生物解剖学实验中的组织切片技术

（3）平滑肌 纤维呈长梭形，无横纹。 细胞核一个，呈长椭圆形 或杆状，位于中央，收缩 时核可扭曲呈螺旋形，核 两端的肌浆较丰富。平滑 肌纤维大小不一，一般长 200µm，直径8µm；小血管 200µm，直径8µm；小血管 壁平滑肌短至20µm，而妊 壁平滑肌短至20µm，而妊 娠子宫平滑肌可长达 500µm。平滑肌纤维可单 500µm。平滑肌纤维可单 独存在，绝大部分是成束 或成层分布的。
（2）致密结缔组织 主要构成肌腱和腱膜。大 量密集的胶原纤维顺着受 力的方向平行排列成束， 基质和细胞很少，位于纤 维之间。细胞成分主要是 腱细胞，它是一种形态特 殊的成纤维细胞，胞体伸 出多个薄翼状突起插入纤 维束之间，胞核扁椭圆形， 着色深。
（3）网状组织 网状组织分布在整个淋巴结中， 构成支架。低倍镜下，选择髓 质 中染色浅淡处观察，此处为 髓质淋巴窦（髓窦），因窦腔 中细胞成分较少，便于 观察网 状组织。高倍镜下，可见网状 细胞为多突起的细胞，胞质嗜 酸性红染，相 邻的网状细胞的 突起彼此相连成网。网状细胞 的核大而明亮，核仁明显。网 状细 胞围成的网眼中可见许多 淋巴细胞。淋巴细胞圆形，核 亦圆，着色深，胞质少， 不易 看见。网状纤维细小，紧贴着 网状细胞的突起行走
实验一 人体基本组织 的观察
一、实验目的
1、掌握上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神 经组织的结构及功能特点 2、熟悉各种组织类型 3、了解各种组织在身体的分布
二、材料与器械
显微镜、上皮组织切片（单层扁平上皮、 单层柱状上皮、单层立方上皮等）、结缔 组织切片（疏松结缔组织、致密结缔组织 等）、肌肉组织（心肌、骨骼肌、平滑 肌）、神经组织（运动神经元、多极神经 元）
3、肌肉组织 （1）骨骼肌
低倍镜下，可见表面上皮为复层扁平 上皮，上皮下方有疏松结缔 组织，深 部组织中有许多条条块块结构，条状 的为骨骼肌的纵断面，块状的为骨骼 肌的横断面；每一条状或块状结构包 含多条骨骼肌纤维的断面。肌纤维之 间有少量结缔组织，其内可见浆液性 的味腺。选择肌纤维较分散、染色较 浅的视野，换高倍镜观察。在纵断面 上，可见骨骼肌呈条索状，有明暗相 间的横纹（观察横纹时，缩小光圈， 使通光量减小，横纹将更为清晰）； 每条肌纤维内均有许多紧贴肌膜内面 的长卵圆形胞核，染色浅，有时可见 核仁；肌浆中隐约可见许多平行于肌 纤维长轴排列丝状结构，即肌原纤维。 在横断面上，肌纤维呈圆形或不规则 形，每个断面常可见数量不定的胞核 位于肌纤维的周边，肌浆内肌原纤维 束呈点状均匀分布。肌纤维间的结缔 组织中可见小血管。

各种组织冰冻切片、取材，染色等具体操作方法(连载一脑、肠、眼球）1.做脑组织的冰冻切片在前期的处理过程中很重要，因为脑组织非常软。

不但要做前固定，最好是做全身灌注固定后，如果不做全身灌注固定，很难取出一个完整的大脑组织。

再段头取脑置4度4％多聚甲醛（或西奈山环保组织固定液）中后固定24小时，然后依次置入剃度PB蔗糖溶液脱水，剃度可以设为15%，20%，30%分别过夜沉底即可。

设剃度脱水是为了避免组织块冰晶的产生。

冰晶在组织片上表现为圆形或椭圆行的空洞，影响实验结果。

在做切片时可以做简单的HE染色即可分辨出是否有冰晶。

防止冰晶的另一实验注意点是在做切片前的包埋过程，要求速冻，一般放-20度下15分钟即可，温度高如室温或者4度是达不到速洞效果的，温度太低如放在液氮罐中又导致组织块的碎裂。

而且产生冰晶。

2.如果想要作出满意的漂亮的实验结果，特别是免疫双标共聚焦，那就要求更高，实验的每一步都要很严格，不是我说法夸张，是因为做共聚焦要避免自发荧光的问题，而实验的每一步都可能产生自发荧光，比如4％多聚甲醛灌注液，PB蔗糖等都可以产生让我们头痛的自发荧光问题，根据我的实验经验，国产的多聚甲醛作实验很容易产生自发荧光，难以避免，不过据我导师讲，他在国外做共聚焦不存在这些问题，所以我个人认为你不妨先做单标试试看，能避免自发荧光，那最大的难题就解决了。

西奈山环保组织固定液可以降低自发荧光背景。

3.是否做漂片还是贴片的问题，脑组织两种方法都可以，唯独共聚焦例外，做共聚焦要求片子一般为30-50um，厚片才能达到三维重建的效果。

一般的贴片文献上提到的是20-30um用漂片，此法要求抗体用量较大，最好买国外原装的浓缩液。

不过我做的脑片切过4um的做一般的普通免疫荧光可以。

楼上的几位同仁说得不错。

就我们实验室的操作方法以及个人的体会说上几点：1.如果灌注固定较好的话，完全可以省去后固定这个步骤。

神经组织常规的固定液为4%的多聚甲醛，如果在其中再加入0.25-0.5%的戊二醛增加其固定时的交联作用，那么固定的效果就会更好些，脑或脊髓标本就会更硬些；我们一般用1000ml多聚甲醛固定至少2小时。

生物显微制片技术专题海洋生命学院基础实验教学中心 毛玉峰通过此专题要解决以下问题：• • • • 一、生物显微制片的发展历史？ 二、为什么要进行生物显微制片？ 三、什么是生物显微制片？ 四、怎样进行生物显微制片？一、生物显微制片的发展简史？•• 1665年英国显微镜学家R·胡克把软木切成薄片才在 显微镜下观察到细胞。

• 1671年英国格鲁（N·Grew）发表了植物解剖学论文 ，但是没有提到怎样观察材料的。

1682年，格鲁编写 了《植物解剖学》著作，但是只是提到斜切、直切、 横切制作木材材料，也可以破裂、撕碎或其它方法制 作制片，提到刀子和显微镜是必须的。

• 列文虎克在1714年用藏红花作肌纤维切片的染色剂， 这一简单的切片和染色可以说是制片技术的萌芽。

1775，卡斯坦斯1770希尔• 1775年卡斯坦斯发明了卧式切片机，生前保密，他制作的 木材切片风行30年，死后他制作的切片机才被发现，他制 作切片的精致水平，死后50年无人超过。

1830-1870年间 有25种可以查考的切片机出现。

手持式切片机现在还在使 用。

• 虽然早在1775年英国人设计制作了切片机，但完善的转动 式切片机直到1883年才由法伊弗在美国制造成功。

这些重 要的制片手段，至今仍在使用。

• 从1665年R ·胡克发现细胞，经过100多年的实践，至19 世纪中期显微制片技术才逐渐完善。

1863年W·瓦尔代尔 报告了用苏木精染色可以很好地显示染色体。

1869年E· 克莱布斯最先采用石蜡作为切片支持物来包埋材料。

两年 后，波姆和斯特里克勒把它发展为石蜡切片法。

二、为什么要进行生物显微切片？• 大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微观察 的，也无法看到其内部结构。

因为材料较厚，光线不 易透过，以致不易看清其结构，另外细胞内的各个结 构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也难 以辩明。

组织石蜡包埋和切片技术包埋剂embedding agent在制作切片或超薄切片时，由于组织是柔软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片是困难的。

所以有必要用一定物质浸透组织内部，整个组织一样硬化，以利于切成薄片，这种物质叫做包埋剂。

一股用光学显微镜观察的切片，用石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等作包埋剂；电子显微镜则用环氧树脂、聚苯乙烯树脂、异丁烯树脂及水溶性树脂。

石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。

此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。

除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。

该法多采用旋转式切片机进行切片。

石蜡制片操作程序如下：（一）材料的采集与分割采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。

采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。

为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。

分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。

分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。

（二）杀死与固定利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。

常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。

将固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖。

用F.A.A 固定液固定，时间至少24小时。

F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。

卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。

因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。