革兰氏染色法操作规程

革兰氏染色法操作规程

1目的

建立革兰氏染色法操作规程，确保革兰氏染色法操作规范化、科学化。

2范围

适用于用革兰氏染色法对细菌进行分类和鉴定。

3职责

3.1检验员：负责按本规程进行革兰氏染色操作。

3.2 QC主管、质量部经理：负责监督。

4内容

4.1仪器与用具

酒精灯、洁净的盖玻片、接种环、滴管、生物显微镜。

4.2材料

4.2.1试剂

结晶紫、番红、碘化钾、碘、95%乙醇、草酸铵、香柏油。

4.2.2试液及配制方法

4.2.2.1 结晶紫染色液：称取结晶紫2g，溶于20ml 95%乙醇中；称取草酸铵0.8g，溶于80ml水中；将两种溶液混合，静置48h后使用。

4.2.2.2碘染色液：称取碘化钾2g，加5～10ml水使充分溶解，加碘1g，待完全溶解后，加水至300ml。

4.2.2.3 番红复染液：称取番红0.25g溶于10ml 95%乙醇中，然后加水100ml。

4.3操作步骤

4.3.1 样品固片

取一干净的载玻片，用接种环挑取一环无菌水于载玻片中，挑取少量菌于生理盐水中涂片或直接滴一滴待检菌在盖玻片中央，自然干燥固定。

4.3.2 初染

滴加结晶紫染液于已固定的涂片上，染1min，用水冲洗、甩干。

4.3.3 媒染

滴加碘染色液，液作用1min，用水冲洗、甩干。

4.3.4 脱色

滴加95%乙醇脱色，置白色背景下，侧动盖玻片，直至无紫色脱落为止（约为20-30秒），立即用水冲洗、甩干。

4.3.5 复染

滴加番红复染液，染1-2 min，用水冲洗、甩干。

4.3.6 镜检

置油镜下观察。先用低倍镜找准目标，于涂有样品处滴加香柏油一滴，用油镜观察。

4.3.7 结果判定

革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常呈假阳性。

4.4 注意事项

4.4.1 待检菌菌龄应为18～24h。一般情况下，革兰氏阴性菌的染色反应较稳定，不易受菌龄长短影响；而革兰氏阳性菌，有的在幼龄时呈阳性，超过24h可变为阴性。故培养物越陈旧，菌细胞衰老、死亡，则染色常为阴性，造成错判。

4.4.2 涂片不宜过浓厚。过于密集的菌体，因洗脱不匀常呈假阳性。涂片后不宜用火焰烤干，宜自然干燥；若经火焰固定时，应以温热不烫手为宜，以免菌体受损，致染色反应不准。

4.4.3 革兰氏染色操作的关键步骤是对脱色的掌握，脱色时间不足，革兰氏阴性菌可染成阳性菌；脱色过度，革兰氏阳性菌可染成阴性菌。

5相关/支持性文件

无。

6记录

无。