阿尔茨海默病基因治疗实验研究进展

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８０ｌｉｎａｎｄａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ［Ｊ］．ＢｉｄＰｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２００６；５９（３）：２４４－５１．３１ＴｓｏｎｋｏｖａＮＭ，ＢｅｒｔｏｎＯ。ＲｅｎｔｈａｌＷ，以以Ｓｕｓｔａｉｎｅｄｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｃｈｒｏ－ｍａｔｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎａｍｏｍｍｏｄｅｌｏｆｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔａｃ－ｔｉｏｎ［Ｊ］．ＮａｔＮｅｕｒｏｓｃｉ，２００６；９（４）：５１９－２５．３２ＭｕｓｔａｆａＳ，ＷａｌｋｅｒＡ，ＢｅｎｎｅｔｔＧ，ｅｔａＬ５－Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｅｉｌｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙａｆ－

阿尔茨海默病基因治疗实验研究进展ｆｅｃｔｓ叩ａｄａｌｗｏｒｋｉＩｌｇｍｅｍｏｒｙａｎｄｎｅｗｂｏｒｎｎｅｕ岫ｉｎｔｈｅａｄｕｌｔｒａｔｈｉｐ－ｐｏｃａｍｐｕｓ［Ｊ］．ＥｕｒＪＮｅｕｒｏｅｅｉ，２００８；２８（２）：３２３－３０．［２０１０－０１．１６收稿２０１０－０３－２０修回］（编辑曲莉）

孔卫娜孙袢敏张丽霞１苏安英２柴锡庆（河北化工医药职业技术学院，河北石家庄０５００２６）

（关键词】阿尔茨海默病；１３淀粉样蛋白；基因治疗【中图分类号】Ｒ７４９．１６［文献标识码］Ａ［文章编号】１００５－９２０２（２０１０）惦－１１５６－０４

阿尔茨海默病（ＡＤ）主要症状为进行性记忆力和认知力减

退。目前，药物治疗仍是治疗ＡＤ的主要手段，但现在所开发的药剂多为化学合成药，药物作用位点不专一，特异性弱。相

反，采用基因治疗的方法不仅定位准确，作用持续时间长，而且

没有非靶器官的副作用，是一种较为理想的治疗方法。此外，虽然研究证实ＡＤ是一种多病因介导的疾病，但是脑内Ｂ淀粉

样蛋白（Ａｐ）代谢异常造成的Ａｐ片段聚集沉积引发的级联反应是ＡＤ的主要致病原因。Ａ１３的稳态水平依赖于生成、清除

和内流问的平衡，因此，若能通过基因治疗的手段减少Ａ１３生成或上调酶介导的ＡＢ降解，促进受体介导的ＡＢ脑外流，抑制

Ａ１３脑内流，便可有效地治疗ＡＤ。

１降低ＡＢ生成的基因治疗

ＡＢ由分泌酶水解１３淀粉样前体蛋白（ＡＰＰ）产生。体内有仅、Ｂ、．ｙｉ种分泌酶参与ＡＰＰ的降解。ｄ分泌酶的酶切位点位

于ＡＰＰ蛋白中部，避免了完整Ａ１３分子序列的产生，且分解产生的可溶性淀粉样前体蛋白ｄ（ｓｏｌｕｂｌｅａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎｑ，ｓＡＰＰａ）对神经细胞具有神经营养和神经保护作用，是正常人体内ＡＰＰ的主要代谢方式；Ｂ分泌酶使ＡＰＰ裂解成游离的

ｓＡＰＰｌ３及仍结合在膜上的ＣＴＦ９９，ＣＴＦ９９再被１分泌酶水解，生

成Ｐ３和含有３９～４２个氨基酸残基的Ａｐ，Ａｐ（尤其是Ａｐ∞和

Ａ１３啦）聚集形成淀粉样斑块，产生神经毒性。

Ｉ．ＩＡＰＰ基因ＡＰＰ基因突变形成新的酶切位点，易为Ｂ、７分泌酶（尤其是１分泌酶）水解，进而产生大量的ＡＢ柏和ＡＢ啦，促进了淀粉样斑块的形成。用携带ｓｉＲＮＡ的单纯疱疹病毒载

体封闭ＡＰＰ突变基因的表达有效阻断了ＡＤ小鼠海马淀粉样斑块的形成…。

１．２ｎ分泌酶Ｏｆ，分泌酶及１３、１分泌酶两个酶系统对同一底物ＡＰＰ进行竞争。如果ａ分泌酶活性增强，既生成了对细胞

基金项目：河北省教育厅科学研究计划资助项目（Ｎｏ．２００７４３３）ｌ张家口万生医院２河北Ｔ程大学第一作者：孔卫娜（１９８０．），女，博士，讲师，主要从事老年痴呆的发生机制研究。具有营养作用的ｓＡＰＰａ，又减少了Ａ１３的产生，因此提高ｎ分泌酶的活性或表达，利于对ＡＤ的治疗。

仅分泌酶不是单一的蛋白酶，而是一类膜结合蛋白。金属

蛋白酶１０（ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎａｎｄｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ１０，ＡＤＡＭｌ０）具有

Ｏｆ．分泌酶的生物学功能。Ｃｏｌｅｉａｇｈｉ等牡３发现在ＡＤ患者中，ＡＤＡＭｌ０的水平降低，且随疾病的进展，其下降程度增加。通

过转基冈技术，使ＡＤ模型小鼠神经元中适度过表达ＡＤＡＭｌ０基因，ｓＡＰＰｏＬ的分泌增加，淀粉样斑块的生成减少；相反，转染

ＡＤＡＭｌ０突变基因的ＡＤ模型小鼠，脑内淀粉样斑块的沉积加

剧Ｈ】。这些结果在一定程度上提示了ＡＤＡＭｌ０对于ＡＤ具有

潜在的治疗作用。ＡＤＡＭｌ０并非唯一的ａ分泌酶，过表达ＡＤ—ＡＭ９、ＡＤＡＭｌ７或ＡＤＡＭｌ９的细胞，ｓＡＰＰａ的分泌也增加。因

此，它们也是ｄ分泌酶的活性成分之一，但其在ＡＤ治疗中的

潜在作用还需要进一步的研究。

１．３Ｂ分泌酶１９９９年，Ｖａｓｓａｒ等¨’用基因筛选的方法纯化出一种新的、在Ｂ分泌酶位点剪切ＡＰＰ的蛋白酶，称之为ＡＰＰ

的Ｂ位点剪切酶（ｂｅｔａ—ｓｉｔｅＡＰＰ－ｃｌｅａｖｉｎｇｅｎｚｙｍｅｌ，ＢＡＣＥＩ）。细

胞实验显示，将化学合成的针对ＢＡＣＥＩ的ｓｉＲＮＡ转染ＡＰＰ基

因突变小鼠神经元，干扰内源ＢＡＣＥＩ基因的表达，Ａ１３的生成下降”】。Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等拍’的研究也发现ＢＡＣＥＩ基因敲除的ＡＤ模型小鼠的大脑ＡＢ沉积显著降低。构建ＢＡＣＥｌｓｉＲＮＡ的慢

病毒表达载体，将载体注射到ＡＤ模型小鼠海马中．小鼠海马

组织ＢＡＣＥＩ的表达显著下降，Ａ１３的生成及淀粉样沉积显著降

低，小鼠的行为学缺陷也得到一定改善¨’。ＢＡＣＥ２和ＢＡＣＥＩ同样具有剪切ＡＰＰ的功能，但它主要在

ＡＢ序列的１９Ｐｈｅ－２０Ｐｈｅ和２０Ｐｈｅ－２１Ａｌａ部位进行剪切，破坏完

整ＡＢ的形成而具有了类似Ｏｆ．分泌酶的作用。ＢＡＣＥ２与ＢＡＣＥｉ相互拮抗，竞争同一作用底物ＡＰＰ，从而抑制Ａ８的生

成。用慢病毒载体介导ＢＡＣＥ２基因转染ＡＤ模型小鼠，ＢＡＣＥ２

在神经元内高表达，小鼠脑内Ａ１３的沉积显著降低”】。

１．４．ｙ分泌酶１分泌酶是一组复杂的多亚基复合体，早老素

（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ，ＰＳ）１和ＰＳ２为同源异构体，是１分泌酶的组分之一。ＰＳＩ和ＰＳ２基因突变可使Ａ１３。：的水平选择性升高。ＡＰＰ、

ＰＳＩ和ＰＳ２基凶突变被认为与早发型ＡＤ密切相关。除Ｐｓ是

万方数据孔里塑笠匝筮苤攫熬遁基固渔痘塞验受塞进星笠§翅

１分泌酶复合体组分外，还有Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ（Ｎｅｔ）、ＡＰＨｌ和ＰＥＮ２，任一组分表达水平下调均将导致．ｙ分泌酶复合体形成障碍。例

如，用ｓｉＲＮＡ抑制细胞ＰＳＩ的表达，１分泌酶活性下降的同时，

细胞中ＡＢ们的生成也显著降低‘＂。＾ｙ分泌酶的相关研究为ＡＤ基因治疗提供了新的靶点，但其仍有待于深人的研究。

２加速Ａ８降解的基因治疗

降解Ａ１３的酶有很多种，主要是脑啡肽酶（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ，ＮＥＰ）、内皮素转化酶（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ，ＥＣＥ）和胰

岛索降解酶（ｉｎｓｕｌｉｎｄｅｇｒａｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅ，ＩＤＥ，也称ｉｎｓｕｌｙｓｉｎ）。此

外，还有纤维蛋白溶酶（ｐｌａｓｍｉｎ）、组织蛋白酶Ｂ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＢ，ＣａｔＢ）等。

２．１ＮＥＰＮＥＰ属中性Ｍ１３Ｚｎ金属蛋白酶家族，是位于脑神经轴突和突触膜上的Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要在黑质纹状体通路

表达，海马和大脑皮质也有表达。ＮＥＰ的催化位点暴露在细胞

外，是脑中细胞外不溶性ＡＢ的主要降解酶。ＮＥＰ水平及活性的降低会导致５１３的沉积，促使ＡＤ的发生。研究发现，随年龄

的增长，ＮＥＰ的表达下降。ＡＤ患者大脑皮层和海马处ＮＥＰ的活性和水平也姥著降低¨…。用慢病毒载体、腺相关病毒载体

或单纯疱疹病毒载体将ＮＥＰ基因导入ＡＤ模型小鼠脑中，湿著

降低脑内ＡＢ水平，减少淀粉样斑块的沉积，降低氧化应激和炎症反应，抑制海马和额叶的神经病变，提高了ＡＤ小鼠的空间识别能力¨川。

２．２ＥＣＥＥＣＥ也是Ｍ１３Ｚｎ金属蛋白酶家族的一员，参与脑

内Ａｆｔ的降解。细胞学研究显示，抑制ＥＣＥ的活性，Ａ１３的聚集增加；ＥＣＥ过表达，Ａ１３的聚集减少。动物实验研究显示，ＥＣＥ基因缺失的小鼠脑内ＡＢ的水平升高¨纠；相反，将表达ＥＣＥ的

重组腺相关病毒注射到ＡＤ模型小鼠大脑皮层及海马中，注射

部位ＡＢ水平显著降低¨“。

２．３ＩＤＥＩＤＥ位于神经元细胞膜上，主要参与细胞内可溶性

ＡＢ单体的降解。随年龄增长，脑ＩＤＥ的水平逐渐下降。敲除

ＩＤＥ基因，小鼠脑中Ａｐ的降解下降，脑内ＡＢ水平显著升高。ＩＤＥ基因缺陷也将导致ＡＤ患者皮层微血管ＡＢ累积，形成脑

淀粉样血管病变。通过转基因技术使ＡＤ模型小鼠脑ＩＤＥ的

表达增加了约２倍，显著降低脑ＡＢ的水平，延迟或完全预防脑中淀粉样斑块的形成¨“。

２．４ＰｌａｓｍｉｎＰｌａｓｍｉｎ介导的酶解过程除了在纤溶、细胞迁移

等病理生理过程发挥作用外，也参与脑内Ａ１３的降解。有活性

的ｐｌａｓｍｉｎ是由组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉ－

ｖａｔｏｒ，ｔＰＡ）和尿激酶型纤溶酶原激活剂（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ—ｔｙｐｅｐｌ吩

ｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｕＰＡ）催化没有活性的血纤维蛋白溶酶原

（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）而形成的。在ＡＤ模型小鼠脑中可见ｔＰＡ和ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ共同表达于淀粉样沉积部位，对Ａ８。：降解起到了重

要的作用。但在ｐｌａｓｍｉｎ基因敲除小鼠脑中并未观察到内源性Ａ１３水平的升高，推测ｐｌａｓｍｉｎｎｒ能在Ａ１３聚集发生以后才发挥降解作用¨５１。在ＡＤ患者或ＡＤ模型动物脑内。ｐｌａｓｍｉｎ的表达

与正常个体相比均显著降低。而用ｕＰＡ或ｔＰＡ和ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ联合应用均可显著降低ＡＤ模型小鼠脑内Ａ８的沉积及淀粉样

斑块的形成，为治疗ＡＤ提供了新的策略¨６’１７］。・１１５７・

２．５ＣａｔＢＣａｔＢ也可以降解邮，尤其是Ａ％。抑制ＡＤ模型小鼠ＣａｔＢ基因的表达，ＡＢ。：的表达升高，淀粉样沉积加剧。用慢病毒介导ＣａｔＢ基因转染老年ＡＤ模型小鼠，湿著降低了已有

的ＡＢ沉积‘俘’。ＣａｔＢ具有抗淀粉样沉积和保护神经作用。

３加速Ａ１３转运的基因治疗脑内Ａ８的转运清除包括血脑屏障（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒ，ＢＢＢ）转运和经非特异性脑间质液泵流到脑脊液后进入血液清

除。脑内绝大多数的５１３是经ＢＢＢ途径转运出脑，１０％一１５％

的Ａｐ由脑间质液泵流清除。可溶性ＡＢ通过ＢＢＢ，是由受体介导的跨膜转运完成的：低密度脂蛋白受体相关蛋白（ＬＲＰ）和

Ｐ糖蛋白（Ｐ．ｇＰ）介导可溶性ＡＢ由脑转运至血液，进而转移至肝脏降解；晚期糖基化终产物受体（ＲＡＧＥ）介导ＡＢ经血液由外周转运至大脑。

３．１ＬＲＰ胞外可溶性Ａ１３与血管内皮细胞表达的ＬＲＰ结合，经转胞作用过ＢＢＢ进入血液循环；脑内可溶性ＡＢ通过脑

间质液进入脑脊液同样需要ＬＲＰ的介导；血清中还存在一种可

溶性的ＬＲＰ（ｓＬＲＰ）可以结合血清中７０％一９０％的ＡＢ，抑制血液中的５１３进入脑内。ＡＤ患者或ＡＤ模型小鼠脑微血管ＬＲＰ的表达与正常个体相比显著降低ｕ…。ＬＲＰ基因缺失或表达量

降低，造成ＡＤ模型小鼠脑６１３沉积加剧，神经功能损伤加强。因此，增加血管内皮细胞ＬＲＰ的表达或外周血液ｓＬＲＰ的含

量，可有效降低脑中Ａ１３的积聚，为临床治疗ＡＤ提供了一条新的途径。２００７年，Ｓａｇａｒｅ等Ⅲ’利用重组型ｓＬＲＰ．Ⅳ对ＡＤ模型小鼠进行治疗，显著降低了血管壁和脑中Ａ８的沉积，改善了

ＡＤ小鼠的学习记忆能力。

３．２Ｐ—ｇｐＰ—ｇＰ是一种膜结合蛋白，属于转运蛋白ＡＴＰ结合物（ＡＢＣＴ）超家族成员之一，由ＭＤＲＩ基冈编码。Ｐ－ｇｐ分布广

泛，在担负重要生物屏障作用的脑毛细血管内皮细胞和肠上皮