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RNA干扰及其在动物传染病方面的研究概况

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动物医学进展，２０１２，３３（６）：１３０－１３４

Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ

ＲＮＡ干扰及其在动物传染病方面的研究概况

　收稿日期：２０１２－０５－０２

基金项目：国家自然科学基金项目（３０９６０２８５）；兽医生物技术国家重点实验室开放课题基金项目（ＳＫＬＶＢＦ２０１２０３）

　作者简介：杨亮宇（１９６９－），男，云南剑川人，硕士，副教授，主要从事临床兽医学研究。＊通讯作者

杨亮宇１，孙永科１，２，杨玉艾１，王　凯１，王玉娥２，孔令富１＊

（１．云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明６５０２０１；２．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨１５０００１）

摘　要：ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是一种沉默靶基因活动的过程，可以实现对特定的ｍＲ－ＮＡ的选择性降解，进而抑制其翻译过程。论文介绍了ＲＮＡｉ的发现、作用机理、作用特点及其在猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、禽流感、新城疫、狂犬病等动物传染病方面的研究概况。

关键词：ＲＮＡｉ；ｍＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ

中图分类号：Ｓ８５２．２；Ｓ８５２．６文献标识码：Ｂ文章编号：１００７－５０３８（２０１２）０６－０１３０－０５

ＲＮＡ干扰是指生物体在进化过程中，由高度保守的双链ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）诱导同源ｍＲＮＡ高效特异性降解的现象。它是生物体抵御外来感染的一种重要保护机制。ＲＮＡｉ作为沉默特定基因功能的新技术，为基因功能的研究提供了一个高效、简便的方法，在功能基因组学领域掀起一场革命。Ｓｃｉｅｎｃｅ杂志在２００１年将ＲＮＡｉ列为１０大科学成就之一，２００２年又将其列为当年１０大科学成就之首，Ｎａｔｕｒｅ杂志也将其评为２００２年重大科技成果之一。２００６年度诺贝尔生理学或医学奖奖授予两名美国科学家安德鲁－费里和克拉格－米洛，以表彰他们在ＲＮＡ干扰现象发现过程中的贡献。１　ＲＮＡｉ的发现目前，有效抑制基因表达的方法主要有基因敲除（ｋｎｏｃｋ　ｏｕｔ）、基因表达降低（ｋｎｏｃｋ　ｄｏｗｎ）、显性阴性（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ）、反义ＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ）等方法。这些方法均存在操作复杂，基因的选择局限性大且结果不稳定，无法预知试验效果等局限性。因此科学家们试图寻找更有效、易操作、结果更稳定的技术方法。１９９０年Ｏｒｇｅｎｓｏｎ等试图将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后导入矮牵牛中，来增加花瓣的着色。然而却出现了完全相反的结果，一些转基因的花出现了全白或部分白色。这就提示，不仅导入的基因未被表达，反而连植物本身的某些合成色素的基因也失活，即出现了一种共抑制（ｃｏｓｕｐ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ）现象［１］。１９９５年Ｇｕｏ和ＫｅｍＰｈｕｅｓ发现注射正义ＲＮＡ和反义ＲＮＡ均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫ｐａｒ－１基因的表达，该结果不能使用反义ＲＮＡ技术的理论做出合理解释。１９９８

年，Ｆｉｒｅ等证实正义ＲＮＡ抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的ＲＮＡ中污染了微量内源或外源双链ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ

）

而引发并将这一现象命名为ＲＮＡｉ

，这是生物界有

关ＲＮＡｉ存在的首次报道［２］。

２　ＲＮＡｉ的作用机理经过众多学者的研究，现已基本阐明了ＲＮＡｉ

的作用机理。一般认为ｄｓＲＮＡ介导整个ＲＮＡｉ过程分为启动、效应两个主要阶段。２．１　

启动阶段

外源性ｄｓＲＮＡ进入细胞内，首先被一种叫Ｄｉｃ－

ｅｒ的酶切割成大约２２ｎｔ的小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）片

断。Ｄｉｃｅｒ酶具有一个螺旋酶结构域，两个ＲＮａｓｅⅢ

结构域和一个双链ＲＮＡ结合位点，属于ＲＮａｓｅⅢ

超家族的一员，进化上非常保守，在ｒｄｅ－１

（

ＲＮＡｉ　ｄｅ－

ｆｅｃｔｉｖｅ－１）或ａｇｏ－１（ａｒｇｏｎａｕｔｅ－１）和ｒｄｅ－４介导下，能特异性的切割ｄｓＲＮＡ

，产生ｓｉＲＮＡ。在此过程中，

有两个需要ＡＴＰ的步骤：①ｄｓＲＮＡ的断裂，需要

ＡＴＰ的参与使Ｄｉｃｅｒ－ｄｓＲＮＡ复合体具有活性。②

ＡＴＰ维持ｓｉＲＮＡ功能所必需的靶－负链ｓｉＲＮＡ的磷酸化。ｓｉＲＮＡ是ＲＮＡｉ作用的重要中介因子。典

型的ｓｉＲＮＡ具有５′磷酸基、３′羟基和３′外悬２ｎｔ，

长

２１ｎｔ～２３ｎｔ的双链ＲＮＡ。２１ｎｔ～２３ｎｔ的ｓｉＲＮＡ至几百个核苷酸的ｄｓＲＮＡ都能诱发ＲＮＡｉ，但长双链ＲＮＡ阻断基因的表达的效果明显强于短的双链ＲＮＡ。２．２　效应阶段ＲＮＡｉ的效应阶段就是ｓｉＲＮＡ降解同源ｍＲ－ＮＡ的过程。ｓｉＲＮＡ双链结合一个核酶复合物从而形成ＲＮＡ诱导沉默复合物（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ），每个ＲＩＳＣ含一个ｓｉＲＮＡ和一个不同于Ｄｉｃｅｒ酶的ＲＮＡ酶。ＲＩＳＣ依赖ＡＴＰ将ｓｉＲＮＡ解双链以激活ＲＩＳＣ，激活的ＲＩＳＣ通过碱基配对定位到同源ｍＲＮＡ转录体上，并在距离ｓｉＲＮＡ３′端１２个碱基的位置切割ｍＲＮＡ，产生基因沉默效应。３　ＲＮＡｉ的作用特点ＲＮＡｉ比同源重组法更加简便，周期大大缩短。对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用ＲＮＡｉ技术研究它的功能。由于ＲＮＡｉ能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。ＲＮＡｉ还被用来研究在发育过程中起作用的基因如可用ＲＮＡｉ来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中起着关键作用。除此以外，ＲＮＡｉ还具有结构的高度稳定性、序列高度特异性、抑制作用的高效性、细胞间高传递性等，在某些生物中ＲＮＡｉ还可以传递到后代中去［３］。４　ＲＮＡｉ在动物传染病方面的研究自首次报道以来，ＲＮＡｉ技术由于其优越性而被迅速地应用于抗病毒及其相关方面的研究中。从当前的研究结果发现，ＲＮＡｉ针对不同基因序列都有效，而且特异性强、效率高、操作方便，可以利用特异性的ｓｉＲＮＡ技术针对病毒主要基因编码区的保守序列或与病毒感染有关内源性基因，设计出特异性的针对靶序列的ｓｉＲＮＡ，这为预防治疗病毒感染开辟了一条新途径。下面简要介绍ＲＮＡｉ近年来在猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、狂犬病、新城疫等重大动物传染性疾病的研究进展。４．１　ＲＮＡｉ技术在猪瘟方面的研究猪瘟（ＣＳＦ）是由猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）引起的一种高度接触性传染病，被世界动物卫生组织（ＯＩＥ）列为必须报告的动物疫病。中国猪瘟兔化弱毒疫苗在防控猪瘟中曾起到决定性作用，但近几年来免疫效果不理想。猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）是黄病毒科瘟病毒属的重要成员，为有囊膜病毒。ＣＳＦＶ基因组为单股正链ＲＮＡ，全长约１２ｋｂ，从５＇到３＇依次为５＇非翻泽区（５＇－ＮＴＲ）、Ｎｐｒｏ、Ｃ、Ｅ０（Ｅｒｎｓ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、

ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ和３＇非翻译区（３＇－

ＮＴＲ），５＇端无帽子结构，３＇端无ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴。ＣＳ－

ＦＶ基因组编码一条由结构蛋白和非结构蛋白组成的多聚蛋白，可进一步被蛋白酶加工成病毒所需的各种功能蛋白。针对这些蛋白的功能，众多学者设计特异的ｓｉＲＮＡ

，进行了抑制猪瘟病毒增殖的研究。

Ｎｐｒｏ是猪瘟病毒编码的第一个蛋白，若Ｎｐｒｏ基因表达被抑制，则整个ＯＲＦ中位于Ｎｐｒｏ下游的基因将不能表达。ＮＳ５Ｂ是病毒复制酶，具有ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ酶活性，是ＲＮＡ聚合酶复合体的核心成分，如果猪瘟病毒的ＮＳ５Ｂ基因的表达被抑制，则会抑制病毒基因组ＲＮＡ的复制。徐兴然等［５］根据猪瘟病毒Ｓｈｉｍｅｎ株Ｎｐｒｏ和ＮＳ５Ｂ基因序列，设计猪瘟病毒特异的ｓｉＲＮＡ

，通过体外转录获得了这两个基因

的ｓｉＲＮＡ：ｓｉＮ１、ｓｉＮ２、ｓｉ５Ｂ１和对照ｓｉＣｔｒｌ

，制备的

ｓｉＲＮＡ转染ＰＫ－１５细胞后感染猪瘟病毒，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ和ＴＣＩＤ５０检测表明ｓｉＮ１、ｓｉＮ２和ｓｉ５Ｂ１能有效地抑制猪瘟病毒的增殖，且其维持时间为７２ｈ

～８４ｈ，７２ｈ～８４ｈ后病毒增殖才会增加。王铁东等［６］针对猪瘟病毒石门株Ｎｐｒｏ基因ｍＲＮＡ的ｓｈＲ－

ＮＡ（短发夹ＲＮＡ）逆转录病毒表达载体，转导猪胚

胎成纤维细胞，获得稳定整合ｓｈＲＮＡ表达构件的猪胚胎成纤维细胞株，接种ＣＳＦＶ后，间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测证实针对所构建的Ｎｐｒｏ基因的ｓｈＲＮＡ逆转录病毒整合细胞基因组后转录产生的ｓｉＲＮＡ可有效抑制ＣＳＦＶ复制。ＮＳ２－３基因编码的蛋白被加工后形成的ｐ８０蛋白在病毒的生命

活动中起着重要的作用。冶贵生、张彦明、徐浩等［７］成功构建靶向猪瘟病毒ＮＳ３基因ｓｈＲＮＡ干扰载体，取得可喜进展。近年来研究结果表明，ｓｉＲＮＡ可以作为一种候

选的防治猪瘟病毒的有效制剂，虽不能清除病毒或完全抑制病毒，但通过抑制病毒快速增殖，有效激发机体免疫，可使机体及时建立特异性免疫，为研制抗ＣＳＦＶ新型药物提供一定的参考依据。４．２　ＲＮＡｉ技术在猪繁殖与呼吸综合征方面的研究猪繁殖与呼吸综合征（ＰＲＲＳ）

是由猪繁殖与呼吸

障碍综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）

引起的一种高度接触性传

染病，呈地方流行性和持续性感染，由于ＰＲＲＳＶ遗传变异较快，现有疫苗免疫效果较差，目前该病难以控制根除，给养猪业造成了巨大的经济损失。ＰＲＲＳＶ

为单股正链ＲＮＡ病毒，基因组全长约为１５ｋｂ

，含有

９

个开放阅读框（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅｓ，ＯＲＦｓ）。

其中

１３１杨亮宇等：ＲＮＡ干扰及其在动物传染病方面的研究概况

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细胞实验RNA的干扰

细胞实验RNA的干扰

细胞生物学实验动物细胞的转染与GFP的RNA干扰技术一、实验目的1、学习和掌握外源基因导入动物细胞的方法，观测外源基因的表达（绿色荧光蛋白），并了解细胞转染技术在细胞生物学相关领域的应用。

2、学习和掌握RNA干扰技术原理，学习观测利用化学合成的GFP-siRNA对GFP蛋白的抑制效果。

二、实验原理（一）绿色荧光蛋白1、GFP荧光蛋白的发现1962年,下村修在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。

它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。

马丁•查尔非就考虑只用它的编码区域来表达。

1993年，他用PCR的方法扩增了GFP的编码区，将它克隆到表达载体中，紫外光或者蓝光激发后，大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。

1994年在美国《科学》杂志上发表《作为基因标识的绿色荧光蛋白》一文，尽管正文只有一页，却标志绿色荧光蛋白投入实验室应用。

2、GFP荧光蛋白的应用GFP已被广泛应用于：细胞内分子标记、药物筛选、融合抗体基因表达检测、分子间相互作用等。

GFP具有如下特性：GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白能力比荧光素（fluorescein）强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定. GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定，脱水剂戊二酸或甲醛等.GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.（二）转染1、转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。

RNAi技术及其在寄生虫研究中的应用

RNAi技术及其在寄生虫研究中的应用

收稿日期:2007204204基金项目:新疆兵团科技局社会发展项目(2006GG31)作者简介:荣光(1978～),男,山东人,硕士研究生,主要从事动物传染病诊断与防制研究。

[21]　王艳华,李克生,才学鹏,等.弓形虫抗体免疫胶体金快速检测试纸条的研制[J].中国兽医科学,2007,37(1):29232.[22]　司进,朱荫昌,徐明,等.快速胶体染料试纸条法检测弓形虫病I g M抗体的研究[J].中国血吸虫病防治杂志,2005,17(2):93296.[23]　Ho2yen D O,J A W L,Balfour A H,et al.U se of thepoly merase chain reacti on t o detect Toxoplas m a gondii inhu man bl ood sa mp les[J].J Clin Pathol,1992,45:9102913.[24]　Savva D,Morris J C,Johns on J D,et al.poly merasechain reacti on for detecti on of T oxop las ma gondii[J].JM ed M icr obi ol,1990,31(1):25231.[25]　Jauregui L H,H iggins J,Zarlenga D,et al.Devel op2ment of a Real2Ti m e PCR f or for detecti on of Toxop las magondii in p ig and mouse tissues[J].Clin M icr obi o,2001,39(6):206522071.[26]　戴克胜,李玉云,郝艳梅.先天致畸病原体感染多重PCR检测方法的建立[J].蚌埠医学院学报,2000,25(4):2372239.[27]　李爽,甘绍伯.原位PCR对弓形虫感染鼠病理检测效果的观察[J].中国人兽共患病杂志,2000,16(3):41243.[28]　郑兰艳,王海鹏.应用免疫2PCR检测弓形虫循环抗原的实验研究[J].中国人兽共患病杂志,2000,16(4):78280.[29]　罗文,余世,胡千里,等.应用荧光定量PCR及E L I S A法检测弓形虫感染分析[J].中国优生与遗传杂志,2002,10(1):31233.[30]　陈俏梅,张俐,何国声.检测实验动物弓形虫感染的两种PCR方法的建立和比较[J].中国兽医寄生虫病,2003,11(2):528.[31]　刘世国,刘明林,孟桂芳,等.弓形虫感染家兔精液中虫体含量的动态变化[J].中国人兽共患病学报,2006,22(4):3232325.中国兽医寄生虫病　2008,16(1):33237 Chinese Journal of Veterinary Parasit ol ogy・文献综述・RNA i技术及其在寄生虫研究中的应用荣　光1,2,　赵军明1,2,　王新华2,　薄新文2,　郑金海1,2,　陈护亚3(1.石河子大学动物科技学院,石河子832003;2.新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室,石河子832003;3.陕西省汉中市畜牧兽医中心,汉中723000)摘　要:　RNA干扰(RNA interference,RNA i)是一种新兴的基因阻断技术,它通过双链RNA分子的介导,特异性降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默,该技术自1998年首次报道以来已取得了重大研究进展。

RNA干扰技术基本原理和应用

RNA干扰技术基本原理和应用

使异常旳RNA转变为dsRNA 参加细胞内dsRNA和siRNA旳扩增 siRNA与靶mRNA 旳结合可激活RdRp， 形成大量旳dsRNA
RNAi旳主要过程
效应阶段 RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC） 旳形成 RISC旳激活：ATP依赖旳解双链过程 在siRNA反义链旳指导下(靶序列旳辨认）， RISC特异性切 割、降解靶mRNA，造成基 因体现失活
NS3-1948 siRNA +
HCV体现质粒
共转染
Huh-7 细胞
HCV RNA ↓ 23倍
GAPDH siRNA
+
HCV RNA 无变化
谢 谢!
2023 年 Berstein 等 提出只有22 核苷酸dsRNA才有特异性旳
阻断效应，并发觉体内分解dsRNA 为 siRNAs (short/small interfering RNA) 旳 DICER 酶
RNAi旳发觉和发展历程
2002 年 Novina 等 用RNAi 技术实现了对HIV-1 病毒旳阻抑
Dicer酶
RNAase III超家族组员。构造中涉及一种 螺旋酶构造域，两个RNA酶Ⅲ构造域，一 种双链RNA结合位点 对单链RNA没有活性 对200~500nt旳dsRNA作用效果最佳，能 降解成25nt左右旳siRNA 广泛存在
RdRp（RNA dependent RNA polymerase）
siRNA旳制备措施
细胞内制备措施 依赖体现质粒或病毒载体在细胞内获取 siRNA 经过PCR介导旳siRNA体现试剂盒获取 siRNA
siRNA载体
依赖RNA聚合酶III 开启子(pol III) ，操纵一 段小旳发夹siRNA在哺乳动物细胞中旳体 现。
rna干扰的名词解释

rna干扰的名词解释

rna干扰的名词解释RNA干扰：探索基因调控的新领域近年来，一个名词在生物学领域频繁出现，它就是“RNA干扰”。

作为一种重要的基因调控机制，RNA干扰在生物学研究中扮演着重要的角色。

本文将带您深入了解RNA干扰的概念、机制和应用。

一、RNA干扰的概念RNA干扰，全称为RNA interference，是一种通过RNA分子调控基因表达的过程。

简而言之，它是一种通过降解或抑制特定基因产物的方式，来调节这些基因表达和功能的现象。

二、RNA干扰的机制1. 小干扰RNA（siRNA）的产生RNA干扰的开始是由于产生小干扰RNA（siRNA）。

当外源的双链RNA （dsRNA）或内源性的转录产物具备一定的结构特征，即能够被核酸内切酶识别并切割，从而形成长度约为20-24核苷酸的小干扰RNA。

2. siRNA的导入产生的siRNA会与RNA诱导复合物（RISC）结合，这个复合体能够识别和结合与siRNA序列互补的mRNA分子。

导入过程确保siRNA与目标mRNA结合，从而催化这些mRNA的降解或抑制翻译。

3. mRNA降解或抑制翻译一旦siRNA与特定mRNA结合，RISC会切割这些mRNA分子，导致它们在细胞内降解。

如果切割发生在编码区，会导致部分或完全的mRNA降解；如果切割发生在非编码区，会引起mRNA的转译抑制，从而阻止蛋白质的合成。

三、RNA干扰的应用1. 基因沉默研究RNA干扰为研究基因功能提供了强有力的工具。

通过选择性地抑制或沉默特定基因，在细胞和生物体中观察这些变化，可以揭示基因在发育、分化、疾病等方面的重要作用。

2. 药物研发RNA干扰技术为药物研发提供了新途径。

通过利用siRNA特异地靶向基因表达，可以高效地减少特定蛋白质的产生，从而对许多疾病进行治疗。

例如，肝癌、糖尿病和病毒感染等疾病的治疗已经取得了一定的成功。

3. 农业和食品安全RNA干扰不仅在医学领域应用广泛，也在农业和食品安全领域有着巨大潜力。