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猪圆环病毒2型疫苗研究进展王晓军;王国珍【摘要】疫苗免疫接种是防控猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)的主要方式,PCV-2疫苗的研究与开发已成为国内外兽医工作者的关注热点.在国际市场上销售的商品化PCV-2疫苗主要包括亚单位疫苗、嵌合病毒疫苗和灭活疫苗,其中PCV-2灭活疫苗已在我国规模化猪场中广泛使用.综述了近年来国内外各类PCV-2疫苗研究进展及存在的问题,以期为猪圆环病毒病的防制与PCV-2新型疫苗的研发提供参考.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2014(041)023【总页数】5页(P106-110)【关键词】猪圆环病毒2型;传统疫苗;免疫;基因工程疫苗【作者】王晓军;王国珍【作者单位】浙江工业大学化学工程学院,浙江杭州 310014;浙江水利水电学院后勤处,浙江杭州 310018【正文语种】中文【中图分类】S855.3;S852.5+2猪圆环病毒 2 型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）是圆环病毒科的一种无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状、单股DNA 病毒，直径平均为17 nm，是目前发现最小的动物病毒[1]。
猪圆环病毒病（Porcine circoviral disease，PCVD）是由 PCV-2 引起的一系列疾病的总称[2]，主要包括猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）、猪断奶后多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（Porcine dermatitis and nephrophathy syndrome，PDNS）以及繁殖障碍等疾病。
此外，PCV-2 跟新生仔猪的先天性震颤（Congenital tremor，CT）、增生性坏死性间质性肺炎（Proliferative and necrotizing interstitial pneumonia，PNP）等有关。
猪圆环2型3型抗原检测依据国标环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)是造成断奶仔猪多系统衰竭综合症(Postweanig multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，也可导致免疫抑制，引起其它相关疾病的并发和继发感染，给养猪业造成了巨大的经济损失。
疫苗免疫接种是预防PCV-2的主要措施，免疫猪群中仍会存在野毒感染的猪。
要将其从免疫猪群中淘汰，必须要建立能大规模鉴别野毒感染的方法。
本研究的目的就是建立检测PCV-2野毒感染抗体的ELISA方法。
为鉴定PCV-2 ORF3蛋白的抗原性，本实验首先将ORF3基因插入pT7-IRES表达载体，使用体外无细胞蛋白合成系统进行蛋白表达，用PCV-2野毒感染猪的血清对表达蛋白的抗原性进行Western-blot鉴定。
为获得大量的表达蛋白进行纯化和ELISA方法的建立，将其插入pET-28a表达载体构建重组表达质粒，鉴定后进行纯化，随后用其作为包被抗原建立间接ELISA，并对临床野毒感染样品进行了检测。
试验结果表明，PCV-2 ORF3基因被插入pT7-IRES表达载体，构建成功pT7-PCV-2-ORF3表达质粒，使用体外无细胞蛋白合成系统可特异性的表达出ORF3蛋白，在Western-blot试验中，表达蛋白可与PCV-2野毒感染的猪血清进行特异性反应，表明ORF3蛋白和刺激机体产生抗体并与抗体发生特异性反应。
为获得大量的重组表达蛋白进行纯化，又将ORF3基因插入pET-28a原核表达载体成功构建了pET-PCV-2-ORF3原核表达质粒，转化BL21(DE3)大肠杆菌后可高效的诱导表达。
Western-blot试验表明表达蛋白可与6XHis单克隆抗体发生反应，也与野毒感染的猪血清发生反应，但与PCV-2 CAP蛋白重组疫苗免疫小鼠的血清不能发生反应。
将原核表达的ORF3蛋白亲和层析纯化后，作为抗原包被ELISA 板，初步建立了间接ELISA方法，对40份临床阴阳性血清的检测结果表明，其能从26份阳性血清中检出24份为阳性，阳性符合率为92%，具有很高的符合率。
资助项目国家生猪产业技术体系项目（nycytx-009）公益性行业（农业）科研专项（nyhyzx07034）猪圆环病毒2型（WH株）灭活疫苗效力的研究——PCV2在肠、肾的分布变化目录摘要 (I)Abstract (III)缩略语表 (V)第1章文献综述 (1)1.1 PCV的分子生物学特征 (1)1.2 PCV的流行病学现状 (2)1.3 PCV2的相关性疾病 (4)1.3.1断奶仔猪多系统衰竭综合症 (4)1.3.2猪皮炎与肾病综合症 (5)1.3.3猪呼吸道综合征 (6)1.3.4繁殖障碍性疾病 (6)1.3.5肉芽肿性肠炎 (7)1.3.6 渗出性表皮炎 (7)1.3.7新生仔猪先天性震颤 (7)1.4 PCV2的致病机理 (7)1.4.1 PCV2在体内的分布与靶细胞 (7)1.4.2 PCV2与免疫系统的相互作用 (8)1.4.3 PCV2与其它病原的相互作用 (9)1.4.4免疫刺激对PCV2感染的作用 (10)1.5 PCV2检测技术的研究 (10)1.5.1免疫学检测技术 (10)1.5.1.1酶联免疫吸附技术 (11)1.5.1.2免疫组织化学技术 (11)1.5.1.3 间接免疫荧光技术 (11)1.5.2分子生物学检测技术 (12)1.5.2.1 多重PCR技术 (12)1.5.2.2巢式PCR技术 (12)1.5.2.2 原位杂交技术 (13)1.6 PCV2的疫苗研究 (13)1.6.1灭活疫苗 (14)1.6.2弱毒疫苗 (14)i华中农业大学2010届硕士研究生学位论文1.6.3基因工程疫苗 (14)1.6.3.1核酸疫苗 (14)1.6.3.2重组疫苗 (15)1.6.3.3活载体疫苗 (16)第2章本研究的目的和意义 (17)第3章材料与方法 (18)3.1试验设计与总体方案 (18)3.2试验材料 (19)3.2.1试验动物 (19)3.2.2主要药品与试剂 (19)3.2.3主要仪器设备 (20)3.2.4主要溶液的配制 (20)3.3 试验方法 (21)3.3.1样品采集与处理 (21)3.3.2 HE染色 (21)3.3.3 免疫组化（SABC法） (22)3.3.4 TUNEL法 (22)3.3.5 电镜技术 (22)第4章结果与分析 (25)4.1 HE染色 (25)4.2免疫组化 (25)4.3电镜 (26)第5章讨论与结论 (27)5.1 讨论 (27)5.1.1 PCV2（WH株）灭活疫苗对肾的作用效力 (27)5.1.2 PCV2（WH株）灭活疫苗对肠的作用效力 (27)5.1.3 PCV2（WH株）在肾脏、肠道中所引起的凋亡的变化 (28)5.2 结论 (28)5.3 下一步研究计划 (29)5.4 本课题创新之处 (29)参考文献 (30)致谢 (41)附录1 (42)附录2 (48)ii猪圆环病毒2型（WH株）灭活疫苗效力的研究——PCV2在肠、肾的分布变化摘要猪圆环病毒2型（PCV2）感染能够引起包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）在内的多种疾病。
猪圆环病毒基因结构及疫苗研究进展作者：杨大洪来源：《农家致富顾问·下半月》2017年第03期摘要猪圆环病毒在各养猪国家广泛流行，发病猪死亡率10%～30%不等，随着规模化养殖业的不断发展，由PCV-2引起的疫病呈上升趋势，给全世界养猪业带来了巨大的经济损失，同时也给各国科研人员带来了新的挑战和任务。
本文针对对猪圆环病毒及其疫苗进行了论述，以期对猪圆环病毒病的防治起到一定的指导意义。
关键词猪圆环病毒；研究进展猪圆环病毒病是危害全球养猪业的重大经济影响性疾病，也是我国养猪业的三大疾病之一，与猪瘟和猪蓝耳病并称我国养猪业的三座大山[1]。
目前研究中已分离获得2个不同血清型的猪圆环病毒（PCV），并命名为猪圆环病毒1型（PCV-1）和猪圆环病毒2型（PCV-2）。
研究表明，PCV-1对猪无致病性，而PCV-2不仅是断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的病原，而且能够引起多种猪病。
1 猪圆环病毒的基因结构猪圆环病毒粒子为正二十面体对称结构，大小为17-20 nm，无囊膜，PCV2对外界环境的抵抗力较强，在0℃可存活数天，56℃15min不能将其灭活。
PCV1与PCV2基本上没有交叉反应[2]，是迄今为止发现的一种最小的动物病毒。
根据猪圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差异， PCV 被划分为无致病性PCV-1和致病性PCV-2两个基因型。
PCV基因组为单股环状DNA ， PCV-1 基因组全长为1759bp ， PCV-2 基因组全长为1767bp和1768bp ，两者的同源性为68 %～76 %。
PCV-2 基因组共编码11个开放阅读框（ORFs）， ORF1-ORF11 ，ORF1 、ORF5 、ORF7 、ORF10位于病毒DNA链上，ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9、ORF11则由互补链编码，其中ORF1、ORF2是两个最大的阅读框，目前仅发现ORF1、ORF2、ORF3 编码蛋白，还未见有其他蛋白研究[3] 。
猪2型圆环病毒1 病原学2 流行病学3 致病机理4临床症状5 病理变化6 流行现状7 诊断和检测8 综合防治9 综合防治重点难点解析参考文献猪2型圆环病毒（Porcine circovirus type 2, PCV2），是最近二十年来才被发现的一种以小猪断奶后多系统衰弱综合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）和中大猪皮炎肾病综合症（Porcine dermatitis and nephropathys syndrome, PDNS）为主要临床特征的新猪病。
1991年，加拿大率先公开报道了PMWS在该国的存在；1997年，Clark[1]首次经实验证实，PMWS的主要致病原，为PCV2。
在我国，郎洪武等[2]于2000年对来自北京、山东、江西、吉林、河南等7省（市）22个猪群共559份血清作PCV2抗体ELISA检测，结果总阳性率为42.9%，且随着猪年龄增长而升高。
此后，曹胜波等[3]（2001）经DNA序列分析，发现PCV2中国分离株与国外分离株同源性不是特别高，显示PCV2于2001年前就已经在我国存在了较长时间。
病毒经过多年流行，基因系列发生了变异。
约至2001年前后，一些技术力量比较雄厚的规模化猪场尝试采集典型PCV2发病猪病变组织制作PCV2组织灭活苗以预防该病，成效非常显著。
但因愿意接受组织灭活苗这种免疫方法的猪场为数并不多，直到免疫效果确切的PCV2商品疫苗开始在国内大力推广（约2010年前后）并逐渐被养猪生产者接受之前，PCV2一直在对我国养猪产业造成重大危害。
最近几年，随着PCV2商品疫苗免疫的逐渐普及，PCV2的流行有逐渐被控制之势。
在一些疫苗选用得当，并长期坚持对PCV2作免疫预防的猪场，养猪生产水平均取得了突飞猛进的进步！1 病原学猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV），分类学上属于圆环病毒科（Circoviridae）、圆环病毒属（Circovirus）。
猪圆环病毒2型疫苗最新研究进展 猪圆环病毒病是公认的免疫抑制病之一，造成猪场损失惨重，疫苗免疫成了救命的稻草。从2011年猪圆环疫苗上市至今，已有17家圆环产品先后上市，目前，出现严重供大于求的现象，同时，养殖场也面临着幸福的烦恼，大量产品的上市，产品价格可能下降，但是，面对玲琅满目的产品，如何选择疫苗成了养殖场一个重要的课题，针对这些烦恼，本文希望能够为养殖场选择疫苗带来帮助，避免走弯路，为养殖场服务。 1.PCV-2国内外最新流行动态 由PCV-2引发的疾病已成全球流行之势，在加拿大首次报道该病原引起PMWS后[1]，学者通过调查本国包括SPF猪、部分散养猪以及育肥猪发现，猪群中PCV-2血清中抗体普遍存在，但目前该病在加拿大仍然只是散发。在英国和北爱尔兰，猪群血清中PCV-2抗体阳性率分别为86％和92％。美国、法国、丹麦、意大利、西班牙、荷兰、新西兰、日本、韩国、墨西哥等国家也相继报道猪群中存在PMWS。在我国猪群中PCV-2感染情况也不容乐观。2000年郎洪武等[2]在北京、河北、山东、天津、江西、吉林、河南等7省(市)的22个猪群采集了559份血清，用ELISA方法检测PCV-2抗体，其阳性率高达5l％，表明我国猪群中存在PCV-2的感染。王忠田等[3]用PCR方法对我国北京、山东、河北、深圳、山西、天津、广东等省(市)的12个规模化猪场发病猪群进行猪圆环病毒2型感染的流行病学调查，结果表明猪圆环病毒2型感染情况在我国猪群中相当严重。李超等[4]在2010年对安徽省PCV-2流行病学调查，结果表明安徽省14个市(县)的PCV-2抗体阳性率平均为74.36％，表明安徽省猪群中普遍存在着PCV-2的感染。从上述报道表明PCV-2在我国猪群中广泛存在。根据流行病学调查显示，虽然猪群中PCV-2抗体阳性率较高，但很大比例的抗体阳性猪群并不表现出临床症状。PCV-2与其他多种病原混合感染较为严重，调查发现沙门氏菌、大肠杆菌等细菌性病原与PCV-2混合感染率达到了20％[5]。陕西省PCV-2与PRV混合感染率是21.7％[6]。2005年陈义祥等对广西地区197份组织病料检测发现，PCV-2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染占总病料数量的57.73％。2003年王文军等[7]对黑龙江地区PCV-2阳性猪群的病料调查发现，蓝耳病和猪瘟的阳性率也较高。 哈尔滨兽医研究所刘长明[8]在2007年采用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验（IPMA）对来自与黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地的健康猪群480份血清和发病猪群424份血清，抗体阳性率分别为79.2%和91.7%，表明PCV-2在猪群中感染率非常高。 山东农科院畜牧兽医研究所吴家强博士检测结果也证实PCV-2防控比较糟糕，PCV-2，2010年检出率为34.66%（124/357），2011年检出率为25.59%(174/588)；2012年检出率为21.38%(147/683)，圆环病毒病依然严重，但有下降趋势，这个和使用圆环疫苗免疫有关系。 2.PCV-2病毒特点
基因组内存在 11 个潜在 ORFs，即 ORF1-ORF11，其中 ORF1、5、7、10 方向相同,为顺时针方向；ORF2、3、4、6、8、9、11 方向相同，为逆时针方向 PCV-2 全长由 1768 或者 1767 个核苷酸组成，目前出现了新的 1766 个核苷酸的病例[9]。PCV2 基因型内核苷酸序列非常保守，同源核苷酸的同源性大于96%。 3．PCV-2(圆环病毒)毒株流行情况 根据对PCV-2毒株的序列分析结果，将PCV-2病毒分离株分为5个亚型(PCV-2a～PCV-2e),鉴于PCV-2a和PCV-2e都有l768bp的基因组；因此，又把这几个基因型统称为PCV-2a，所以PCV-2a基因型包括PCV-2a、PCV-2e等型；而PCV-2b、PCV-2c和PCV-2d都有l767bp 的基因组，因此，又把这几个基因型统称为PCV-2b，所以，PCV-2b基因型包括PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d等型。随着时间推移，PCV-2基因型也有所变异，通过检测分析，世界范围内主要流行PCV-2亚型已从PCV-2a转化为PCV-2b(Patterson等，2010)，即PCV-2b为主要流行亚型，毒力也最强。Li等(2010)对2001-2009年间报道的136株PCV-2中国株进行了分析，结果表明PCV-2b占127株，PCV-2a占9株，其中2001年中国流行株以PCV-2a为主，以后PCV-2b占绝大部分。 2010年，西北农林科技大学张彦明[10]也得出类似结论：其对1999年～2009年NCBI中登录的556个PCV-2分离株全基因序列进行分析。结果表明，1999年～2002年所登录的PCV-2的优势流行毒株为基因a型(PCV-2a)；从2003年开始基因b型(PCV-2b)逐渐为优势流行毒株，在PCV-2分离株中基因b型所占比例，2004年为95.4％，2007年～2009年均超过76.0％。2003年～2009年国内的PCV-2分离株有287个，其中250个为PCV-2b，37个为PCV-2a，表明PCV-2b是国内猪群中的主要优势毒株。通过建立PCV-2a和PCV2-b PCR检测方法，对70份临床病料的检测显示，PCV-2检出率为34．29％(24／70)，基因型均为PCV-2b，无PCV-2a的检出，表明PCV-2b为检测猪群中的主要优势毒株。 4.疫苗研究进展 目前国内外学者对 PCV-2 疫苗的研究主要是从灭活疫苗、构建嵌合病毒、亚单位疫 苗、重组腺病毒基因工程疫苗以及核酸疫苗等方面进行研究。现在取得新兽药证书的有20家，其中包括外企4家，但在中国注册仅有1家，为勃林格，国内企业有文号的有10家，马上上市的也有10家。合法上市的17家圆环疫苗，不包括通过其它渠道进入中国市场的梅里亚、英特威/先灵葆雅、富道/硕腾3家及易邦的中试产品。这21家圆环病毒疫苗产品表现以下特点： 按生产方式可分：基因工程疫苗和全病毒灭活疫苗 4.1 基因工程疫苗：又可分为基因工程亚单位疫苗和基因嵌合疫苗 由于圆环病毒毒力弱，全病毒培养获得高滴度病毒难度大，部分企业采用原核表达和真核表达的方式，通过蛋白纯化浓缩提高抗原水平。勃林格、英特威/先灵葆雅为昆虫杆状病毒表达的基因工程亚单位疫苗，用PCV-2的ORF2基因（Cap蛋白）插入到昆虫杆状病毒，用昆虫细胞培养，获得重组的PCV-2 Cap蛋白，制备亚单位疫苗。而易邦采用PCV-2的ORF2基因（Cap蛋白）插入大肠杆菌原核载体中去，利用大肠杆菌表达PCV-2 Cap蛋白，制备亚单位疫苗，但是原核表达易出现包涵体，包涵体没有活性，需要进行蛋白复性来提高疫苗效果，这个也是为什么国外企业采用真核表达的原因。从工艺上讲，勃林格、英特威/先灵葆雅属于哺乳动物细胞真核表达，而易邦属于原核表达，真核表达对工艺要求是远大于原核表达系统，这和国外企业相比还是有一定差距的。富道/硕腾为PCV1-PCV2嵌合疫苗，把PCV-2的ORF2基因（Cap蛋白）替换PCV-1的ORF2基因（Cap蛋白），灭活制备基因嵌合体疫苗。 4.2 全病毒灭活疫苗 4.2 .1生产工艺 由于原核表达与真核表达成本高，而且表达产量有限，对于蛋白纯化要求较高，制约了产品的市场推广。所以更多的是采用全病毒灭活的方式研究疫苗，梅里亚是最早投放市场的全病毒灭活疫苗，但梅里亚圆环疫苗没有在中国注册。关于全病毒灭活疫苗最大的瓶颈在于如何获得高滴度病毒液，所以必须优化工艺，提高滴度，目前，生物制品厂家多采用微载体悬浮培养的方式来获得高滴度病毒（通过悬浮培养GMP验证的车间很少），这就能克服圆环病毒毒力弱带来活力不强的难题。 4.2 .2 毒株 目前市场上主要还是全病毒灭活疫苗，主要毒株：SH株、LG株、DBN-SX07株、WH株、ZJ/c株之分，但从本质上讲，是没有区别的，因为圆环病毒具有致病性的只有圆环2型，而且只有1个血清型，这5个毒株均属于PCV-2b，毒株只能表明分离地点以及天然免疫原性而已，笔者在NCBI上下载了PCV-1、PCV-2a、PCV-2b等参考序列，运用MEGA 4．0进行与疫苗毒株ZJ/C株、WH株、LG株、SH株、DBN-SX07株等序列进行比对，我们清晰的发现：ZJ/C株、WH株处于同一分支；LG株、SH株处于同一分支；DBN-SX07株与LG株、SH株遗传距离更近，这个也与毒株分离早晚有一定关系，LG株、SH株疫苗2011年上市、DBN-SX07株疫苗2012年上市、ZJ/C株、WH株2013年上市，但这5个毒株均处于1个大分支，这也说明他们之间的遗传距离比较近，所以，对于圆环病毒这个产品来讲，依据毒株选择疫苗没有多少实际意义，市场宣传毒株只是炒作的噱头而已，关键还是要病毒含量的高度。
4.2 .3 病毒含量 关于病毒含量，养殖场（户）老板以及技术人员一般对于此项技术参数理解较差，因为病毒含量的表示通常比较抽象，但此项技术指标也是最重要的参数，因此，这里提示各位养殖同仁注意。疫苗的免疫效果与病毒含量成正比，提高疫苗效果最好的方式之一就是增加抗原滴度。目前市场上的疫苗上市时间早晚不一，毒株各异，病毒含量差别也比较大，早期上市的产品病毒含量比较低，但最近上市的无论ZJ/c还是WH株，病毒含量都达到107.0TCID50以上，病毒含量最高的产品甚至是最低产品的63倍。对比各个毒株：病毒含量ZJ/c株＞WH株＞SH株＞LG株=DBN-SX07株。用另一种直观表示方式：ZJ/c株1头份=2头份WH株=20头份SH株=63头份LG株/DBN-SX07株。 猪圆环病毒含量比较表
