紫外分光光度法测定有机物实验方法

* *

6种方法测定蛋白质含量

一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：

nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)

2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)

(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)

反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白

氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

二、双缩脲法（biuret法）

（一）实验原理

双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为* *

双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材

1. 试剂：

（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制，酪蛋白用0．05n naoh配制。

紫外分光光度法测定苯酚的浓度

一、实验目的

1．掌握紫外分光光度法测定酚的原理和方法。

2．掌握应用紫外分光光度计进行定量分析的方法和基本操作。

二、实验原理

苯酚是工业废水中的一种有害物质，如果流入江河，会使水质受到污染，因此在检测饮用水的卫生质量时，需对水中酚含量进行测定。

苯具有环状共轭体系，由 π→π*跃迁在紫外吸收光区产生三个特征吸收带：强度较高的E1带，出现在180nm左右；中等强度的E2带，出现在204nm左右；强度较弱的B带，出现在255nm。有机溶剂、苯环上的取代基及其取代位置都可能对最大吸收峰的波长、强度和形状产生影响。具有苯环结构的化合物在紫外光区均有较强的特征吸收峰，在苯环上的部分取代基（助色团）使吸收增强，而苯酚在270nm处有特征吸收峰，在一定范围内其吸收强度与苯酚的含量成正比，符合Lambert-Beer定律，因此，可用紫外分光光度法直接测定水中总酚的含量。

三、实验步骤

1.原溶液的配制

准确称取0.0250g苯酚与烧杯中，用蒸馏水溶解后定容于100ml的容量瓶中，则此溶液的浓度为250mg/L。

2.标准溶液的配制

取5支50ml的容量瓶，分别编号为1、2、3、4、5，向其中分别移取1ml、5ml、10ml、20ml、40ml的250mg/L的苯酚溶液，并用蒸馏水定容。计算其浓度分别为：

编号 1 2 3 4 5 6

浓度（mg/L）

5

25

50

100

200

250

3．标准曲线的测定

选择苯酚的最大吸收波长（270nm），用1cm石英比色皿，以溶剂空白（去离子水）作参比，按浓度由低到高顺序依次测定苯酚标准溶液的吸光度。

四、数据记录与处理

编号 1 2 3 4 5 6 待测样品

浓度（mg/L） 5 10 50 100 200 250

吸光度

平均值

紫外-可见分光光度法

1 简述

紫外-可见分光光度法是在190-800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和含量测定的方法。

定量分析通常选择物质的最大吸收波长处测出吸光度，然后用对照品或吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对已知物质定性可用吸收峰波长或吸光度比值作为鉴别方法；若该物质本身在紫外光区无吸收，而其杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰处该物质无吸收，则可用本法作杂质检查。

物质对紫外辐射的吸收是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生，因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称电子光谱。有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环等发色基团，均可在紫外区（200~400nm）或可见光区（400~850nm）产生吸收。通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长范围为190~900nm。

紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律为光的吸收定律，它是紫外-可见分光光度法定量分析的依据，其数学表达式为:

A=logT1=ECL

式中 A为吸光度;

T为透光率;

E为吸收系数;

C为溶液浓度;

L为光路长度。

如溶液的浓度（C）为1%（g/ml），光路长度（L）为lcm，相应的吸光度即为吸

收系数以%11cmE表示。如溶液的浓度（C）为摩尔浓度（mol/L），光路长度为lcm

时，则相应有吸收系数为摩尔吸收系数，以ε表示。

2 仪器

紫外-可见分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。

为了满足紫外-可见光区全波长范围的测定，仪器备有二种光源，即氘灯和碘钨灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。

单色器通常由进光狭缝、出光狭缝、平行光装置、色散元件，聚焦透镜或反射镜等组成。色散元件有棱镜和光栅二种，棱镜多用天然石英或熔融硅石制成，对200~40Onm波长光的色散能力很强，对600nm以上波长的光色散能力较差，棱镜色散所得的光谱为非匀排光谱。光栅系将反射或透射光经衍射而达到色散作用，故常称为衍射光栅，光栅光谱是按波长作线性排列，故为匀排光谱，双光束仪器多用光栅为色散元件。

紫外-可见分光光度法 1 / 8

紫外 -可见分光光度法

1 简述

紫外 -可见分光光度法是在 190-800nm波长范围内测定物质的吸光度， 用于鉴识、

杂质检查和含量测定的方法。

定量剖析往常选择物质的最大汲取波优点测出吸光度，而后用比较品或汲取系

数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对已知物质定性可用汲取峰波

长或吸光度比值作为鉴识方法；若该物质自己在紫外光区无汲取，而其杂质在紫外

光区有相当强度的汲取， 或杂质的汲取峰处该物质无汲取， 则可用本法作杂质检查。

物质对紫外辐射的汲取是因为分子中原子的外层电子跃迁所产生，所以，紫外

汲取主要决定于分子的电子构造，故紫外光谱又称电子光谱。有机化合物分子构造

中如含有共轭系统、芬芳环等发色基团，均可在紫外区（ 200~400nm）或可见光区

（ 400~850nm）产生汲取。往常使用的紫外 - 可见分光光度计的工作波长范围为

190~900nm。

紫外汲取光谱为物质对紫外区辐射的能量汲取图。朗伯 -比尔（ Lambert-Beer）

定律为光的汲取定律， 它是紫外 -可见分光光度法定量剖析的依照， 其数学表达式为 :

1 A=log =ECL T 式中 A 为吸光度 ;

T为透光率 ;

E为汲取系数 ;

C为溶液浓度 ;

L为光路长度。

如溶液的浓度（ C）为1%（g/ml ），光路长度（ L ）为 lcm，相应的吸光度即为汲取系数以 E1cm1% 表示。如溶液的浓度（ C）为摩尔浓度（ mol/L ），光路长度为 lcm

时，则相应有汲取系数为摩尔汲取系数，以 ε表示。

2 仪器

紫外 -可见分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、记录仪、显示系 紫外-可见分光光度法

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统和数据办理系统等部分构成。

为了知足紫外 -可见光区全波长范围的测定， 仪器备有二种光源， 即氘灯和碘钨

灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。