结核分枝杆菌最新检测技术

ELIspot技术检测结核分枝杆菌感染检测原理检测原理是：机体感染结核分枝杆菌后，存在于血液中的特异性效应T淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌特异抗原时，产生和分泌IFN-γ，通过检测能够释放IFN-γ的T淋巴细胞数量，用于结核分枝杆菌感染及结核病的辅助诊断。

该检测方法相对于结核菌素试验，具有更高的特异性。

由于结核菌素试验中用的结核菌素是从结核分枝杆菌中提取的非种属特异的性分子，因此存在与卡介苗（BCG）的交叉，接种过BCG的人群即使没有感染结核也可能会出现结核菌素试验阳性。

而ELIspot检测所用的结核分枝杆菌特异抗原与BCG抗原无交叉，不受BCG接种的影响，未接种BCG和接种BCG的人群均可用该法进行结核病感染的筛查和结核病的辅助诊断。

目前应用的ELIspot检测试剂盒是由英国Oxford Immunotec公司生产的T-SPOT®TB试剂盒。

其检测方法如下：1.抗体包被将适量人IFN-γ抗体预先包被于96孔ELIspot板上。

2.标本采集及准备采集8小时内的肝素抗凝血，用Ficol离心分离外周血单核细胞（PBMC），用细胞培养液洗涤2次后，重悬于细胞培养液中。

3.细胞计数及稀释用台盼蓝染色计数法对PBMC细胞悬液计数，将细胞悬液浓度调整至2.5×105个细胞/100μl。

4.抗原刺激及孵育每个待检样本均需设阳性对照孔、阴性对照孔和检测孔。

阳性对照孔加入植物血凝素（PHA）作为阳性刺激抗原，阴性对照孔不加任何抗原刺激，检测孔加入结核特异性抗原。

若有几个特异性抗原进行分别刺激，检测孔可根据需要设置多个孔。

向阳性、阴性对照孔及检测孔内各加入100μl的PBMC细胞悬液，将ELIspot板置于37℃5%CO2培养箱内静置孵育16～20小时。

孵育期间不能移动ELIspot板，必须保证板静置不动。

5.斑点显色及计数弃除板内的细胞培养液，每孔加入200μl的PBS缓冲液洗涤3～5次，弃净板内的液体，向每孔加入100μl稀释好的生物素标记抗体，37℃孵育1小时。

结核分枝杆菌的鉴定要点结核分枝杆菌是一种引起结核病的病原体，它有着很高的致病性和感染性。

为了正确认识和鉴定结核分枝杆菌，以下是一些重要的鉴定要点：1. 镜检-结核分枝杆菌可以通过显微镜下观察到。

使用酸性染色法，如抗酸染色和荧光染色可以使细菌显现出红色（抗酸染色）或绿色（荧光染色）。

2. 培养-分枝杆菌在固体或液体培养基上生长缓慢，通常需要2-6周的时间才能形成可见的菌落。

固体培养基上的菌落呈干燥而扁平的形态，有橘黄色的色素。

液体培养基上的培养物通常呈黄绿色或橙黄色。

培养时应该注意对临床样本进行适当的稀释以避免过多的其他细菌的干扰。

3. 生化鉴定-利用一系列特殊的生化试剂，可以鉴定结核分枝杆菌的生化反应。

这些试剂包括硝基硝酸盐、尼龙红、呋喃四羧酸等。

结核分枝杆菌在这些试剂的作用下具有独特的反应形式，可以通过观察颜色变化或者气体产生等判断。

4. 分子生物学鉴定-利用PCR（聚合酶链式反应）及其变体技术，可以对结核分枝杆菌的特定基因进行检测和鉴定。

这些特定基因包括IS6110序列和16S rRNA基因等。

分子生物学鉴定方法通过特定的引物和核酸杂交可以迅速、准确地确认分枝杆菌的存在。

5. 药敏试验-由于结核分枝杆菌对抗结核药物的敏感性存在变异，药敏试验可以帮助确定分枝杆菌的抗药性。

该试验通过将分枝杆菌分离株培养在含有不同抗结核药物浓度的培养基上，观察菌落的生长情况，从而确定其对抗结核药物的敏感性。

总之，结核分枝杆菌的鉴定是一项复杂而关键的工作。

通过镜检、培养、生化鉴定、分子生物学鉴定和药敏试验等多种方法的综合应用，可以准确、快速地确定结核分枝杆菌的存在及其特性，为结核病的诊断和治疗提供有力的依据。

《结核分枝杆菌和人类免疫缺陷病毒感染双向筛查技术应用专家共识》（2024）要点1 TB/HIV双向筛查技术手段1.1 在HIV感染者/AIDS患者中开展活动性TB/结核感染筛查目前WHO推荐用于HIV感染者/AIDS患者活动性TB筛查的方法有TB症状筛查、CXR、C-反应蛋白（CRP）检查、尿脂阿拉伯甘露聚糖抗原侧流（LF-LAM）免疫检测以及MTB 分子快速诊断方法。

我国工作实施方案中还要求对于HIV感染者/AIDS患者定期进行TB 病原学检查。

1.1.1 TB症状筛查我国对于感染HIV病毒的人群（PLHIV）的TB症状筛查主要基于门诊随访时的问卷调查，筛查症状包括：咳嗽、咳痰持续2周以上；痰中带血、反复发热持续2周以上；反复夜间出汗、无法解释的体重明显下降、经常容易疲劳或呼吸短促、淋巴结肿大。

1.1.2 胸部影像学检查胸部影像学检查是筛查、诊断或排除活动性肺结核的重要手段之一。

胸部影像学检查包括CXR、胸部CT断层扫描等，是普及性较广的一种检测手段。

1.1.3 TB细菌学检查TB细菌学检查是诊断活动性肺结核的重要检测方法，主要包括痰涂片和痰培养，临床上广泛用于一般人群肺结核的诊断和鉴别诊断。

目前尚无其他检测手段能代替痰培养作为TB实验室确诊的“金标准”。

1.1.4 快速分子生物学检查随着核酸检测技术的迅速发展，快速分子生物学检测已广泛应用于TB诊断，国外研究显示其在HIV感染者/AIDS患者中开展结核筛查也具有较高的灵敏度和特异度。

1.1.5 CRP检查CRP是一种非特异性的炎性标志物，与机体的感染或应激状态相关。

CRP检测简便、价廉、易操作，是POCT的常用项目，普及性高。

1.1.6 LF-LAM免疫检测我国尚未引进该项技术。

1.1.7 结核感染检查WHO和我国推荐用于HIV感染者/AIDS患者LTBI筛查的方法有结核菌素皮肤试验（TST）、γ-干扰素释放试验（IGRA）和基于结核分枝杆菌抗原的皮肤试验（TBST）。

三、结核分枝杆菌抗体检测
结核分枝杆菌抗体检测
采用痰涂片查抗酸杆菌、血清检测结核分枝杆菌抗体、X线胸片摄影三种方法，同时对108例确诊为肺结核的病人 进行检测、结果分析。
病毒类药物急诊临床应用指导意见
结核分枝杆菌抗体检测
1.胶体金法检测的结核分枝杆菌抗体及 X 线胸片阳 性率分别为 72.2%和 77.8%，均高于痰涂片 的阳性率 42.6%，经卡方检验结果表明，前两法显著优于后者（P＜0.05），其中在46例痰涂片 阳性标本中结核分枝杆菌抗体阳性数为42例，阳性率为91.3%，而在62例痰涂片阴性标本中结 核分枝杆菌抗体阳性数为36，阳性率为58.1%，说明痰涂片阳性病人受损较大，病变较重， 抗 体产生早而多。 2.在胶体金法检测结核分枝杆菌抗体与 X 线胸片检查，经卡方检验结果表明无显著性差异 （P>0.05），由于检测结核分枝杆菌抗体标本是血清，反映全身机体免疫状况，且预防及治疗 上与效价成 反比，能够诊断肺外结核，具有与X胸片相同的临床应用价值。
张莺莺,周贝贝,王晴. γ-干扰素释放实验在结核病诊断中的临床应用[J]. 皖南医 学院学报,2017,36(2):121-124,127. DOI:10.3969/j.issn.10020217.2017.02.006.
IRGA在LTBI的诊断及应用
LTBI是指机体感染MTB后，对其抗原刺激产生持续性免疫应答反应但没有发生结核病临床表现和影像
抗结核新药和新治疗方案使用新药 Nhomakorabea使用方法
MDR_TB治疗的抗结核新药 BEAT-TBⅢ期临床试验
贝达喹啉、德拉马尼、普托马尼
HIV感染、类风湿性关节炎或其他全身性炎症性免疫介导 的疾病治疗、使用生物或非生物改良制剂、皮质类固醇等 情况而影响免疫学检测结果，可考虑同时使用 IGRA 和 TST以提高检测的敏感度，任何一个检测阳性均判定为感 染状态。