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组织切片技术
固定：
组织块大小：1.5×1.5×0.2 CM
固定液>4倍组织体积
1. 酒精固定
纯究竟有较大的收缩力，固定时先用80%酒精固定数小时，然后换95%酒精。
优点：（1）尿酸结晶和糖类，用100%乙醇固定
（2）别的固定液固定后，80%乙醇保存
（3）边固定边脱水
缺点：（1）核染色不良
（2）脂类不行
（3）色素不行
（4）表面发硬，块大不行
2．福尔马林固定
市售为40%甲醛水溶液，应放入小量碳酸钠放置一段时间
福尔马林固定液：40%甲醛溶液1份，水9份
固定数小时后用水洗24小时
优点：克服了乙醇固定的缺点
苦味酸固定
以苦味酸饱和水溶液储存，固定后的组织经酒精脱水即可。
------------------------------------------ 最新资料推荐------------------------------------病理组织切片制作技术病理组织切片制作技术病理组织切片常用的制作方法有三种。
即石蜡切片法，冰冻切片法和火棉胶切片法。
以石蜡切片法为代表，切片的基本制作过程是：组织取材固定冲洗脱水透明浸蜡组织包埋组织切片展片附贴切片脱蜡染色脱水染片透明封固。
以上基本过程是互相联系的，任何一环节出现问题，都将使整个切片制作归于失败。
因此应细致、耐心、认真负责，并事先做好计划安排。
一、取材采取病料，要刀剪锐利，剪切时不可挤压，扯拉病料，以防人为损伤。
切取的工具要清洁。
采取病料越新鲜越好，一般不超过死后24小时。
应选择病变部与可疑病变部切取，切取时要由表及里，有浅入深并包括周围正常组织一部分。
特殊病料应根据器官的结构特点切取。
管状，囊状和皮肤组织应注意垂直切取（横切）。
带有薄膜的组织，要防止切时薄膜分离和脱落。
切取组织块大小，以1.51.50.3厘米为宜，最厚不宜超过0.5厘米。
组织块病变一面应平整光滑，另一面可不平整，以便包埋时辨认。
切取后，放入事先准备好的装有固定液的磨口玻璃广口瓶中，并做好标记。
二、固定固定的目的是迅速将组织细胞杀死，使细胞中的蛋白质，糖，脂肪等凝固，从而保持与活组织相似的结构状态。
材料取下后，应迅速固定。
固定液数量应为病理组织块的5到20倍。
由于一般把组织块浸入固定液后数小时，固定液渗入组织液的深度只达2至IJ 3厘米。
因此，可以放置冰箱内固定，使组织内酶失去作用，细菌也能停止滋生。
最常用的固定液是10%的福尔马林溶液：使用时，用40%的甲醛饱和水溶液10毫升，加水90毫升配成。
三、冲洗固定后的组织块，应将固定液洗去。
一般均用流水（自来水）冲洗12到24小时左右。
及时冲洗尚有停止固定的作用，防止固定过度，有利于制片染色。
冲洗时如不方便用流水冲洗，也可用较大容器盛装水浸洗，每隔相当时间换水一次。
病理学中的组织切片技术病理学是医学领域中非常重要的一个学科，研究人体各个器官和组织的疾病变化及其发生、发展机制。
而组织切片技术是病理学中的基础操作，是为了观察和诊断疾病而必要的步骤之一。
本文将详细介绍组织切片技术的相关知识和方法。
一、组织切片技术的概述组织切片技术是指将人体组织切割成薄片并染色，以便于病理学家观察。
这项技术已经存在了很长时间，并且随着技术的发展和改进，已经成为了诊断和治疗疾病的重要手段之一。
组织切片技术可以被广泛应用于疾病的研究、诊断和治疗中。
二、组织切片技术的步骤组织切片技术的主要步骤包括取样、固定、脱水、包埋、切片和染色。
下面将对这些步骤进行详细的介绍：1. 取样组织切片的第一步是取样，即从人体组织中取出一小块，以便于后续的操作。
取样的方法根据不同的情况会有所不同，比如在手术中取样，就需要根据病变的部位和特点来选择取样点，而在活检中取样，就需要根据患者的症状和体征来确定取样点。
2. 固定取样后，需要用一种方法把组织中的细胞和结构固定住，以便于后续处理。
目前常用的固定剂是福尔马林，它可以迅速把组织中的蛋白质交联，使其不易变性，从而保持组织形态的完整。
3. 脱水在固定后，需要将组织逐渐从水中转移到酒精、乙醇等脱水剂中，以便于把组织中的水去除，使其硬化。
这是组织切片的关键步骤之一，如果脱水不彻底，切出的组织切片会变形或破损。
4. 包埋将脱水的组织置于熔蜡中，使其被包覆在蜡中。
这么做可以保持组织的形态，并使其更易于切割。
5. 切片蜡包埋后，组织需要被切成薄片。
切片可以使用手工或自动切片机完成，手工切片需要技巧和经验，而自动切片机可以更好地保证切片的厚度和质量。
6. 染色切片完成后，需要对组织进行染色，以便于病理学家对其进行观察。
目前常用的染色剂有血液学染色剂、组织学染色剂以及免疫组化染色剂等。
三、组织切片技术的应用组织切片技术在病理学中有广泛的应用，其中包括：1. 诊断和治疗疾病组织切片技术是病理学家进行诊断和治疗疾病的重要手段之一。
组织切片制备技术在生命科学领域中，组织切片制备技术是一项基本且重要的技术，它被用于组织学、解剖学、病理学和神经科学等诸多领域。
组织切片制备技术可以产生高质量的组织切片样本，以便进行研究和分析。
本文将探讨组织切片制备技术的具体步骤和注意事项。
1. 组织处理在进行组织切片制备之前，需要对样本进行处理。
处理的目的是保护组织结构和细胞形态，以便在组织切片过程中得到高质量的切片。
处理的方法包括固定、脱水和浸渍。
2. 组织固定组织固定是组织切片制备技术中的一个重要步骤，目的是停止组织活动并保护组织结构。
固定的方法包括乙醛、甲醇和布氏液等。
3. 组织切片组织切片是组织切片制备技术的核心步骤之一。
合适的切片厚度应该根据需要来决定。
切片的方法包括手工切片和机器切片。
机器切片可通过旋转式、滑动式或挤压式制备。
4. 切片染色切片染色是组织切片制备技术中的关键步骤，可使细胞和组织结构变得更明显。
切片染色的方法主要有荧光染色和显微镜染色。
5. 成像和分析成像和分析是组织切片制备技术的最后一步。
通过显微镜成像和分析，可以观察到细胞和组织结构的形态和分布。
这种方法还可以被用于研究细胞和组织中的基因，蛋白质和其他特定目标。
注意事项：- 操作中要注意安全，佩戴手套和眼镜等防护设备；- 操作环境要保持清洁，防止异物进入；- 操作材料要储存妥善，避免过期或者污染；- 操作流程要规范，避免操作过程中发生错误。
结论：组织切片制备技术是在生命科学领域中非常基本的技术。
制备高质量的组织切片样本是开展组织学、解剖学、病理学和神经科学等领域的基础工作。
研究人员在进行组织切片制备时，必须依据标准的步骤和注意事项，以确保所获得的数据是可靠且具备参考价值的。
组织切片技术第一章组织制片概述组织制片技术是观察细胞、组织的生理和病理形态变化的一种主要的方法。
组织化学技术和原位杂交技术都是以组织制片为基础的。
一、制片前的准备工作1.染色缸和标本瓶的清洗用毛刷沾去污粉将染色缸和标本瓶里外擦洗，自来水冲洗干净备用。
金属银或组织化学染色时，器皿更要彻底清洗。
先去污粉洗，再洗液浸泡过夜，再自来水和蒸馏水冲洗。
洗涤液的配制：重铬酸钾300克浓硫酸300毫升蒸馏水3000毫升2.载玻片和盖玻片及其清洗载玻片简称为玻片或载片，一般尺寸为76毫米×26毫米，厚度为1-1.5毫米。
盖玻片一般为正方形或长方形，厚度为0.15-0.5毫米。
最常用的规格为18×18毫米、20×20毫米，还有其它规格的。
煮沸洗涤法: 新旧玻片均可采用。
洗衣粉水浸没玻片，加热煮沸15-20分钟，冷却，自来水冲洗，干净的白棉布或纱布擦干，保存备用。
酒精浸泡擦拭：新的玻片或载片可直接用酒精浸泡、擦拭，保存备用。
洗液浸泡法：要求严格的玻片，可在洗液浸泡后在冲洗干净。
二、制片方法的种类（一）非切片法不用切片机、没有切片手续而制成切片的方法。
常用的有以下几种：1.整体封藏法待制作的材料一般很小或为一薄片状，如无脊椎动物的水螅和草履虫等，脊椎动物的鸡胚和蛙胚等。
这些材料取下后经固定、脱水和染色就可以封藏在玻片内。
2.涂片法主要是液体或半流动性的材料，如血液、精液、细胞学检查、微生物等，直接将材料涂在玻片上，再经固定和染色制成标本。
血液涂片的制作与染色：取一干净载玻片，用左手拇指和食指夹住，然后取一小滴动物血置于载玻片右端,再取另一张边缘光滑的载玻片, 斜置于血滴左侧, 先向右稍移动轻轻触及血滴,使血液沿玻片端展开成线状, 两玻片的角度以30~40°为宜(角度过大血膜较厚,角度小则血膜薄), 轻轻将载玻片向左推进,即涂成血液薄膜,推进时速度要一致,否则血膜成波浪形,厚薄不匀. 待涂片在空气中完全干燥后,将血涂片靠近中央部分的两边(与载玻片短边平行的边)用玻璃铅笔圈上并平放在染色架上进行染色。
生物组织切片技术的步骤与显微镜观察注意事项生物组织切片技术是生物学实验中常用的一种技术，它可以使我们更加清晰地观察和研究生物组织的微观结构。
然而，要获得高质量的组织切片和准确地观察细胞结构，需要掌握一些关键步骤和注意事项。
1. 细胞固定和处理：首先，选择适当的生物组织进行研究，并将其固定。
常用的固定剂包括福尔马林、缩醛等。
固定过程中，应注意固定液的浓度、温度和固定时间，以获得最佳的切片结果。
2. 组织切片：固定后的组织需要进行切片以获得薄片。
切片可以使用手动或自动切片机进行。
切片时，要注意刀片的锋利度和切片的厚度，过厚或过薄的切片都会影响观察结果。
此外，在切片过程中需使用切片液体，保持组织的湿润性。
3. 脱水和清洁：切片完成后，需要对切片进行脱水和清洁。
脱水可以使用不同浓度的酒精进行，逐渐将水分从切片中去除。
脱水过程要缓慢进行，以免引起组织变性。
清洁时，可以使用温水和清洗剂将切片浸泡，去除脱水剂和其他残留物质。
4. 上染料及固定：完成脱水和清洁后，可以对切片进行染色。
染色可以增加组织结构的对比度，并使细胞和组织成分更加明确可见。
常用的染料有伊红、吉姆萨和涅瓦脱尔等。
染色后，需要将切片进行固定，以防止染色物质在观察过程中脱落。
5. 显微镜观察：对于观察切片，最关键的工具就是显微镜。
首先，将切片放置在显微镜载物台上，并选择适当的镜头放大倍数。
然后，调节聚焦和光源，确保观察到的细胞结构清晰可见。
同时，调整光源的强度，避免过强的光线造成过度曝光。
在观察细胞结构时，还需注意以下事项：a. 观察角度：切片必须放置在正确的平面上，以便观察到所需的细胞结构。
切片的厚度和切面的角度会对观察结果产生影响，因此要确保选择正确的切面进行观察。
b. 观察时间和条件：观察时应适度控制观察时间，避免过度放大或观察时间过长引起疲劳。
此外，观察时要注意环境条件，避免把显微镜放置在强光下或者有振动的地方，以免干扰观察。
c. 记录和分析：在观察过程中，要及时记录所观察到的细胞结构，并进行分析。
组织切片技术姓名：许莎班级：生技121学号：12772018组织切片技术是研究生物组织或细胞形态和结构的重要技术，对于促进细胞生物学和遗传学等研究的发展起着重要作用。
最早的制片技术是徒手切片技术，以后发展了利用石蜡进行包埋和切片的制片技术，即石蜡切片技术，该技术由于成本低，操作简单，目前仍在应用，该技术被越来越多的研究工作者应用于发育学、植物细胞学、胚胎学、解剖学等研究领域。
1组织切片技术原理1.1原理组织切片技术是研究组织形态学最常用的一项基本技术，在制作胚胎或组织切片时，由于细胞或组织是柔软的或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片很困难。
为了能清晰地观察到组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬然后利用切片机将组织切成薄片。
根据所用支持剂的种类不同，主要分为石蜡切片、冰冻切片、振动切片、火棉胶切片、塑料切片、碳蜡切片等。
1.2分类1.2.1石蜡切片该技术是最重要、最常用的组织切片技术之一，起始于18世纪。
此法是用石蜡作为包埋剂，将材料经过固定、脱水、透明后包埋在石蜡中，然后连同石蜡用切片机一同进行切片。
石蜡切片的主要优点是不仅可以把材料制成薄的切片，而且还能制成连续切片，这是其他制片技术难以做到的。
它的缺点是操作步骤比较复杂，而且材料在脱水、透明过程中会收缩、变硬、变脆，以致不易切片[1]。
1.2.2冰冻切片冰冻切片是利用干冰或液氮等速冻剂使组织迅速冷冻硬化，将组织在冷冻状态下直接用切片机切片的一项技术。
它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。
由于此法不需要经过各级乙醇的脱水、二甲苯的透明和浸蜡等步骤，因而较适合子脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断冰冻切片是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。
此种切片的优点是能较好的保存组织的RNA 稳定性、较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，缺点是需要较高的设备要求;切片较厚，导致组织结构显示欠佳;通常不能进行连续切片。
其主要操作技术和方法与石蜡切片过程和类似。
1.2.3振动切片是用振动切片机把新鲜的组织切成厚20-100pm的切片。
此类切片的优缺点类似于冰冻切片。
通常在切片后进行免疫染色然后再进行电镜切片,以此来弥补结构显示不清的不足。
振动切片机主要用于新鲜或经过固定的动、植物标本的制片，切片时组织标本不需冰冻或包埋。
因此.样品片既避免了冰晶破坏，又能保持其活性和细胞良好形态为免疫细胞化学研究以及脊髓和脑薄片的神经生物学研究提供了良好条件。
振动式切片机可以对不同的材料进行切片，在应用范围上补充了使用传统切片机的不足，是当代电镜、解剖、组胚、生理、医院化工等实验系统最理想的快速制样切片仪器。
1.2.4火棉胶切片是以火棉胶为包埋剂浸入包埋组织。
优点是可以切较硬的组织，缺点是操作比较麻烦费时,切片较厚,不能连续切片。
1.2.5塑料切片用干硬度大的组织标本的包埋。
由于塑料包埋组织细胞收缩程度小，切片薄，有利于组织细胞细微结构的观察，加之新型塑料包埋剂的出现和聚合方法的改进使塑料包埋技术得到了更为广泛的应用。
塑料包埋使用的包埋剂是各种树脂，未聚合的树脂为勤稠的液体.通过标本组织块的没润，树脂可渗透到组织间隙中。
自发或在催化剂和加速剂的作用下，发生分子回的连接形成支架，支撑组织细胞结构，聚合完成后形成固体硬块。
其优点是可以切出薄至0.5-2nm的切片，适用于同时作光镜和电镜检测。
缺点是处理程序繁多,抗原活性易丢失。
1.2.6碳蜡切片以碳蜡为包埋剂，优点是组织固定水洗后不需脱水透明,可以直接浸碳蜡包埋,切片方法于石蜡切片相同，缺点是夏季温度较高时切片困难。
1.3制备方法以石蜡切片为例，介绍切片标本的制备方法。
1.取材：根据科研和教学目的选择新鲜材料，然后进行适当的切取、分割。
样品块要尽量小，以便于下一步固定。
2.固定：将选取的新鲜材料立即投人到固定液中，迅速杀死细胞以保持组织及细胞的原有结构。
一般固定液的最少用量为所固定材料总体积的20倍。
固定液的选择视材料的性质及制片的目的而定，一般要求尽快杀死并固定细胞和组织。
石蜡切片常用的固定液有FAA 固定液、卡诺固定液，此外，还有多聚甲醛、戊二醛、乙醇、乙酸等。
3.洗涤：材料固定后，用洗涤剂将材料中的固定液洗掉，以便进行切片的染色或制片，常用的洗涤剂有水或乙醇。
4.脱水：因为固定和洗涤后的材料含有大量的水分，而水和透明剂、包埋剂(石蜡)不相溶，所以必须经过脱水逐步、彻底除去材料中的水分，才能进行透明和包埋。
常用的脱水剂是乙醇，另外还有乙醇、正丁醇、丙酮、环氧丙烷等。
脱水过程应由低浓度到高浓度逐级进行，不可太快。
否则会使细胞收缩或材料损坏。
5.透明：透明是脱水与浸蜡、脱水与封藏之间的桥梁。
材料经脱水后，组织内部已没有水分，但脱水剂不能与石蜡相溶，致使石蜡不能进人细胞与组织。
因此，需要一种既能与脱水剂混合又能与包埋刘石蜡相混合的溶剂来处理。
透明在制片中很重要。
如果组织不透明，表明脱水不彻底，必须重新返工，但返工效果往往不好，常用的透明剂有二甲苯、氯仿、冬青油等。
6.浸蜡：浸蜡是将石蜡包埋剂慢慢溶于浸有材料的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡逐渐渗人到材料的组织细胞中，最后使透明剂被石蜡取代。
进人组织细胞中的石蜡，在熔点以下很快凝固成固体，凝固后的石蜡起支撑作用，使切片后的细胞组织固定在原位。
7.包埋:将透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入包埋盒内，然后包埋盒底部接触冷水中，使其立刻降温凝固成蜡块。
操作过程：包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。
待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。
8.切片:已包埋好的石蜡材料，在进行切片之前需先进行修快、固着。
修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。
固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。
切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。
切下的蜡带放在干净黑纸上。
切片操作时应注意随时关好停刀轧，不能对着蜡带讲话以免吹散蜡带;切片完毕，将刀取下擦净。
涂上润滑油，放人盒内保存。
9.粘片、展片：通过粘贴剂把合格蜡带贴在载玻片上，在贴的同时，借助水的张力使蜡带完全伸展、平贴在载玻片上，粘片和展片是在载玻片上同时完成的步骤。
常用的粘贴剂有蛋白粘贴剂和明胶甘油粘贴剂两种10.脱蜡、透明：在染色之前，需要用脱蜡剂溶去组织和细胞的石蜡，进一步清洗脱掉的石蜡，使细胞、组织透明清晰，用于脱蜡和透明的试剂是二甲苯。
11.染色：为了使植物组织和细胞各部分显像清楚，必须进行染色。
运用不同的染色方法和选用不同的染色剂，使组织或细胞某一部分染上颜色，另一部分不染上颜色成为背景;或将不同部分染成不同的颜色，可使组织细胞在光学显微镜中显像清晰，便于观察。
12封片：切片染色后用胶类物质将其封固，以利于长期保存。
2切片技术的应用2.1石蜡切片技术的应用石蜡切片虽然是经典的方法但随着新的仪器和研究技术的不断问世，出现了与其他新的技术方法相结合，从而开辟了许多新领域[2]，增加了许多新的研究、观察内容，使组织学的观察研究从简单的形态结构深入到各种成分的定性观察，定量计测，使细胞组织的形态、功能及代谢三结合，从而达到定性可靠、定位准确及定量可测，最终阐述了生命活动的最基本规律。
2.1.1三维重建重建技术在阐明生物体组织结构与生理功能之间的关系以及在形态学、比较解剖学、细胞化学定位等领域的研究中有着重要的意义。
早在1958年，Sjostrand就论证了这种方法的可行性和可靠性[3]，是最早报道利用组织切片进行骨二维重建的学者，随后LUCZ也用同样的方法进行了尝试，但是，由于当时的切片技术和计算机技术都较落后，故效果不如人意。
直到2000年Mason[4]再次用同样的方法进行了三维重建。
随着计算机技术的不断发展，这项技术在国际上正在继续进行广泛深入的研究，在国内也引起了广泛的研究兴趣，例如对血管大鼠松质骨、中国虚拟人[5]行切片后三维重建，同时也对方法进行了很多研究。
特别是目前正在研究的“中国虚拟人1号”，表明我国是继美、韩之后世界上第三个用人体切片合成虚拟人的国家。
2.1.2免疫组化组织制片技术与免疫学技术结合构成免疫组织化学技术，利用抗原与抗体的特异性结合原理，检测组织切片中细胞组织的多肽及蛋白质等大分子物质的定性和定位观察研究。
冰冻切片手续简便，制片过程中抗原活性丢失少，但组织细胞形态较差;石蜡切片步骤繁多。
一般石蜡包埋的组织切片用于检测胞浆或核内的抗原，不宜做表面抗原染色，乙醇、丙酮等固定剂对抗原破坏较轻，但结构保存较差。
2.1.3原位杂交随着分子生物学的发展，在Southern blot, Northern blot等分子杂交技术基础上建立了原位杂交技术。
原位杂交技术具有高度的准确性和敏感性，它能在细胞甚至亚细胞的水平上定位特异性核酸分子序列。
因而，这一技术是目前研究分子细胞生物学、发育学等方面的重要手段[6]。
例如，在心肌石蜡切片中检测克山病(KSD) RNA[7],在乳腺癌石蜡切片中检测ER mRNA, PR mRNA[8]，在骨组织石蜡切片中检测整合素R 1-mRNA[9]，在肝组织中检测丙型肝炎病毒RNA[10] 2.1.4原位PCR原位PCR技术是直接在细胞或组织标本上原位扩增目的DNA或RNA片断，并在原位检测其扩增产物的技术，它兼有PCR的敏感性和原位杂交的特异性。
2.1.5组织芯片组织芯片是将成百上千的小组织整齐排列在某一载件上从而组成的微缩组织切片。
该技术利用并行化处理原则、微量化检测的优点，结合分子生物学和形态学原理，具有经济、简便快捷、信息量大的特点，能够在DNA,RNA和蛋白质水平检测基因表达。
2.1.6检测凋亡检测凋亡的方法很多，形态学观察是判断细胞凋亡的基本方法。
可用于体内外细胞凋亡的研究，既可用于组织切片的原位检测，也可对培养细胞通过细胞涂片或切片的检测，特别是在常规石蜡组织切片中，可对凋亡细胞进行原位检测，监测某一或某些处理因素引起体内组织细胞凋亡的动态变化。
2.1.7石蜡包埋组织流式细胞仪DNA含量分析石蜡包理组织切片与流式细胞术结合使用来测量DNA含量及倍体分析。
由于制备样品技术的原因，过去许多流式分析资料仅限于采用鲜组织标本，Hedley等1983年首先报导了FCM 分析石蜡包埋组织切片制备分散细胞悬液技术来进行DNA含量的检测，从组织切片中能获得足够数量的单个细胞，且与新鲜组织分离获得的单个细胞在形态及DNA含量组方图上均极为相似，目前国内也在逐步开展这方面的研究。
