代谢产物来降低NAFLD对机体的损伤[11-13,31]㊂因此,鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳可能是通过调节肠道微生物来改善机体血清中脂质㊁转氨酶等代谢产物,进而发挥其对NAFLD人肝细胞L-02的益生作用㊂益生菌还能通过调节SIRT-1/PGC-1α/SREBP-1㊁Nrf-2/HO-1和PPAR-α等与血脂㊁抗氧化物质及胆汁酸代谢途径相关基因的表达来减轻机体的NAFLD 症状[8,32-33]㊂因此,后续将从肠道微生物-血清的代谢产物及其代谢通路等方面入手,进一步阐明鼠李糖乳杆菌hsryfm1301发酵乳干预的大鼠血清在NAFLD模型中对人肝细胞L-02的益生作用机制㊂参考文献[1]㊀DAY C,SAKSENA S.Non-alcoholic steatohepatitis:Definitions andpathogenesis[J].Journal of Gastroenterology&Hepatology,2003, 17:S377-S384.[2]㊀NOBILI V,ALISI A,MOSCAET A,et al.The antioxidant effects ofhydroxytyrosol and vitamin E on pediatric nonalcoholic fatty liver disease,in a clinical trial:A new treatment?[J].Antioxidants& Redox Signaling,2019,31(2):127-133.[3]㊀BRUINSTROOP E,DALAN R,CAO Y,et al.Low-dose levothyroxinereduces intrahepatic lipid content in patients with type2diabetes mellitus and NAFLD[J].The Journal of Clinical Endocrinology& Metabolism,2018,103(7):2698-2706.[4]㊀SHATTAT F.A review article on hyperlipidemia:Types,treatmentsand new drugtargets[J].Biomedical&Pharmacology Journal,2015, 7(2):399-409.[5]㊀KENNEALLY S,SIER J H,MOORE J B.Efficacy of dietary andphysical activity intervention in non-alcoholic fatty liver disease:A systematic review[J].Proceedings of the Nutrition Society,2017,4: e000139.[6]㊀ZHANG J,ZHAO X,JIANG Y Y,et al.Antioxidant status and gutmicrobiota change in an aging mouse model as influenced by exopo-lysaccharide produced by Lactobacillus plantarum YW11isolated from Tibetan kefir[J].Journal of Dairy Science,2017,100(8): 6025-6041.[7]㊀MORI N,KANO M,MASUOKA N,et al.Effect of probiotic and pre-biotic fermented milk on skin and intestinal conditions in healthy young female students[J].Bioscience of Microbiota Food and Health,2016,35(3):105-112.[8]㊀CHEN Y T,LIN Y C,LIN,J S,et al.Sugary kefir strain Lactobacillusmali APS1ameliorated hepatic steatosis by regulation of SIRT-1/Nrf-2and gut microbiota in rats[J].Molecular Nutrition&Food Re-search,2018,62(8):e1700903.[9]㊀AL-MUZAFAR H M,AMIN K A.Probiotic mixture improves fattyliver disease by virtue of its action on lipid profiles,leptin,and in-flammatory biomarkers[J].BMC Complementary and Alternative Medicine,2017,17:e43.[10]㊀SHIN H S,PARK S Y,LEE D K,et al.Hypocholesterolemic effectof sonication-killed Bifidobacterium longum isolated from healthyadult Koreans in high cholesterol fed rats[J].Archives of Phar-macal Research,2010,33(9):1425-1431.[11]㊀MALAGUARNERA M,VACANTE M,ANTIC T,et al.Bifidobacte-rium longum with fructo-oligosaccharides in patients with non alco-holic steatohepatitis[J].Digestive Diseases&Sciences,2012,57(2):545-553.[12]㊀ALISI A,BEDOGNI G,BAVIERA G,et al.Randomised clinicaltrial:The beneficial effects of VSL#3in obese children with non-al-coholic steatohepatitis[J].Alimentary Pharmacology and Therapeu-tics,2014,39(11):1276-1285.[13]㊀KOBYLIAK N,ABENAVOLI L,MYKHALCHYSHYN G,et al.Amulti-strain probiotic reduces the fatty liver index,cytokines andaminotransferase levels in NAFLD patients:Evidence from a ran-domized clinical trial[J].Journal of Gastrointestinal&Liver Disea-ses Jgld,2018,27(1):41-49.[14]㊀HADI A,MOHAMMADI H,MIRAGHAJANI M,et al.Efficacy ofsynbiotic supplementation in patients with non-alcoholic fatty liverdisease:A systematic review and meta-analysis of clinical trials:Synbiotic supplementation and NAFLD[J].Food Science and Nu-trition,2019,59(15):3341-3357.[15]㊀XIA H G,ZHU X Y,ZHANG X Y,et al.Alpha-naphthoflavone at-tenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2hepatocytes and in high fat diet-fed mice[J].Biomedicine&Phar-macotherapy,2017,118.DOI:10.1016/j.biopha.2019.109287.[16]㊀WARE B R,KHETANI S R.Engineered liver platforms for differentphases of drug development[J].Trends in Biotechnology,2017,35(3):172-183.[17]㊀殷锦锦,唐外姣,曾璐,等.人肝细胞系L-02细胞单纯肝脂肪变性细胞模型的建立与应用[J].南方医科大学学报,2014,34(6):837-842.YIN J J,TANG W J,ZENG L,et al.Establishment of a L-02cellmodel of hepatic steatosis[J].Journal of Southern Medical Univer-sity,2014,34(6):837-842.[18]㊀CHEN D W,YANG Z Q,GU R X,et al.The effect of Lactobacillusrhamnosu s hsryfm1301on the intestinal microbiota of a hyperlipi-demic rat model[J].BMC Complementary and Alternative Medi-cine,2014,14:386-394.[19]㊀WANG B C,ZHU L C,CHEN Q,et al.Primary study on the applica-tion of serum pharmacology in Chinese traditional medicine[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2005,43(3-4):194-197.[20]㊀朱晓莹,李韬,李盛毅,等.肿节风复方含药血清对肝癌HepG2细胞增殖㊁端粒酶及凋亡的影响[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(2):109-112.ZHU X Y,LI T,LI S Y,et al.Effect of serum containing sarcandraecompound on proliferation,telomerase activity and cellular apoptosisof HepG2cells[J].Chinese Journal of Experimental TraditionalMedical Formulae.2014,20(2):109-112.[21]㊀MA L L,YUAN Y Y,ZHAO M,et al.Mori Cortex extract amelioratesnonalcoholic fatty liver disease(NAFLD)and insulin resistance inhigh-fat-diet/streptozotocin induced type2diabetes in rats[J].Chi-nese Journal of Natural Medicines,2018,16(6):411-417. [22]㊀XIE C F,CHEN Z,ZHANG C F,et al.Dihydromyricetin amelio-rates oleic acid-induced lipid accumulation in L02and HepG2cellsby inhibiting lipogenesis and oxidative stress[J].Life Sciences,2016,157(15):131-139.[23]㊀MARTIGNONI M,GROOTHUIS G M M,KANTER R D,et al.Spe-cies differences between mouse,rat,dog,monkey and human CYP-mediated drug metabolism,inhibition and induction[J].Expert O-pinion on Drug Metabolism&Toxicology,2007,2(6):875-894.[24]㊀LIRUSSI F,MASTROPASQUA E,ORANDO S,et a1.Probiotics fornonalcoholic fatty liver disease and/or steatohepatitis[J].CochraneDatabase of Systematic Reviews,2007,24(1):51-65. [25]㊀CAO J,FENG X X,YAO L,et al.Saturated free fatty acid sodiumpalmitate-induced lipoapoptosis by targeting glycogen synthase ki-nase-3βactivation in human liver cells[J].Digestive Diseases andSciences,2014,59(2):346-357.[26]㊀WEI Y R,WANG D,PAGLIASSOTTI M J,et al.Saturated fattyacids induce endoplasmic reticulum stress and apoptosis independ-ently of ceramide in liver cells[J].AmericanJournal of PhysiologyEndocrinology and Metabolism,2006,291(2):275-281.[27]㊀MORAVCOV A,CERVINKOV Z,KUCERA O,et al.The effect ofoleic and palmitic acid on induction of steatosis and cytotoxicity onrat hepatocytes in primary culture[J].Physiological Research,2015,64(5):627-636.[28]㊀ANGELICO F,DELBEN M,CONTI R,et al.Insulin resistance,themetabolic syndrome,and non-alcoholic fatty liver disease[J].Journalof Clinical Endocrinology&Metabolism,2005,90(3):1578-1582.[29]㊀RITZE Y,BARDOS G,CLAUS A,et ctobacillus rhamnosusGG protects against non-alcoholic fatty liver disease in mice[J].PLoS ONE,2014,9(1):e80169.[30]㊀CAUSSY C,HSU C,LO M T,et al.Link between gut-microbiomederived metabolite and shared gene-effects with hepatic steatosisand fibrosis in NAFLD[J].Hepatology,2018,68(3):918-932.[31]㊀PARK E J,LEE Y S,KIM S M,et al.Beneficial effects of Lactoba-cillus plantarum strains on non-alcoholic fatty liver disease in highfat/high fructose diet-fed rats[J].Nutrients,2020,12(2).DOI:10.3390/nu12020542.[32]㊀ZHANG Z,ZHOU H,ZHOU X H,et ctobacillus casei YRL577ameliorates markers of non-alcoholic fatty liver and alters expressionof genes within the intestinal bile acid pathway[J].British Journalof Nutrition,2020,28:1-9.[33]㊀KIM D H,JEONG D,KANG I B,et al.Dual function of Lactobacil-lus kefiri DH5in preventing high-fat-diet-induced obesity:Directreduction of cholesterol and upregulation of PPAR-αin adipose tis-sue[J].Molecular Nutrition&Food Research,2017,61(11).DOI:10.1002/mnfr.201700252.Probiotic function of Lactobacillus rhamnosus hsryfm1301fermented milk on human hepatocyte L-02in NAFLD cell modelCHEN Dawei1,LIANG Jiaojiao1,CHENG Yue1,QU Hengxian1,CHEN Chunmeng1, REN Chenyu1,ZHANG Chenchen1,GUAN Chengran1,MA Wenlong1,CHEN Xia1,LI Qiming2,GU Ruixia1∗1(Jiangsu Province Key Lab of Dairy Biotechnology and Safety Control,College of Food Science and Engineering,Yangzhou University;Yangzhou225127,China)2(New Hope Dairy Co.Ltd.,Chengdu610023,China) ABSTRACT㊀A nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD)model of human hepatocytes L-02in vitro was established by free fat acid (FFA),and the beneficial effect of fermented milk of Lactobacillus rhamnosu s hsryfm1301on L-02cells in the model was explored. Free fatty acids(mol ratio,oleic acidʒpalmitic acid=2ʒ1)were used to induce human hepatocytes steatosis,and the model was evalua-ted by the survival rate of cells,the content of total triglyceride(TG),total cholesterol(TC)and lipid droplets in cells,the content of aspartate aminotransferase(AST)and alanine aminotransferase(ALT)in the culture medium of L-02cells,and the apoptosis rate of cells.The effect of rats serum,which was obtained after intervention by fermented milk of L.rhamnosu s hsryfm1301for4weeks,on the L-02cells in the model was discussed.The results showed that the survival rate of L-02cells were all lower than32%when the con-centration of FFA was1.5mmol/L and2mmol/L in the model,which were significantly lower than that without FFA(P<0.05),and the number of L-02cells was reduced obviously and the shape changed.While the survival rate of L-02cells was86.37%when the con-centration was1mmol/L,and the number of lipid droplets was the highest,and the content of TG in the L-02cells and the content of AST in the cell culture medium were significantly higher than that of the control group(P<0.05),which were5.73mmol/L and113.50U/L respectively.The apoptosis rate of L-02cells,the content of TC in the L-02cells and the content of ALT in the cell culture medium had no significant difference(P>0.05).The number of lipid droplets in the L-02cells was reduced,and the content of TG in the L-02cells and the content of AST in the cell culture medium were significantly decreased by the serum of rats that were administered by the fermen-ted milk of L.rhamnosus hsryfm1301when compared with the serum of rats that were not administered(P<0.05),which were1.95 mmol/L and93.33U/L respectively.And the apoptosis rate was decreased by2.96%,the number of normal cells was increased by 4.5%.The NAFLD model of human hepatocyte L-02in vitro can be established by1mmol/L FFA.The human hepatocyte L-02in NAFLD model can be improved by the serum of rats that were intervened by the fermented milk of L.rhamnosus hsryfm1301.Key words㊀Lactobacillus rhamnosus hsryfm1301;fermented milk;human hepatocyte L-02;free fatty acids;nonalcoholic fatty liver disease。

鼠李糖乳杆菌促生长因子的研究关海滨，罗素琴，包小妹，董至恒，刘乐乐(内蒙古医科大学药学院，内蒙古呼和浩特010110)摘要：目的：鼠李糖乳杆菌的研究备受全球瞩目，本研究摸索了鼠李糖乳杆菌液态发酵促生长因子的种类和加入方法。

方法：以鼠李糖乳杆菌为实验用发酵菌株，以MRS培养基为基础培养基，以发酵液活菌数为考察指标，选择121ħ高压灭菌和直径为0．22μm的微孔滤膜过滤两种灭菌方式，逐一添加17种促生长因子。

结果：促生长因子以过滤方式灭菌适宜其发挥作用，筛选出核黄素、泛酸、维生素B12三种促生长因子，其发酵液活菌数与对照组相比分别提高了36．33%、65．17%、95．88%。

关键词：鼠李糖乳杆菌;促生长因子;益生菌中图分类号：R975文献标识码：B文章编号：2095－512X（2013）01－0042－05鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）简称为LGG，属于第三代益生菌，它是目前世界上最著名、研究最多的菌株之一［1］。

有关研究表明，它与其它一些益生菌具有相似的作用，如：维持肠道菌群正常平衡、治疗腹泻［2，3］，溃疡［4］等疾病、降血压［5］和免疫调节［6］等。

LGG较其它大部分益生菌的优势主要表现在突出的耐胃酸和胆汁方面的性能，长时间定殖于人体内以及在奶制品中的较强稳定性［7］。

LGG的相关产品涉及酸奶、牛奶、奶酪、饮料、酸乳酒等［8］，40多个国家和地区有LGG 产品。

促生长因子是一类对微生物正常代谢必不可少，且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。

多数真菌、放线菌和细菌不需要外界提供促生长因子，而乳酸细菌、各种动物致病菌、原生动物和支原体等一般都需要外界提供促生长因子，如一般的乳酸菌都需要多种维生素、不同的嘌呤和嘧啶碱基［9］，流感嗜血杆菌需要卟啉及其衍生物等。

促生长因子在益生菌中的研究已有报道［10］，本文通过对鼠李糖乳杆菌促生长因子的研究，为相关研究提供参考。