淋巴细胞培养条件及常见失败原因探讨

・诊断技术・淋巴细胞培养条件及常见失败原因探讨遵义医学院附属医院肾病风湿科(563003)　刘春梅　赵士启　张克非　陈忠霞　刘　永 淋巴细胞培养是实验研究常用的一项技术,对于培养器皿,可以选用培养板,培养瓶,培养皿,三角烧瓶,试管,青、链霉素小瓶等[1,2]。目前,关于淋巴细胞分离方法的文献资料较多,论述较详细,而对淋巴细胞培养则论述较少,较简单。细胞培养工作十分繁琐,环节较多,探讨细胞培养的条件,对于成功培养细胞具有十分重要的意义。本文选用1.5ml离心管培养淋巴细胞,观察了淋巴细胞培养前后的变化,探讨了淋巴细胞培养的条件及失败的常见原因。现报道如下。1　材料与方法1.1　主要材料和设备　淋巴细胞分离液(上海试剂二厂):RPMI1640培养液(Gibco,华美生物工程公司进口分装);血清(各实验对象的自身血清);肝素溶液(250U/m1),D’—Hanks液,lmol/L盐酸,516%氢氧化钠溶液,2%台盼蓝染液,均为本实验室自配;pH试纸(上海三爱思试剂有限公司);1.5ml离心管(Axygen);10ml、15ml、50ml刻度离心管;毛细吸管;移液枪,1～200μl、1000μlTip(枪头);洁净工作台(月坛牌,北京冠鹏净化设备有限公司);HC—TPⅡ-5架盘药物天平(上海第二天平仪器厂);水平式低速离心机(北京医用离心机厂);kx—21N血细胞自动分析仪(Sysmex,日本):OLYMPUS倒置显微镜;ShelLABCO2恒温培养箱(37℃,5%CO2)(Sheltonmanufac2turing,inc,USA);BCD—218冰箱(澳柯玛);202-2型电热恒温干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)。1.2　研究对象　为2003年3～8月住本院肾内科的部分病人。其中,原发性肾病综合征患者18例(男10例,女8例),年龄15～53岁(平均31.28±11.83岁);慢性肾小球肾炎患者11例(男8例,女3例),年龄18～49岁(平均38.00±8.83岁)。所选病例均符合内科学第五版的诊断标准[3]。初发者未使用过激素和其他免疫抑制剂治疗,复发者至少停用激素4周以上。另外选取10例正常人作为对照组,其中男6例,女4例,年龄28～35岁(平均30.60±2.84岁)。正常人采血前3周无感染史及免疫抑制剂用药史。1.3　方法1.3.1　标本的采取　每一研究对象于早晨空腹采静脉血10ml,其中4ml不抗凝,自然凝固20min,2000rpm离心5～10min,收集血清用于培养。另6ml肝素抗凝,用于提取淋巴细胞。1.3.2　淋巴细胞的分离与培养　淋巴细胞的提取参照文献[4]并略加改进,将抗凝血与D’Hanks液对倍稀释后用Ficoll密度梯度离心法提取淋巴细胞,经洗涤2次后,加入定量D’Hanks液,混匀,取0.1ml用血细胞自动分析仪计数,计算出提取的总细胞数。然后离心弃掉D’Hanks液,加入一定量的RPMI1640培养液(不含双抗,即青霉素和链霉素)和自身血清,混匀,使血清终浓度为15%～20%,细胞浓度在1×106～1×107/ml之间。取0.1ml用血细胞自动分析仪计数,淋巴细胞提取率在80%～95%之间。并取少许用台盼蓝染色,记数活细胞不低于95%。然后加入1.5ml离心管中,每管加0.1～0.3ml,盖紧离心管,置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中孵育72小时。在培养过程中,每隔8小时轻轻晃动离心管一次。孵育72小时后,用血细胞自动分析仪计数并计算每培养管的细胞总数。1.3.3　统计学处理　用SPSS11.0统计软件处理,所有数据用均数±标准差(󰁡x±s)表示,显著性检验用配对t检验,P<0.05为有统计学意义。2　结　果提取的淋巴细胞用1.5ml离心管培养,细胞生长状况良好。正常人、原发性肾病综合征、慢性肾小球肾炎患者各自的淋巴细胞培养72小时后,与培养前比较,差异无显著性(P>0105,见表1)。表1　各组培养前后淋巴细胞数(×105/管)比较例数培养前培养72h后P肾　病1831457±2194241060±21947>0105肾　炎1131100±1112731633±11704>0105正常人1021050±0144621233±01446>0105合　计3921664±1152431040±11712>0105・057・GuizhouMedicalJournal,2004,Vol.28,No.83　讨　论311　培养条件31111　严格无菌操作　对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、仪器的消毒,均应严格按照有关细胞培养的参考书的要求进行操作,如张卓然主编的《实用细胞培养技术》[5]。无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可松懈。3.1.2　培养器皿的选择　淋巴细胞培养既可选择培养板(24、48、96孔)、培养瓶,也可选择三角烧瓶、试管等器皿进行培养。我们研究发现,提取的淋巴细胞用1.5ml离心管培养72小时,细胞生长状况良好,细胞数与培养前比较,差异无统计学意义(P>0.05)。我们用青霉素小瓶进行培养,淋巴细胞生长也非常好。我们认为,对散在的细胞培养来说,用小器皿具有以下优点:(1)便于操作:1.5ml离心管为一次性使用,青霉素小瓶可反复刷洗,而培养板、培养瓶价格偏贵且用过几次之后,便有些模糊不清,尤其是塑料的。更为重要的是,淋巴细胞培养为悬浮培养,在培养过程中需要不断晃动,而大多数实验室没有恒温摇床。我们发现,在培养过程中每隔6～8小时晃动一次培养器皿,便可解决这个问题。青霉素小瓶、1.5ml离心管晃动起来相对容易些。(2)减少污染:因为淋巴细胞培养的液体量较少,一般为100～200μl,故文献资料中多见用培养板(48、96孔),少见用培养瓶。对分散的淋巴细胞培养,一方面一次用不了那么多孔,另一方面一旦一孔有污染,其他孔便有可能被波及,使其他孔的培养也失败。而且,晃动培养板时,很容易使液体溅到培养板盖上,增加污染的机会。而使用青霉素小瓶、1.5ml离心管等小器皿便可避免这些现象,但缺点是不易观察细胞生长,需取样加到载玻片上观察。3.1.3　血清　淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生产厂家。但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计更严密。我们发现,血清浓度在15%～20%时细胞生长比较好,当超过30%时反而不利于细胞生长。3.1.4　pH值　细胞生长的最适pH为7.0～7.2,可忍耐的pH范围为6.6～7.8,当pH低于6.8或大于7.6时,都会抑制细胞生长[1,4]。我们发现,RP2MI1640培养基加入血清后pH值一般升高0.2～0.4,故配1640培养液及其他用液时使pH值达到7.2比较合适,并且需经常检测pH值。3.1.5　培养空间　培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以1∶10为宜,培养液液面高度最好维持在2～5mm的范围,以便于气体交换[1]。3.1.6　恒温培养箱　温度应维持在37℃,CO2浓度为5%,O2为95%,100%的饱和湿度。3.2　常见失败原因　我们在2003年2～11月的淋巴细胞培养期间出现过多次培养失败,其原因简单归纳如下。3.2.1　污染　污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响较小,尤其只培养72小时。一般是分离过程中的用液和培养基出现了污染。3.2.2　pH值　过高或过低,或培养过程中瓶塞不紧,CO2逸出,导致pH值上升。3.2.3　诱导剂　淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)、白细胞介素2(IL-2)、植物血凝素(PHA)、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。须注意它们的浓度及是否失效。3.2.4　培养器皿洗涤不干净　有蜡、油污或酸残留。3.2.5　培养用液含有杂质　配制过程中所使用的各种溶液必须用三蒸水,若含有Fe、Ca等离子及杂质,可影响细胞的增殖[6]。3.2.6　接种的细胞数目过多或过少,或提取的淋巴细胞中混有大量红细胞[7]。3.2.7　血清质量不佳。3.2.8　恒温培养箱的CO2、温度等不稳定。3.2.9　存在个体差异　我们发现,在相同条件下,某一受试者的血培养不成功,而对照实验培养结果正常,其原因有时无法查出。我们还发现,淋巴细胞的生长情况,还与受试对象的年龄有关,青年人的淋巴细胞比中、老年人的生长得要好。参考文献1　薛庆善,主编1体外培养的原理与技术1北京:科学出版社,2001187～102.2　蔡文琴,主编1现代实用细胞与分子生物学实验技术1北京:人民军医出版社,2003111.3　叶任高,主编1内科学1第五版1北京:人民卫生出版社,20011529,537.4　薛庆善,主编1体外培养的原理与技术1北京:科学出版社,20011590～59315　张卓然,主编1实用细胞培养技术1北京:人民卫生出版・157・贵州医药2004年8月第28卷第8期社,1999111～2716　罗德生,马涧泉,顾熊飞1Ca2+/CaM在植物血凝素促淋巴细胞分裂中的分子调节机理(-)Ca2+对PHA有丝分裂原活性的影响1医学新知杂志,1995,5(2):53～5617　肖玉华1改良的人体外周血淋巴细胞的培养与染色体标本的制作技术1第三军医大学学报,1994,16(6):4501老年人慢性硬膜下血肿的CT诊断 贵阳中医学院第二附属医院放射科(550003)　何职应　刘吉刚 慢性硬膜下血肿是老年人的一种常见病,占颅内血肿的10%左右。由于大多数病人头部外伤比较轻微,未引起患者注意或被遗忘。有部分病人没有明确的外伤史,加之临床症状又不典型,发病较缓慢,容易造成误诊。本文收集了2001年11月至2004年2月经手术、病理及CT诊断资料完整的22例老年人慢性硬膜下血肿进行总结分析,以便进一步提高对本病的认识。1　材料与方法1.1　一般资料　本组22例中,男性20例,女性2例。年龄60～92,平均年龄为72.5岁。病程1个月～2年不等,平均5个月。有外伤史4例,无明确外伤史18例。主要症状:反应迟钝、记忆力减退,意识障碍8例,轻微持续性头痛、头晕4例,剧烈头痛、恶心呕吐2例,偏瘫2例,肢体无力4例,癫痫1例。13例有高血压病史。1.2　方法　采用GE—PorspeedAI全身螺旋CT扫描,以OM为扫描基线,层厚、层间距均为10mm。22例均行CT平扫,5例行增强扫描。经肘静脉快速推注对比剂(非离子型对比剂碘海醇50ml)后扫描。2　结　果2.1　慢性硬膜下血肿部位　血肿位于额顶部6例,顶部2例,额颞顶部4例,额部3例,颞部2例,枕部1例。双侧血肿8例,其中双侧额部2例,双侧额顶部3例,双侧额颞顶部2例,双侧颞顶部1例。2.2　慢性硬膜下血肿的CT表现　(1)颅骨内板下新月形、梭形或双凸透镜形异常密度影。其中低密度12例,等密度3例,混杂密度7例。(2)脑室、脑池、脑沟的改变:双侧脑室受压、变形3例,单侧脑室受压变形6例,同时伴有脑中线结构的移位,22例均表现为患侧灰白质交界内移,局部脑沟变浅或消失。2.3　CT增强扫描　5例行CT增强扫描,可见血肿包膜呈点状或线状强化,以及脑皮质下静脉强化,并有移位改变,血肿本身无强化。3　讨　论3.1　慢性硬膜下血肿是指外伤后3周以上,是亚急性硬膜下血肿的延续。但老年人慢性硬膜下血肿通常只有轻微外伤史或无明确外伤史,不伴脑挫裂伤。其出血可能与老年性脑萎缩的颅内空间相对增大有关,遇到轻微惯性力作用时,脑与颅骨产生相对运动,使进入静脉窦的桥静脉撕裂而引起出血[1]。血液缓慢溢入硬膜下腔,引起硬脑膜内层炎性反应形成包膜。由于血肿液化,蛋白质分解,引起囊内渗透压增高,脑脊液自蛛网膜下腔渗入囊内,加之包膜血管的血浆渗入,进一步增加了囊内的渗透压,以至血肿体积不断增大,血肿常常遮盖额、颞、顶叶的表面,脑组织受压。由于慢性压迫使脑供血不足和脑萎缩更加显著,造成此类病人的颅内压增高程度与血肿大小不成比例。数月或数年后包膜尚可有增厚,甚至钙化[2]。3.2　慢性硬膜下血肿的CT表现　由于形成时间的不同,大小、形态、密度各异及脑组织受压的程度,其CT表现不同。沈天真等认为[3]血肿形态是随着血肿的期龄而变化的,开始为新月形,经由过渡变为梭形或双凸透镜形,再变为过渡形和新月形,最终被吸收消失。根据血肿的大小、形态不同,病侧脑组织、脑室可有不同程度的受压变形和移位,增强后血肿包膜呈线状或点状强化,同时伴有脑灰白质界面内移改变。慢性硬膜下血肿以低密度为多见,CT值为12～20Hu,其次为等密度血肿,CT值为30～40Hu,由于血肿周围纤维包膜形成,血红蛋白溶解,使囊内渗透压增高,脑脊液通过包膜渗入血肿,血肿的密度也随之降低,形成等密度或低密度。混杂密度的血肿上部分是低密度,下部分是高或等密度,还有的内・257・GuizhouMedicalJournal,2004,Vol.28,No.8