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革兰氏染色法操作规程
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革兰氏染色法操作规程
1目的
建立革兰氏染色法操作规程,确保革兰氏染色法操作规范化、科学化。
2范围
适用于用革兰氏染色法对细菌进行分类和鉴定。
3职责
3.1检验员:负责按本规程进行革兰氏染色操作。
3.2 QC主管、质量部经理:负责监督。
4内容
4.1仪器与用具
酒精灯、洁净的盖玻片、接种环、滴管、生物显微镜。
4.2材料
4.2.1试剂
结晶紫、番红、碘化钾、碘、95%乙醇、草酸铵、香柏油。
4.2.2试液及配制方法
4.2.2.1 结晶紫染色液:称取结晶紫2g,溶于20ml 95%乙醇中;称取草酸铵0.8g,溶于80ml水中;将两种溶液混合,静置48h后使用。
4.2.2.2碘染色液:称取碘化钾2g,加5~10ml水使充分溶解,加碘1g,待完全溶解后,加水至300ml。
4.2.2.3 番红复染液:称取番红0.25g溶于10ml 95%乙醇中,然后加水100ml。
4.3操作步骤
4.3.1 样品固片
取一干净的载玻片,用接种环挑取一环无菌水于载玻片中,挑取少量菌于生理盐水中涂片或直接滴一滴待检菌在盖玻片中央,自然干燥固定。
4.3.2 初染
滴加结晶紫染液于已固定的涂片上,染1min,用水冲洗、甩干。
4.3.3 媒染
滴加碘染色液,液作用1min,用水冲洗、甩干。
4.3.4 脱色
滴加95%乙醇脱色,置白色背景下,侧动盖玻片,直至无紫色脱落为止(约为20-30秒),立即用水冲洗、甩干。
4.3.5 复染
滴加番红复染液,染1-2 min,用水冲洗、甩干。
4.3.6 镜检
置油镜下观察。先用低倍镜找准目标,于涂有样品处滴加香柏油一滴,用油镜观察。
4.3.7 结果判定
革兰氏阳性菌呈蓝紫色,革兰氏阴性菌呈红色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常呈假阳性。
4.4 注意事项
4.4.1 待检菌菌龄应为18~24h。一般情况下,革兰氏阴性菌的染色反应较稳定,不易受菌龄长短影响;而革兰氏阳性菌,有的在幼龄时呈阳性,超过24h可变为阴性。故培养物越陈旧,菌细胞衰老、死亡,则染色常为阴性,造成错判。
4.4.2 涂片不宜过浓厚。过于密集的菌体,因洗脱不匀常呈假阳性。涂片后不宜用火焰烤干,宜自然干燥;若经火焰固定时,应以温热不烫手为宜,以免菌体受损,致染色反应不准。
4.4.3 革兰氏染色操作的关键步骤是对脱色的掌握,脱色时间不足,革兰氏阴性菌可染成阳性菌;脱色过度,革兰氏阳性菌可染成阴性菌。
5相关/支持性文件
无。
6记录
无。