下载文档原格式
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在桌子上，我拿起笔，准备写下这个实验方案。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察，这是一个既熟悉又充满挑战的课题。
就让我以意识流的方式，带你走进这个神秘的实验世界。
一、实验目的1.了解人体外周血淋巴细胞染色体的基本结构。
2.学习并掌握染色体制备与观察的方法。
3.分析染色体形态，探讨其在遗传研究中的应用。
二、实验原理1.人体外周血淋巴细胞具有分裂能力，可进行有丝分裂。
2.通过特定染色方法，使染色体着色，便于观察。
3.利用显微镜技术，观察染色体形态和结构。
三、实验材料1.人体外周血：新鲜、无污染。
2.染色剂：吉姆萨染液、醋酸洋红染液。
3.试剂：肝素钠、氯化钠、磷酸缓冲液。
4.实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、离心机、移液器、吸管、计时器等。
四、实验步骤1.采集外周血：抽取2ml静脉血，加入含有肝素钠的抗凝管中，轻轻摇匀。
2.制备淋巴细胞悬液：将抗凝血置于离心管中，加入适量氯化钠溶液，1500r/min离心10分钟，弃上清，重复洗涤2次。
加入适量磷酸缓冲液，重悬细胞。
3.染色：取适量淋巴细胞悬液，滴加吉姆萨染液或醋酸洋红染液，染色5-10分钟。
4.制片：将染色后的细胞悬液滴在载玻片上，用盖玻片覆盖，轻轻压实。
5.观察染色体：将制片置于显微镜下，调节光线和倍数，观察染色体形态和结构。
6.记录结果：记录观察到的染色体形态、数量、排列等信息。
五、实验结果分析1.染色体形态：观察到的染色体呈棒状或X形，颜色鲜艳。
2.染色体数量：正常人体外周血淋巴细胞染色体数为46条。
3.染色体排列：有规律地排列成2个染色体组。
4.遗传研究应用：通过染色体分析，可研究遗传病、肿瘤等疾病的发生机制。
六、实验注意事项1.采集外周血时，要确保无污染。
2.制备淋巴细胞悬液时，要充分洗涤，去除红细胞和血浆。
3.染色过程中，要控制好染色时间，避免过染或欠染。
4.观察染色体时，要调节好显微镜光线和倍数，确保清晰。
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析一、实验目的（1）、熟悉淋巴细胞体外培养原理。
（2）、掌握人体微量血液体外培养技术。
（3）、通过本次实验掌握制备染色体标本的方法。
（4）、观察人类染色体的形态，并计数、配对、分类和绘图。
（5）、培养学生的自主能力，锻炼学生的动手操作能力。
二、实验原理外周血液中的小淋巴细胞几乎都处在G1期（或Go期）一般情况下是不再分裂的在培养液中加入植物凝血素 (PAH) 时这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞随后进入有丝分裂。
这样经过短期培养秋水仙素的处理低渗和固定就可获得大量的有丝分裂细胞。
本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
染色体是组成细胞核的基本物质, 是基因的载体。
人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。
本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。
在正常情况下, 人外周血中是没有分裂相的, 只有在异常情况下才能发现。
植物血细胞凝集素(PHA) 是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在 PHA 作用下, 原处于 G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞, 进而进行有丝分裂。
利用 PHA 这一特性, 淋巴细胞经过含有 PHA 培养液培养, 在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体, 终止分裂中期的淋巴细胞, 经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的中期有丝分裂细胞。
最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本。
即可得到所需的人体染色体图形。
染色体组型，又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
第四大组实验方案外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1.了解动物细胞培养的方法。
2.掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
3.学会对人类染色体的组型分析。
二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
经过短期的培养后，用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理细胞，使细胞胀大而不破裂使最后的子染色体充分散开，滴片后再以空气干燥法制片，可获得质量较好的染色体标本。
人类外周血细胞几乎都处于G0期和G1期，一般情况不分裂，但在离体培养中，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，可转变成可分裂的转化细胞。
核型是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
正常的核型能代表个体的核型。
组型是以模式图的方式表示，它是通过多许多细胞染色体的测量取其平均值制成的，是理想的、模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
染色体的特征以中期最为显著，所以一般都都分析中期分裂相，根据染色体着丝粒位置的不同，可将染色体分为中部着丝粒染色体（m），亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝粒染色体（st），端部着丝粒染色体（t）。
对任何一个染色体的基本形态，重要参数有3个：1.相对长度，指单个染色体长度与包括X与Y染色体在内的单倍染色体总长之比，用百分率表示。
2.臂指数，指长臂同短臂的比率。
按Levan（1964）的划分标准，臂指数在1.0~1.7之间的称中部着丝粒染色体；臂指数在1.7~3.0之间称亚中部着丝粒染色体；臂指数在3.0~7.0之间称亚端部着丝粒染色体；臂指数在大于7.0者称端部着丝粒染色体3.着丝粒指数，指短臂占该染色体长度的比，用百分率表示。
他决定着丝粒饿相对位置。
按Levan（1964）的划分标准，着丝粒指数在50%~37.5%之间称中部着丝粒染色体；指数在37.5%~25.0%之间称亚中部着丝粒染色体；指数在25.0%~12.5%之间称亚端部着丝粒染色体；指数在12.5%~0.0%之间者称端部着丝粒染色体。
107
第 30 卷第 1 期2012 年 2 月广东医学院学报
JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE V ol. 30 No. 1Feb. 2012
实验教学是高校教学的重要组成部分，在培养了使学生更好地了解和掌握消毒灭菌知识和技能，学生分析和解决问题能力、培养严密的思维方法和通过在PPT 上讲解后，再由带教老师用实物进行操踏实肯干的工作作风等方面具有不可替代的作用。
作演示。
这个过程加强了学生的无菌操作意识，树要使实验室成为推行素质教育、培养学生创新精神立学生的无菌概念。
和实验能力的主要阵地，必须突破传统的教学观念 1.2 通过实际操作，培养学生动手实践的兴趣，确和教学模式，探讨不同层次、具有特色的、多样化立严格的无菌操作观念
的实验教学方法。
《医学遗传学》是高等医学院校在经过适当改装后的实验室里，带教老师向学的一门必修课，外周血淋巴细胞培养和染色体制备生讲解细胞培养基的配制方法及要求后，由学生自是这门课程的重要实验教学项目之一，是综合性实己操作。
配制培养基是实验的重要环节之一，要求验项目。
该实验包括灭菌技术、培养基配制、采血在无菌条件下操作。
以往因为实验室条件所限，必接种、细胞培养、收集细胞制备标本、Ｇ显带处理
须用预先在无菌实验室里配制好的培养基给学生做[1-2]
和镜下观察分析等内容，实验过程繁琐，耗时实验，如果使用市售的培养基则成本费用高，并且长。
根据目前学生人数多以及本实验的特点，我们学生都没有动手的机会。
由于配制培养基是一项细进行了以下教学方法的探索和改进：微且繁琐的实验过程，一旦失败则后面的实验无法进行，要求带教老师把每一个细小的环节都仔细向1 多种实验手段结合，使繁琐的实验简单化学生交代清楚，包括一些操作的动作要领和容易出现的问题。
有些学生会忘记按无菌操作要求用酒精1.1 运用现代教学手段，了解实验中使用器械、物灯高温消毒试管口和玻璃器皿，或者忘记消毒玻璃品的清洗消毒灭菌程序
安培，教师要预先强调并密切观察学生的操作，及由于学生初次接触本实验使用的仪器设备和试时纠正其错误，避免培养基被污染。
学生们通过自剂，例如CO 培养箱、抽滤器、培养基(所需的药品2己动手配制培养基，了解了细胞培养的实验过程，及试剂)和秋水仙素、离心机、显微镜及玻璃器皿认识了每个操作环节的重要性，培养了高度的责任等，感到非常的陌生，因此我们应用多媒体教学手心和严谨的科学态度。
段介绍它们的作用、原理和正确的使用方法，让学 1.3 开放实验室，使每个学生参与整个实验过程，生容易理解和掌握。
激发其学习兴趣
外周血淋巴细胞培养是在体外条件下的细胞培在完成了以上实验课后，根据实验要求分2次安养技术，整个过程必须在严格无菌条件下进行，对排学生回实验室完成以下2个实验步骤。
(1) 采血接实验所需的器皿(如烧杯、量筒、培养瓶、抽滤器、种及培养：在老师的指导下，由学生自己互相采静胶塞等)的消毒灭菌是进行细胞培养最重要及最基本脉血，注入配制好的培养液内进行培养。
让学生互的条件，这个过程包括洗、煮、烤、高压灭菌。
为
相采血进行实验，学生会更加关心实验的结果，更认真地进行后面阶段的实验，激发他们对这个实验的兴趣。
(2) 在收获细胞前4 h ，尚要进行一个很关
摘 要：由于外周血淋巴细胞培养和染色体制备这一实验教学课程耗时长，步骤繁琐，要求学生完成全部实验过程并达到较好的教学效果操作起来不容易。
经过多年的摸索，我们将普通实验室加以改造，采用集中采血、分批分阶段进行实验的方法开展实验教学，结果绝大多数学生均能顺利完成该实验，达到预期的教学效果。
关键词：细胞培养；染色体；实验教学
中图分类号：G 624.4 文献标识码：B 文章编号：1005-4057(2012)01-0107-02DOI: 10.3969/j.issn.1005-4057.2012.01.044
外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备实验教学方法的探索
廖 霞，陈小萍，周汝滨
（广东医学院生物学教研室，广东湛江 524023）
收稿日期：2011-11-12；修订日期：2012-01-30作者简介：廖 霞(1959－)，女，大专，实验师。
108广东医学院学报2012 年第 30 卷
键的步骤：用无菌注射器加秋水仙素。
秋水仙素的的实验仪器设备的准备和实验方法应用多媒体教学作用是破坏细胞的纺锤体，使正在分裂的细胞不能方法讲解，而主要和关键的实验步骤则由学生在老再正常地进入分裂的后期与末期，从而可以积累大师指导下亲自操作。
同时我们根据学生人数多，课
[2]
量的中期分裂相供分析研究。
加秋水仙素必须掌时少且安排分散的特点，采用集中采血，分批分阶握好时间和量，加的量过多或过少都会影响细胞中段实验的方法开展教学。
并且将普通实验室(可容纳期分裂相的收获结果，所以带教老师必须对学生进30多个学生进行实验)加以改进，代替只能容纳2人行示范、训练操作。
我们让学生用注射器和水在其操作的无菌室来完成实验，既节省了课时，又使每他的瓶子里练习加样，熟练后再向自己培养的标本个学生都能动手进行实验。
原来的教学方法是由老瓶内加秋水仙素，确保实验成功。
师在实验课前为学生准备好所有灭菌器皿、配制好
[3-1.4 独立制作标本，掌握实验操作技巧，确保标本培养基、采用大容量集体分组抽血进行细胞培养
4]
质量和收获细胞制片，甚至是只给学生提供已经制备好收获细胞：按常规收获处理(低渗－预固定－的染色体玻片让学生进行镜下读片分析。
这样学生固定2次－滴片)。
在低渗处理过程中对温度、时并不能了解整个实验技术和实验过程，学生的知识间、使用滴管吹打的力度轻重次数都有较严格的要点和动手能力都有不足。
改进后，96%的学生都能求，如果操作不当，就不能获得最佳的细胞分裂在老师指导下自己动手完成从培养液配制、细胞培相；在固定处理过程中，带教老师必须认真讲解和养、收获和制片，然后进行镜下分析的实验操作过示教，要求学生掌握好离心的时间、速度和吸管操程。
这样既激发了学生对该课程的学习兴趣，进一作手势技巧；滴片是用气干法滴片，用吸管吸取细步丰富了学生的相关理论知识，使学生树立起严谨胞悬液，滴于事先用冰水浸泡的洁净载玻片上，用的科学态度，又培养了学生的动手能力，达到理想口吹气，使细胞悬液铺展，并在酒精灯的火焰上慢的教学效果。
慢烤干，制作出常规染色体片。
将制好的染色体片
参考文献：
放置室温进行1周老化，最后进行染色体G显带制作
及分析。
实验的成败在于标本的质量，不管在哪个
[1] 丁显平. 现代临床分子与细胞遗传学技术[M]. 成都：四川
大学出版社, 2002:45-46.
环节出错，都会影响到染色体标本的分析，甚至造
[2] 周焕庚, 夏家辉, 张思仲. 人类染色体[M]. 北京:科技出版成实验失败。
社, 1987:64-778.
2 讨论[3] 倪岚, 余从年, 周光云. 人类染色体标本制备的改进[J]. 生
物学通报, 2000, 35(2):33.
开设这一实验课的主要目的是使学生了解和掌
[4] 穆灵敏, 邢智峰, 张楠, 等. 大体积培养人外周血淋巴细胞制握外周血淋巴细胞培养和染色体制备及分析这一实
备染色体标本[J]. 新乡医学院学报, 2005, 3(22):228-230.验技术和实验过程，理论联系实际，树立无菌概
念。
由于该实验过程繁琐，耗时长，我们先将一般。
