结核分枝杆菌实验室检测方法

结核病的实验室诊断方法及评价耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。

耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。

因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。

1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。

其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。

2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。

3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。

基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。

多种以PCR 为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。

这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。

由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。

肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测的金标准是基于培养和鉴定结核分枝杆菌。

以下是具体步骤：
1.痰液样本收集：患者需要提供早晨醒来时的深咳痰液样本，
以获得有效的细菌数量。

2.痰液预处理：痰液样本经过预处理，包括离心和去除杂质。

这一步通常包括液体化和浓缩痰液。

3.痰液培养：将预处理后的痰液接种到培养基上，通常是液体
培养基。

培养基中的结核分枝杆菌将逐渐增殖形成菌落。

4.鉴定：通过常规培养、染色和生化试验等方法，鉴定已培养
的菌落是否为结核分枝杆菌。

5.药敏试验：对已鉴定的结核分枝杆菌进行药敏试验，以确定
哪些药物对其具有抗菌作用，从而为治疗方案的选择提供依据。

此方法被认为是金标准，因为它能够准确检测到结核分枝杆菌，并且可以确定其对药物的敏感性，为结核病的诊断和治疗提供可靠的结果。

但是，该方法需要相对较长的时间（通常需要几周）来进行培养和鉴定，因此在临床实践中可能需要其他更快速的检测方法来尽早确诊结核病。

三种肺结核实验室诊断方法评估发布时间：2023-02-24T03:39:06.796Z 来源：《医师在线》2022年32期作者：赵静2 田敏敏1 邓淑文1 李金方3 赵蓉芬1*[导读] 目的阐明LAMP技术联合痰涂片和培养检测在肺结核确诊诊断的价值，为制定和完善本区肺结核的防控指南提供依据.方法收集送检疑似肺结核患者痰标本563份，进行直接涂片镜检、固体培养和环介导恒温扩增检测（LAMP）检测。

赵静2 田敏敏1 邓淑文1 李金方3 赵蓉芬1*1苏州高新区人民医院检验科江苏苏州 2151292苏州市第五人民医院临床检验中心江苏苏州2151313苏州高新区疾病预防控制中心疾控科江苏苏州215011【摘要】：目的阐明LAMP技术联合痰涂片和培养检测在肺结核确诊诊断的价值，为制定和完善本区肺结核的防控指南提供依据.方法收集送检疑似肺结核患者痰标本563份，进行直接涂片镜检、固体培养和环介导恒温扩增检测（LAMP）检测。

结果检测563份结核门诊送检痰标本中，257份来自临床诊断肺结核病例痰标本，三种检测方法阳性率由高到低依次为：分子检测LAMP阳性率最高（53.7%），培养阳性率次之（47.5%），直接涂片阳性率最低（15.2%）；35例临床诊断肺结核患者三种方法检测同时阳性，占13.6%，培养和LAMP检测同时阳性率64例，最高（24.9%）；306份临床诊断非肺结核病例痰标本，272例三种检测方法检测未检到结核分枝杆菌，实验室检查阴性率占88.9%，假阳性率由高到低分别为LAMP检测5%，培养4.2%，涂片1%。

结论 LAMP（环介导恒温扩增）技术可以作为培养方法的替代技术，帮助临床医生早期诊断，确诊肺结核，并进行抗结核治疗。

【关键词】肺结核；涂片；固体培养；lamp2020 年苏州高新区发病率为 49.13/10 万，肺结核仍居苏州市法定报告甲、乙类传染病首位，防控形势仍旧严峻。

急需快速、准确、简便的诊断技术和预防结核病感染新疫苗、新药品的出现［1］。

一、实验目的1. 了解结核分枝杆菌的生物学特性及致病机理；2. 掌握结核分枝杆菌的培养、分离、鉴定及检测方法；3. 增强实验室操作技能，提高对结核病的防控能力。

二、实验原理结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种革兰氏阳性细菌，是引起结核病的病原体。

本实验通过培养、分离、鉴定及检测结核分枝杆菌，了解其生物学特性及致病机理。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）结核分枝杆菌菌种；（2）牛肉浸液；（3）鸡蛋；（4）石炭酸复红染液；（5）无菌生理盐水；（6）无菌试管；（7）酒精灯；（8）高压蒸汽灭菌器；（9）显微镜；（10）生物安全柜。

2. 实验仪器：（1）恒温培养箱；（2）电热恒温水浴锅；（3）无菌操作台；（4）超净工作台；（5）显微镜。

四、实验方法与步骤1. 菌种复苏（1）将冷冻保存的结核分枝杆菌菌种复苏于牛肉浸液中，37℃恒温培养24小时；（2）观察菌落生长情况，记录结果。

2. 分离纯化（1）将复苏后的菌液涂布于牛肉浸液琼脂平板上，37℃恒温培养24小时；（2）挑取单菌落进行纯化，重复涂布、培养，直至获得纯化菌落。

3. 鉴定（1）挑取纯化菌落，用无菌生理盐水洗涤，制成菌悬液；（2）将菌悬液滴加于石炭酸复红染液中，37℃恒温染色30分钟；（3）用无菌生理盐水冲洗，观察菌体形态及染色特性；（4）挑取染色阳性菌落，进行生化试验，如氧化酶试验、触酶试验等，以鉴定结核分枝杆菌。

4. 检测（1）挑取纯化菌落，制成菌悬液；（2）将菌悬液滴加于含有药物的琼脂平板上，37℃恒温培养24小时；（3）观察药物对菌落的抑制作用，判断药物对结核分枝杆菌的敏感性。

五、实验结果与分析1. 菌种复苏：复苏后的菌落呈白色，表面光滑，呈干燥状，有明显的溶血现象。

2. 分离纯化：纯化后的菌落呈白色，表面光滑，呈干燥状，有明显的溶血现象。

3. 鉴定：挑取染色阳性菌落，进行生化试验，结果显示氧化酶试验、触酶试验均为阳性，符合结核分枝杆菌的生物学特性。

1．结核分枝杆菌鉴定方法1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。

1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。

目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。

1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。

扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。

目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。

目前在国内区县级应用评估。

1.4 夹层杯结核病诊断方法将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。

直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。

夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。

夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。

1.5 环介导等温扩增方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。

同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。

2．结核分枝杆菌培养方法2.1 固体培养培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。

虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。

2.2 液体培养液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。

结核病实验室检测流程标准结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，其传染性强，严重威胁人类健康。

为了及时发现和诊断结核病，实验室检测是必不可少的一环。

本文将从标本采集、实验室检测和结果判读三个方面，介绍结核病实验室检测流程标准。

一、标本采集结核病的标本采集是实验室检测的第一步，其质量直接影响后续检测结果的准确性。

标本采集应在严格的无菌条件下进行，采集的标本应包括痰液、胸腔积液、尿液、脑脊液等。

在采集痰液时，应让患者深呼吸数次，然后咳出痰液，避免口腔分泌物的污染。

采集胸腔积液时，应在穿刺前进行消毒，并在穿刺后立即将标本送至实验室。

采集尿液时，应让患者在清晨第一次排尿时采集，避免尿液的稀释。

采集脑脊液时，应在穿刺前进行消毒，并在穿刺后立即将标本送至实验室。

二、实验室检测结核病的实验室检测主要包括涂片法、培养法、PCR法等。

涂片法是最常用的检测方法，其操作简单、快速，但灵敏度较低。

培养法是检测结核分枝杆菌的“金标准”，其灵敏度高，但需要较长的培养时间。

PCR法是一种新兴的检测方法，其灵敏度高、特异性强，但需要较高的技术水平和设备支持。

实验室检测应在严格的无菌条件下进行，避免标本污染和交叉感染。

检测结果应及时记录和报告，确保患者能够及时接受治疗。

三、结果判读结核病的实验室检测结果应根据临床表现和其他检查结果进行综合判读。

涂片法和PCR法的阳性结果可以初步诊断结核病，但需要进一步的确认。

培养法的阳性结果可以确诊结核病，但需要排除其他细菌感染。

实验室检测结果应及时通知临床医生，以便制定合理的治疗方案。

综上所述，结核病实验室检测流程标准包括标本采集、实验室检测和结果判读三个方面。

标本采集应在严格的无菌条件下进行，实验室检测应遵循相应的操作规范，结果判读应综合考虑临床表现和其他检查结果。

只有严格按照标准操作，才能确保结核病的及时发现和诊断，保障人民群众的健康。

结核分枝杆菌常见临床实验室检测方法的临床带教总结
张战锋;庞志宇;谢在春;陈久凯
【期刊名称】《医学检验与临床》
【年(卷),期】2022(33)3
【摘要】结核病是严重危害人类健康的慢性传染病,本病起病隐匿,临床症状不典型,实验室和影像学检测是诊断该疾病的重要手段。

实验室对该病的检测方法较多,在实际临床带教过程中,这些方法往往不是在一个专业组甚至不是一个时间段内学习,并且带教老师在临床带教过程中容易忽视同一项目、不同检测方法间的比较,因此学生在学习过程中并不能够很好掌握不同检测方法的特点。

对此,本文根据实验室目前常用的结核分枝杆菌检测方法,对临床带教方法进行探讨,为临床教学质量提供保障。

【总页数】3页(P82-84)
【关键词】结核菌;临床带教;教学;检测方法
【作者】张战锋;庞志宇;谢在春;陈久凯
【作者单位】广州中医药大学第一附属医院检验科
【正文语种】中文
【中图分类】R52
【相关文献】
1.结核分枝杆菌临床实验室检测方法研究进展
2.结核分枝杆菌临床实验室检测方法研究进展
3.结核分枝杆菌实验室检测方法的临床研究
4.三种结核分枝杆菌检测方
法在高原地区临床实验室中的应用5.三种结核分枝杆菌检测方法在高原地区临床实验室中的应用
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•240 •结核与肺部疾病杂志 2020 年12 月第1卷第3 期J Tuberc Lung Dis，December 2020, Vol. 1，No. 3•论著.三种检测技术鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的效能评价易俊莉杨新宇张洁田丽丽丁北川武文清【摘要1目的评价对硝基苯甲酸/噻吩-2-竣酸肼（PNB/T C H)生长试验法、结核分枝杆菌抗原（MPB64)检 测法、PCR-荧光探针法在结核分枝杆菌复合群(MTBC)与非结核分枝杆菌(N TM)鉴别中的应用价值。

方法11株 标准菌株包括M T B标准株H37R v及10株N T M标准菌株均来源于国家结核病参比实验室。

238株临床分离株为北京结核病控制研究所2019年1一 12月门诊患者培养阳性冻存菌株，经涂片抗酸染色均为阳性。

应用 PNB/T C H生长试验法、MPB64检测法、PCR-荧光探针法及微阵列基因芯片法对11株标准菌株及238株临床分离 株进行鉴定;以微阵列基因芯片法菌种鉴定结果为参照，评价PNB/T C H生长试验法、MPB64检测法、PCR-荧光探 针法鉴别M T B C与N T M的效能。

结果以微阵列基因芯片法菌种鉴定结果为参照，PNB/T C H生长试验法、MPB64检测法、PGR-荧光探针法检测M T B C的敏感度分别为100_ 0%(206/206)、98. 5%(203/206)、100. 0% (206/206);特异度分别为 96. 9%(31/32)、100. 0%(32/32)、100. 0%(32/32);符合率分别为 99. 6%(237/238)、98. 7%(235/238)、100. 0%(238/238); K冲/« 值分别为 0• 98、0. 95、1.00。

PN B/TC H生长试验法、MPB64 检测法、PCR-荧光探针法检测周期分别为28 d、0. 5 h、0. 5 d，检测平均成本分别为20、40、60元。

结核杆菌试验结果判断方法一、背景介绍结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性、传染性疾病，世界范围内广泛存在。

结核分枝杆菌通过空气飞沫传播，主要侵犯肺部，也可侵犯其他部位。

结核杆菌试验是一种常用的诊断结核病的方法，通过检测患者体内的抗体或结核杆菌成分来判断患者是否感染结核病。

二、结核杆菌试验分类结核杆菌试验主要分为皮内试验和血清学试验两大类。

1. 皮内试验皮内试验又称结核菌素试验或结核菌素皮内试验，是通过注射结核菌素溶液到患者皮下，观察注射部位是否发生变化来判断患者是否感染结核病。

常用的皮内试验方法有结核菌素纯蛋白试验（PPD试验）和结核菌素衍生物试验（Mantoux试验）。

a. 结核菌素纯蛋白试验（PPD试验）PPD试验是最常用的皮内试验方法之一。

在试验中，医生会将结核菌素纯蛋白溶液注射到患者的前臂皮下，然后观察注射部位是否出现红肿反应。

一般来说，注射后48-72小时，如果出现直径大于10毫米的红肿，说明患者对结核菌素有过敏反应，可能感染了结核病。

b. 结核菌素衍生物试验（Mantoux试验）Mantoux试验是另一种常用的皮内试验方法。

它与PPD试验类似，不同之处在于使用的是结核菌素的衍生物。

Mantoux试验的注射剂量较小，观察时间较长，一般为注射后48-72小时至1-2周。

判断标准与PPD试验相似，红肿直径大于10毫米可能表示结核病感染。

2. 血清学试验血清学试验是通过检测患者血液中的抗体或结核杆菌成分来判断患者是否感染结核病。

常用的血清学试验有结核抗体检测、结核抗原检测和结核菌DNA检测。

a. 结核抗体检测结核抗体检测是通过检测患者血液中的特定抗体来判断是否感染结核病。

这种方法简单、快速，但在早期感染和免疫力低下时的准确性较低。

b. 结核抗原检测结核抗原检测是通过检测患者血液中的结核菌特异性抗原来判断是否感染结核病。

这种方法可以检测到早期感染，但需要专业的实验室设备和操作技术。

c. 结核菌DNA检测结核菌DNA检测是通过检测患者血液中的结核菌DNA来判断是否感染结核病。

结核药敏试验（Tuberculosis Drug Sensitivity Testing）是用来确定结核分枝杆菌对各种抗结核药物的敏感性的一种实验室检测方法。

这种测试对于指导临床医生选择有效的治疗方法至关重要，因为如果结核分枝杆菌对某些药物产生耐药性，将需要调整治疗方案。

世界卫生组织（WHO）和各国卫生部门都制定了结核药敏试验的标准和指南，以确保测试的准确性和一致性。

以下是一些基本的标准和要求：
1. 测试方法：WHO推荐使用的药敏试验方法包括液体培养基中的比例法（Proportional Method）和绝对浓度法（Absolute Concentration Method）。

2. 药物覆盖：药敏试验应涵盖以下抗结核药物：异烟肼（Isoniazid）、利福平（Rifampicin）、乙胺丁醇（Ethambutol）、氧氟沙星（Ofloxacin）、克拉霉素（Clarithromycin）、阿米卡星（Amikacin）、链霉素（Streptomycin）和卡那霉素（Kanamycin）。

3. 质量控制：为了确保测试结果的准确性，应定期进行质量控制，包括使用已知药敏谱的参考菌株进行比对测试。

4. 结果报告：药敏试验的结果应该清晰、准确地报告，通常包括敏感（S）、中介（I）、耐药（R）以及其他可能的分类，如部分敏感（PS）或剂量依赖性敏感（DDS）。

5. 结果解释：药敏试验的结果需要结合患者的临床情况和治疗历史来解释，有时可能需要专家会诊。

6. 实验室认证：进行药敏试验的实验室应遵守相应的国际和国家级标准，并获得认证。