当前位置：文档之家 › 白菜核雄性不育系可育和不育花药中Ca2 的分布

白菜核雄性不育系可育和不育花药中Ca2 的分布

  • 格式：pdf
  • 大小：3.80 MB
  • 文档页数：10

615植物生理与分子生物学学报, Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2005, 31 (6): 615-6242005-02-23收到，2005-07-14接受。

国家自然科学基金项目(No. 30570104)资助。

*通讯作者(E-mail: hqtian@; Tel: 0592-2186486)。

白菜核雄性不育系可育和不育花药中Ca 2+的分布谢潮添1,2，杨延红2，邱义兰2，葛丽丽2，田惠桥2*(1集美大学水产学院，厦门361021，2厦门大学生命科学学院，厦门 361005)摘要：研究了白菜(Brassica campestris L . ssp . chinensis Makino)细胞核雄性不育系花药中Ca 2+的分布特征。

在可育花药发育过程中，减数分裂后花药壁细胞中钙颗粒明显增加。

早期小孢子开始积累钙颗粒并特异性地附在小液泡膜上。

小孢子分裂后，大液泡消失过程中又伴随着许多钙颗粒附在小液泡膜上，显示出Ca 2+与花粉中液泡的形成和分解有关。

在不育花药中，最早出现的钙颗粒异常分布是在小孢子母细胞的胼胝质壁中积累了较多的钙颗粒。

然而，在小孢子细胞质中钙颗粒一直很少，也不形成大液泡，最后通过细胞质收缩的方式败育。

这是首次发现Ca 2+参与调控花药发育过程，其异常分布与花粉败育密切相关。

关键词：白菜；花药；雄性不育；Ca 2+中图分类号：Q945白菜(Brassica campestris L . ssp. chinensisMakino)细胞核雄性不育系在白菜杂种优势利用中具有很大的潜力，对其生理生化以及分子生物学方面已做了一些研究(缪颖等2000；曹家树等2001)。

我们对它的花药也做了光学显微镜观察，发现不育花药中花粉的败育发生在小孢子早期，同时绒毡层细胞不能合成油菜植物特有的油脂类物质(谢潮添等2004)。

进一步的超微结构观察发现不育花药在造孢细胞中核仁就有靠边定位的异常现象。

在四分体时期，不育花粉外壁原基的形成明显异常，导致以后小孢子的外壁形成不正常。

小孢子败育过程中绒毡层细胞的超微结构正常，很可能是小孢子的败育使绒毡层细胞不合成脂类物质(谢潮添等2005a)。

这些发现为进一步探索该种白菜雄性不育机理打下了基础。

Ca 2+是植物生长发育过程中不可缺少的元素之一，有许多重要的生理功能。

有关Ca 2+在植物体内生理功能的研究一直是国内外的活跃领域(Bush 1995; Eckardt 2001; Plieth 2001; Yang 和Poovaiah 2003; Scrase-Field 和Knight 2003)。

Ca 2+在植物生长发育过程中在体内特定的时间和空间以特定的分布形式参与调控生物体内的各种生理功能。

花药作为雄性生殖器官，其内部组织和细胞的发育变化非常显著。

Tirlapur 和Willemse (1992)在花药发育过程中发现与膜结合的Ca 2+有一定的分布特征。

Tian 等(1998)在光敏核不育水稻的研究中，首次发现不育花药中的钙沉淀颗粒分布异常，与雄性不育紧密相关。

随后孟祥红等(2000)在光敏胞质不育小麦、利容千等(2001)在水稻红莲-粤泰不育系的研究中都证实了这种相关性。

从Ca 2+在花药发育过程中的分布特征探讨其生理功能和雄性不育机理的关系是一种新思路。

目前已做过的研究材料都是单子叶植物，在水稻和小麦中发现的Ca 2+参与调节花药发育和花粉育性的初步结果是否具有代表性，需要在其他植物尤其是双子叶植物中加以证实。

为此我们应用焦锑酸钾沉淀法研究了白菜核雄性不育系可育和不育花药发育过程中Ca 2+的分布特点，寻找Ca 2+在白菜花药发育过程中的分布特征和不育花药中Ca 2+的异常分布现象，探索雄性不育花药的花粉败育机理。

1　材料与方法实验材料为种植在厦门市农业科学研究所实验基地内、经过多年观察测定获得的稳定的白菜(Brassica campestris L . ssp . chinensis Makino munis Tsen et Lee)细胞核雄性不育系。

其雄性不育特征由一个隐性基因控制，可育株自交的后代中，约有1/4的植株为不育植株，3/4为可育植株。

不育株人工授粉后结实的种子中，又产生1/2的不育株。

在开花前，根据花冠颜色确定不育株和可育株，开花时，从分枝花序上取不同发育时期的花药进行固定处理。

取不育株和可育株不同发育时期的花药迅速61631卷植物生理与分子生物学学报投入到含2.5%戊二醛、1%焦锑酸钾、0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制的前固定液中室温下固定3 h，用含1%焦锑酸钾、0.1 mol/L磷酸缓冲液配置的洗涤液清洗3次，每次30 min，再转入含1%锇酸、1%焦锑酸钾、0.1 mol/L磷酸缓冲液配制的后固定液中在4℃下固定过夜，用相同的洗涤液清洗3次，每次30 min，系列丙酮脱水，Spurr树脂包埋，Leica-UCTR型超薄切片机上进行超薄切片。

切片经醋酸双氧铀染色，JEM-100/CXII型透射电镜观察并拍照。

2　结果2.1　可育花药发育过程中Ca2+的分布小孢子母细胞期的花药药壁已经完全分化，由表皮、药室内壁、中层及绒毡层四层细胞组成。

每个表皮和药室内壁细胞中都含有一个大液泡。

中层细胞很薄。

绒毡层细胞位于药室最内层，细胞体积明显大于其它三层药壁细胞相加的体积。

在小孢子母细胞内没有钙沉淀颗粒，在其胼胝质壁表面上有少数细小的钙颗粒，但胼胝质壁内部没有钙颗粒。

在药壁组织中有一些钙颗粒，主要分布于药壁细胞的胞间隙、液泡内以及绒毡层的径向壁、内切向壁中以及液泡中。

与以后相比，这一时期的花药中钙颗粒很少。

小孢子母细胞减数分裂后形成四分体，四个小孢子排列成四面体形被包裹在共同的胼胝质壁中，小孢子之间也由胼胝质壁分隔(图版I-1)。

四分体细胞的细胞核体积大，位于细胞中央；细胞质浓厚，没有液泡，细胞内含有较多的细胞器，主要是质体和线粒体；在细胞质内和胼胝质壁内仍没有钙颗粒(图版I-2)。

这时期花药壁的表皮和药室内壁细胞仍然高度液泡化，细胞中大液泡占据了大部分空间，细胞质被挤到了细胞边缘。

在这两层细胞中出现了较多的叶绿体、线粒体及淀粉粒。

绒毡层细胞体积继续增大，有时有多个细胞核，细胞质内除大液泡外，开始出现一些小液泡。

此时，绒毡层细胞中的钙颗粒仍不多，主要分布在大液泡中(图版I-3)。

四分体中的四个小孢子随着胼胝质壁的分解彼此分离。

游离小孢子含有一个位于中央的细胞核，细胞器丰富，没有明显的液泡。

此时小孢子外壁原基已形成了一个连续的电子密度较高的外壁内层，在有些区域已开始形成外壁外层，但尚不完全。

在小孢子细胞质内部开始出现一些细小的钙颗粒(图版I-4)。

随着小孢子的继续发育，它的外壁已开始形成外层的基粒棒，上面有一些体积较大的钙颗粒，可能与外壁的形成有关(图版 I-5)。

在药壁结构中，表皮、药室内壁及中层细胞的结构和钙颗粒分布变化不大，在细胞质中含有一些淀粉粒和质体，在细胞间隙中积累了较多的钙颗粒，但细胞质中的钙颗粒不多(图版II-6)。

绒毡层细胞中的大液泡已消失，只有一些小液泡；细胞基质的电子密度减小，细胞器丰富，内质网增多。

此时，绒毡层细胞中的钙颗粒也不多。

随着小孢子的发育，细胞质基质的电子密度进一步降低，出现了一些小液泡，线粒体和质体的结构更加清晰。

细胞中的钙颗粒明显增加，尤其是在细胞核中积累了较多的钙颗粒。

另外在质膜上也特异性地积累了一些钙颗粒，很可能与花粉内壁的合成有关。

在外壁的表面上也积累了一层钙颗粒(图版II-1)。

在药壁各层细胞中，表皮和药室内壁及中层细胞中的钙颗粒明显增加，在这些细胞的细胞质和大液泡中都有较多的钙颗粒，而在细胞壁中由于钙颗粒的增加使细胞壁电子密度大大增加，形成明显的细胞界限。

在绒毡层细胞中，钙颗粒也明显增加，小液泡中也开始有些较大的钙颗粒。

在细胞的径向壁中也因积累了较多的钙颗粒而显现成电子密度较高的黑色界限(图版II-2)。

小孢子发育晚期的一个明显变化就是形成大液泡，细胞核被挤到细胞的一侧，为小孢子的不均等分裂作好准备。

大液泡的形成是通过先形成小液泡，再由小液泡融合的方式而成。

小液泡在最初形成时，在膜上和液泡内都积累了较多的钙颗粒(图版II-3)，显示Ca2+与小液泡的形成密切相关。

小孢子中的Ca2+伴随着发育呈现动态变化：钙颗粒最初出现在细胞质中，在小孢子形成大液泡时，钙颗粒主要分布在细胞质内和大小液泡的膜上。

当大液泡完全形成以后，小孢子细胞质内以及液泡内的钙颗粒均减少(图版II-4)，而细胞核内却出现了较多钙颗粒(图版II-5)，它们的出现可能同小孢子即将进行的不均等有丝分裂有关。

在617 6期谢潮添等: 白菜核雄性不育系可育和不育花药中Ca2+的分布图版I　可育花药发育过程中的钙颗粒分布特征Plate I　The feature of calcium distribution during the development of fertile anthers1: No calcium granule can be seen in callose wall of tetrad in fertile anther. (×3 300) 2: Enlargement of Plate I-1, no calcium granule can be seen in the callose wall between tetrad microspore (M). (×12 700) 3: There are some calcium granules in the large vacuole of tapetal cell (T). (×6 350) 4: A continuous primexine (arrow) has been formed after the release of microspore (M) from tetrad. There are many plastids and mitochondria and some scattered calcium granules in the cytoplasm of microspore. (×10 160) 5: Some big calcium granules on the exine of microspore (M) when it formed bacula, and the number of calcium granules in tapetal cells (T) also increasing. (×6 350) 6: Many calcium granules accumulated in the cellular gap of the cells of anther wall but few ones in the cytoplasm. (×5 080) T: Tapetal cell; Ml: Middle layer; En: Endothecium; Ex: Exothecium. bar=1 µm.植物生理与分子生物学学报61831卷图版II　可育花药发育过程中的钙颗粒分布特征Plate II　The feature of calcium distribution during the development of fertile anthers1: More calcium granules appeared in cytoplasm, especially in nucleus of microspore (M) with its development, some of granules also specially located on exine and intine of pollen wall. (×10 160) 2: Calcium granules also increased in anther wall cells. (×5 080) 3: During the formation of a large vacuole in microspore (M), calcium granules evidently increased in cytoplasm, especially on the membrane of small vacuoles. (×5 080) 4: When a large vacuole formed in a microspore (M), there was still a layer of calcium granules on the membrane of the large vacuole. (×3 430) 5: After microspore (M) formed a large vacuole, the number of calcium granules decreased evidently in its cytoplasm, but increased in nucleus. (×5 080) 6: At the same time, there were still many plastids and mitochondria and there was newly formed endoplasmic reticulum in tapetal cells (T). Many calcium granules were accumulated in its cell wall. (×8 510) T: Tapetal cell; Ml: Middle layer; En: Endothecium. bar=1 µm.619谢潮添等: 白菜核雄性不育系可育和不育花药中Ca2+的分布6期小孢子发育晚期，小孢子的外壁表面以及内壁的内表面上均有较多的钙颗粒。

合集下载

蔬菜育种学试题A答案(2013)

蔬菜育种学试题A答案(2013)

第 1 页 共 2 页陇东学院2012——2013学年第二学期园艺专业 蔬菜育种学 课程终考试卷（A ）参 考 答 案说明：所有答案不求文字对应，但求紧扣试题，要点表达全面、正确！一、填空题（每空1分，共20分）1. 种质资源的利用方式包括 直接利用 、 间接利用 和潜在利用 。

2．雄性不育性的三种遗传类型包括 细胞质不育 、 细胞核不育 和 核质互作不育 。

3．配合力可以分为 一般配合力 和 特殊配合力 。

4. 远缘杂交常见障碍包括 不亲和性 、 难育性 和 难稔性 。

5. 十字花科蔬菜易发生亚种 、 变种和 品种 之间的天然杂交，分属于白菜类、甘蓝类、萝卜的不同类别的品种之间 不易 发生天然杂交。

6. 甘蓝生产杂种一代种子的主要途径是利用 自交不亲和性 和 雄性不育性 。

7. 栽培马铃薯一般为 四 倍体，即2n= 4 X= 48 。

二、名词解释（每小题4分，共16分）1．育种目标与目标性状育种目标：对所要育成的品种的要求。

如高产、优质、抗逆（病、虫、寒、旱、热、湿等）、成熟期、适应特殊需求（机械化、设施化等）等。

目标性状：所要育成的新品种在一定的自然、生产及经济条件下的地区栽培时应具备的一系列优良性状指标。

2．品种、品系与良种品种：是育种的主要对象，同时也是栽培作物的基本单位，具有稳定、整齐、特异的、人们可以直接利用的经济性状，并且具有一定的栽培面积。

品系：是育种过程中表现优良的株系良种：是指在一定时间、一定的地区生产上有发展前途、栽培面积较大的品种。

3.单株选择与混合选择单株选择：从原始群体中选出一些优良单株，分别编号、采种及播种，然后根据各株系的表现，鉴定各亲本单株遗传性的优劣。

混合选择：根据植株的表现性状，从混杂的原始群体中选出符合目标要求的一些优良单株混合留种及播种，并与对照品种及原始群体的小区相邻栽种，进行比较鉴定。

4.甲型两用系与乙型两用系在育种实践中，多通过测交，选育出不育株稳定在50%左右的雄性不育两用系。

雄性不育性及其在杂种优势中的应用

雄性不育性及其在杂种优势中的应用

雄性不育性及其在杂种优势中的应⽤第五节雄性不育性及其在杂种优势中的应⽤尽管利⽤杂种优势已成为提⾼农业⽣产效益的主要途径之⼀，但除了像⽟⽶等少数雌雄异株或雌雄同株异花作物外，在未解决⼈⼯去雄的困难以前，难以在⽣产上⼤⾯积推⼴。

⽽解决这⼀困难的有效途径是利⽤植物的雄性不育性。

⽬前⽔稻、⽟⽶、⾼粱、洋葱、油菜等作物已经利⽤雄性不育性进⾏杂交种⼦的⽣产，并产⽣了巨⼤的经济效益和社会效益。

⼀、雄性不育的类别(⼀)细胞质不育不育由细胞质基因控制，⽽与核基因⽆关。

其特征是所有可育品系给不育系授粉，均能保持不育株的不育性，也就是说找不到恢复系。

这对营养体杂优利⽤的植物育种有重要的意义。

如：Ogura萝⼘细胞质不育系。

(⼆) 核不育不育性是由核基因单独控制的(简称GMS)。

1、⼀对隐性核基因控制的雄性不育性蔬菜不育材料⼤都属于此类。

msms 不育，MsMs或Msms可育，共有三种基因型。

msms与MsMs交配后代全部可育；msms与Msms交配后代可育、不育株1：1分离；Msms⾃交后代可育、不育株按3：1分离。

只有⽤Msms作⽗本与msms不育株测交，可以获得50%的雄性不育株和50%的雄性可育株。

由于在⼀个群体⾥，有50%的可育株⽤于保持不育性。

通常称其为“两⽤系”(ABline)或甲型两⽤系。

将其⽤于杂种⼀代制种，则需要拔除50%的可育株。

因此，隐性核不育后代不能得到固定(100%)的不育类型。

2、⼀对显性基因控制的雄性不育性有杂合的不育株Msms、纯合的可育株两种基因型，纯合不育株（MsMs）理论上存在但实际上⽆法获得。

⽤Msms不育株与msms可育株杂交后代是半不育群体，此种两⽤系也叫⼄型两⽤系。

3、由多个核基因控制的雄性不育中的⼀些组合可育成全不育系。

有核基因互作假说和复等位基因假说(曹书142或景书159)。

(三)核质互作雄性不育(简称CMS) 不育性由核基因(msms)和细胞质基因(S)共同控制的，⼜简称为胞质不育型。

细胞雄性不育的原理

细胞雄性不育的原理

细胞雄性不育的原理细胞雄性不育指的是由于某些原因导致植物在花药发育过程中的细胞分裂和减数分裂异常，造成花粉发育不正常或不完全，从而导致植物无法正常进行有性繁殖。

细胞雄性不育可以通过多种途径实现，包括染色体异常、基因突变、胞质遗传等等。

以下将对细胞雄性不育的原理进行详细阐述。

染色体异常是造成细胞雄性不育的一种主要原因之一。

在花药发育过程中，细胞的染色体在有丝分裂和减数分裂中起到关键作用，包括染色体的分离、配对和交换等。

若染色体出现异常，例如缺失、重组、易位等，将会影响正常染色体的分离和配对，导致花粉发育中的细胞减数分裂过程出现问题，最终导致细胞雄性不育。

染色体异常主要包括结构异常和数量异常，如染色体缺失、重复、易位、多倍体等。

基因突变也是细胞雄性不育的重要原因之一。

在细胞发育过程中，许多基因起着调控花粉发育的重要作用，如花粉母细胞的分裂和减数分裂、花粉壁的合成、孢粉囊的形成等。

若这些基因发生突变，将会直接影响花粉的发育过程，导致细胞雄性不育。

例如，若花粉母细胞减数分裂过程中的某个关键基因发生突变，将会使得染色体无法正常分离和合并，最终导致花粉发育异常，无法形成正常的花粉粒。

胞质遗传也是导致细胞雄性不育的重要原因之一。

植物的细胞核和胞质都参与了细胞雄性不育的调控。

正常情况下，胞质和细胞核之间相互协作，共同调控花粉的发育。

然而，有些植物株系中的胞质与细胞核之间的配对不协调，即所谓的不兼容性，会导致细胞雄性不育。

这种不兼容性可能是由于细胞核中的某些基因与胞质发生冲突或对胞质的调控产生异常反应而引起的。

除了以上几种原因外，环境因素、营养调控和激素调控等也可以对细胞雄性不育起到一定的影响。

一些环境因素，如温度、光照和湿度等，可能会影响细胞分裂和花粉发育过程中的某些关键环节，导致细胞雄性不育。

此外，植物的营养状况和激素调控也与细胞雄性不育相关。

营养元素的供给和平衡将直接影响细胞分裂和花粉发育的进行，而激素的合成和调控则对花粉发育起到重要的调节作用。

雄性不育大白菜小孢子败育与花蕾长度的关系

雄性不育大白菜小孢子败育与花蕾长度的关系

雄性不育大白菜小孢子败育与花蕾长度的关系摘要:以复等位基因遗传的大白菜雄性不育两用系AB01为材料,对蕾长与小孢子发育动态关系进行研究｡形态调查结果发现,花蕾发育到1.75 mm以后时,不育株雄蕊逐渐退化,花药逐渐变黄､干瘪;花蕾长度在1.50~3.00 mm时,不育花药的生长速度极为缓慢,该时期是花粉败育的关键时期;徒手压片结果显示,长度为1.50 mm 的不育花蕾中出现了四分体小孢子解体现象｡在进行核不育基因表达分析研究时,花蕾样品分级标准应为蕾长<1.50 mm､1.50~3.00 mm和>3.00 mm 3个等级或者更加细化｡关键词:大白菜;雄性不育;蕾长;小孢子发育The Relationship between Bud Length and Microspore Abortion in Male-sterility Brassica campestris L. ssp. pekinensisAbstract: Using genic multiple-allele inherited male-sterility in Brassica campestris L. ssp. pekinensis, the two-type line “AB01” as material, the dynamic relationship between bud length and microspore development was studied. The results of morphological observation showed that the stamen of sterile plant degenerated gradually,as well as the anther became yellow and shriveled after the buds length reaches 1.75 mm. The growth rate of sterile anther was very slow in the stage of 1.5-3.0 mm buds, which was the key period of pollen abortion. The results of free-hand sectioning showed that the tetrad microspore was disintegrated in 1.5 mm sterile buds. So buds were devided into three primary stages, stage I(bud length <1.5 mm); stage II (bud length,1.5-3 mm) and stage III (bud length >3mm) or other more stages to study the molecular mechanisms of genic multiple-allele inherited male sterility in Brassica campestris L. ssp. pekinensis.Key words: Brassica campestris L. ssp. pekinensis; male-sterility; bud length; microspores development.大白菜(Brassica rapa L. ssp pekinensis)为两性花异花传粉蔬菜作物,杂种优势十分显著｡由于其花器官小,单花结子少,而单位面积的播种量又较大,雄性不育系的利用是配制大白菜杂交种经济､可靠的制种手段｡AB01是沈阳农业大学蔬菜遗传育种课题组培育的大白菜核基因雄性不育两用系,已用其配制出4个稳定遗传的雄性不育株系[1], 并提出了“大白菜核基因雄性不育复等位基因遗传假说”[2]｡目前沈阳农业大学蔬菜遗传育种课题组已建立了一套该材料的应用技术体系,并实现了品种间和亚种间不育基因的交流,育成了多个新的具有100%不育株率的雄性不育系[3,4],并获得了不育基因Ms的一些分子标记[5,6]｡但是该材料不育的分子机制尚不清楚｡在不育基因时序表达分析研究中,需根据小孢子发育状况把花蕾分成若干等级｡孙日飞等[7]的研究认为大白菜核雄性不育系小孢子败育时期是四分体时期,但实际上小孢子的败育在此之前就已经开始｡植物的雄性不育特性会使雄性不育植株形态发生变化,特别是与生殖有关的花蕾､花瓣､雄蕊､雌蕊等变化较大,许多研究发现,小孢子的发育时期与花蕾形态指标,如花蕾长､花药长及花瓣长/花药长(瓣药比)密切相关｡李丹等[8]表示考虑到花蕾的长度比直径差异大,建议根据花蕾的长度取材｡明确复等位遗传的雄性不育大白菜小孢子败育时期与花蕾长度的关系是不育基因时序表达特性分析首先要解决的问题｡1材料与方法1.1试验材料沈阳农业大学蔬菜遗传育种课题组选育､稳定遗传的大白菜复等位基因型雄性不育两用系AB01,其不育株(MsMs)与可育株(MsfMs)杂交后代1∶1分离,不育株与可育株育性以外的遗传背景相同,是研究基因差异表达的理想材料｡2008年3月,将两用系AB01的种子催芽春化,播种和定植到沈阳农业大学试验基地｡在植株现蕾期取不育株和可育株花蕾进行研究｡1.2试验方法1.2.1花蕊形态学观察方法在解剖镜下取花蕾长度分别为1.50､1.75､2.00､2.25､2.50､2.75､3.00､3.25､3.50 mm的不育株与可育株花蕾在NIKON生物解剖镜下扒蕾拍照,调查不育株与可育株中花蕊的发育情况｡1.2.2花蕊发育的统计学调查在解剖镜下分别测量不育株与可育株不同长度等级花蕾中的雄蕊､雌蕊､花药的长度｡采用随机区组设计,4次重复,每次重复取10棵植株的花蕾按上述标准进行分级,各等级等量混合组成混样,各测量20个花蕾,运用DPS 7.05软件进行统计分析｡1.2.3细胞学观察盛花期9∶00~13∶00从雄性不育两用系AB01不育株与可育株中部取始花花序(花序刚开花1~2 d),并分别在同一花序上连续取不同大小的花蕾10个(根据花蕾形成大小和早晚),然后用卡诺氏固定液固定｡用常规压片法于NIKON生物显微镜下观察花粉母细胞减数分裂和雄配子体的发育并照相｡2结果与分析2.1花蕊发育形态学调查整个花蕾发育过程中,可育株与不育株的雌蕊均呈现稳步增长的趋势,两者之间未见明显差异;而不育株的雄蕊在花蕾发育到后期出现了明显的退化现象,表现为花药颜色发黄､干瘪(图1)｡具体表现为:1.50 mm时,不育株与可育株中雄蕊发育基本一致,形态学观察未见明显区别;当花蕾长度伸长到1.75 mm时,不育与可育花蕾中的花药大小类似,但不育株中花药颜色略为发黄;2.00~2.50 mm时,不育株中花药颜色较可育株中黄,且雄蕊长度明显低于可育株;2.50~3.00 mm时,不育株中花药变得干瘪;3.00~3.50 mm时,不育株中雄蕊出现了萎缩现象,且花药的干瘪程度更加严重｡据此将花蕾按照花药在可育不育花蕾中的发育变化情况初步分为6个等级,即1级(花蕾长度<1.50 mm),稳定发育期;2级(花蕾长度1.50~2.00 mm),不育初期;3级(花蕾长度2.00~2.50 mm);4级(花蕾长度2.50~3.00 mm);5级(花蕾长度3.00~3.50 mm);6级(花蕾长度>3.50 mm)｡2.2花蕊发育的统计学分析为了更清楚地调查雌雄蕊在不育株与可育株中的发育差异,在光学显微镜下测量雌蕊､雄蕊及花药的尺寸,并进行统计分析｡结果发现,可育花蕾中雌蕊､雄蕊和花药都基本在稳步发育｡而不育花蕾中雌蕊的发育与可育花蕾中类似,趋于稳步发展,而雄蕊和花药在不育花蕾中发育非常缓慢,甚至停滞不前｡雌蕊生长变化的统计结果发现(表1),在不育和可育株各等级花蕾中雌蕊均呈现显著增长的趋势｡可见雄性不育的发生对雌蕊的生长发育影响不大｡雄蕊在可育株与不育株不同长度花蕾中的生长变化统计结果显示(表2),雄蕊在可育株中除3级与4级之间无显著差异外,其他等级之间均呈现显著增长的趋势;而在不育株中,虽然也在不断生长,但生长相对缓慢,表现为每相邻两级之间不呈现显著差异｡可见,雄性不育的发生可能与雄蕊发育变化之间有一定的关系｡雄蕊由花丝与花药两部分组成,为了明确雄蕊中影响雄性不育的主要因素,测量了花药的长度并进行统计分析｡结果显示(表3),与可育花药相比,不育花药生长速度更为缓慢,表现为在1~2级发育进程中,可育与不育花药都存在显著生长趋势;2~4级进程中,可育花药显著生长,而不育花药生长极为缓慢,后者统计分析中未见显著差异;5级以上时不育花药开始萎蔫缩短,由此可推断花药发育变化是雄性不育发生的主要因素｡花蕾在1.50~3.00 mm期间是花粉败育的主要时期｡2.3小孢子发育特征对该材料的小孢子发育进程进行细胞学压片观察｡结果显示,不育花药小孢子在四分体时期出现明显的解体现象(图2),而且减数分裂过程非常迅速,表现为同一花药中出现多个时期现象,如可育材料在2.00~2.50 mm的部分花蕾中同时出现了减数分裂的中期Ⅰ､后期Ⅰ､中期Ⅱ､后期Ⅱ及四分体时期(图3),而不育材料中同时出现各时期的现象发生在1.50~2.00 mm的花蕾中｡3小结与讨论Laser等[9]认为被子植物雄性不育系花药败育的形式和时期是多种多样的｡王福青等[10]认为雄性败育从小孢子母细胞至二核花粉粒期皆有发生｡谢潮添等[11]在所用的白菜细胞核雄性不育系中发现不育花药的败育发生在小孢子发育过程中｡而本研究发现大白菜不育两用系AB01不育花药的小孢子在四分体时期出现明显的解体现象,属于上述四分体不能正常发育而败育｡已有研究表明向花粉中正常转运营养物质的过程对花粉的发育非常重要｡夏涛等[12]在研究玉米细胞质雄性不育系的物质代谢时提出了“物质亏损”的概念｡何凤仙等[13]在萝卜雄性不育的细胞学初步观察中发现花药发育大多不正常,开花后花药萎缩空瘪瘦小,淡黄色或白色｡本研究发现当花蕾发育到2.75 mm以上时,花药发生干瘪现象,推测其原因可能是花粉发育到此期间出现明显的营养不足,花粉发育基本停止所致｡为进行大白菜不育两用系AB01的分子机制研究提供大量的时序表达基因,进行花蕾与小孢子动态关系研究,提供该材料的分级标准至关重要｡王永勤等[14]在“白菜小孢子发育相关基因BcMF3的分离及序列分析”时,以“矮脚黄”白菜核隐性雄性不育两用系(A/B Line)的可育株系和不育株系为材料,莲座期取小花蕾､中花蕾和大花蕾(花蕾大小的分级标准是:横径0.50 mm以下为小花蕾;横径1.00~1.50 mm 为中花蕾;横径2.50 mm以上到开花前为大花蕾)进行研究;Song等[15]在研究大白菜花粉专一性基因BcMF11时,根据花粉的发育状况将花蕾按长度分为5个等级(1.0､1.6､2.2､2.8和3.4 mm)｡Park等[16]在研究花粉优先基因BAN103时,所用材料为分别从1.00~5.00 mm长花蕾中收集的花药｡可见每个学者的分级标准各不相同｡本研究发现长度为1.50 mm的不育花蕾中就有四分体时期小孢子解体现象发生,暗示着该材料不育产生的早期阶段应该跟踪到1.50 mm的花蕾｡形态学调查发现,花蕾发育到1.75 mm以后时,不育株的雄蕊逐渐出现了明显的退化现象,花药颜色逐渐发黄､干瘪｡可见复等位遗传的大白菜雄性不育的发生是一渐变的过程｡花蕾长度在1.50~3.00 mm时,不育花药的生长速度较可育花药缓慢｡由此可推断花蕾在1.50~3.00 mm期间是花粉败育的主要时期,在进行复等位基因遗传的核雄性不育分子机制研究时,最基本的分级标准应为:蕾长<1.50 mm;蕾长在1.50~3.00 mm 和蕾长>3.00 mm 3个等级或者更加细化｡实践证明,在大白菜核雄性不育复等位遗传的分子机制研究中,通过花蕾和花药的大小及形态特征的观察进行分级,无需制片镜检,即可有效分离育性相关基因,可避免每次取样时需要制片观察确定小孢子败育时期的繁琐程序,具有方便､快捷的特点,为复等位基因遗传的核雄性不育分子机制研究提供了重要的理论依据｡参考文献:[1] FENG H,WEI Y T,ZHANG S N. Inheritance of and utilization model for genic male sterility in Chinese cabbage (Brassica pekinensis Rupr.)[J].Acta Horticulturae,1995,402:133-140.[2] FENG H,WEI Y T,JI S J. Multiple allele model for genic male sterility in Chinese cabbage [J]. Acta Horticulturae,1996,467:133-142.[3] 岳艳玲,冯辉. 核基因雄性不育在不同生态型大白菜间的转育[J].中国蔬菜,2005(7):22-23.[4] 冯辉,徐巍,王玉刚.…奶白菜AI023‟品系核基因雄性不育系的定向转育[J].园艺学报,2007,34(3):659-664.[5] FENG H, WEI P, PIAO Z Y, et al. SSR and SCAR mapping of a multiple-allele male-sterile gene in Chinese cabbage (Brassica rapa L.)[J]. Theor Appl Genet,2009,119:333-339.[6] WEI P, FENG H, PIAO Z Y, et al. Identification of AFLP markers linked to Ms,a genic multiple allele inherited male-sterile gene in Chinese cabbage[J]. Breeding Science,2009,59(4):333-339.[7] 孙日飞,吴飞燕,司家钢,等.大白菜核雄性不育两用系小孢子发生的细胞形态学研究[J].园艺学报,1995,22(2):153-156.[8] 李丹,李锡香,沈镝.萝卜小孢子不同发育时期的细胞学和花器官形态特征观察[J].中国蔬菜,2008(10):11-15.[9] LASER K D, LERSTEN N R. Anatomy and cytology of microsporogenesis in cytoplasmic male sterile angiosperms[J]. Botany Review,1972,38:425-454.[10] 王福青,王翠兰,宋再华.大白菜雄性不育系88-3花药和花粉发育的细胞形态学观察[J].西北植物学报,2001,21(3):570-574.[11] 谢潮添,杨延红,朱学艺,等.白菜细胞核雄性不育花药的细胞化学观察[J].实验生物学报,2004,37(4):295-302.[12] 夏涛,刘纪麟,瞿波.玉米同核异质雄性不育系花药发育的超微结构研究[J]. 华中农业大学学报,1993,12(3):221-224.[13] 何凤仙, 张朝成, 黄燕文,等. 萝卜39A雄性不育的细胞学初步观察[J]. 湖北农业科学, 1981(2):28-30.[14] 王永勤,余小林,曹家树.白菜小孢子发育相关基因BcMF3 的分离及序列分析[J].遗传学报,2004,31(11):1302-1308.[15] SONG J H,CAO J S,YU X L, et al. BcMF11, a putative pollen-specific non-coding RNA from Brassica campestris ssp.Chinensis[J]. Journal of Plant Physiology, 2007, 164(8) :1097-1100.[16] PARK B S,PARK Y D, KIM H U, et al. BAN103, a pollen-preferential gene, from Chinese cabbage and its promoter activity[J]. Molecular Cells,2002,14:150-157.。