丝素蛋白在组织工程中的应用 - 复旦学报(自然科学版)

第42卷　第6期2003年12月复旦学报(自然科学版)Journal of Fudan University(Natural Science)Vol.42No.6Dec.2003 文章编号:042727104(2003)0620828205Ξ丝素蛋白在组织工程中的应用于同隐,梅　娜,陈　光,周　平,邵正中,陈　新,姚晋荣(复旦大学高分子科学系,聚合物分子工程教育部重点实验室,上海　200433)摘　要:丝素蛋白作为一种具有优良生物相容性的天然高分子材料在生物医用领域有着广泛的应用.着重阐述了丝素蛋白在组织工程领域中应用研究的最新进展.关键词:丝素蛋白;组织工程;支架中图分类号:O636.1+1 文献标识码:A细胞和组织的缺损或衰竭是人类健康中最频繁、最具危害性且花费最高的问题之一.每年有无数的病人因为器官的缺损而死亡.尽管人们已经以器官和组织移植等治疗方法来解决某些问题,但这或多或少都有一定的缺陷.随着细胞生物学、分子生物学、材料科学、临床医学以及生物工程等众多学科的飞速发展,一门全新的交叉学科———组织工程学(Tissue Engineering)应运而生.组织工程一词最早由1987年美国科学基金会提出,具体来说,组织工程是将组织细胞粘附在一种生物相容性良好、并可在人体内逐步被降解吸收的支架材料上,并提供营养使之扩增,在体外形成细胞———生物材料复合物,然后将这种复合物植入肌体内,在支架材料逐步被人体降解吸收的同时,细胞不断增殖并分泌基质,最终形成具有与原来特殊功能和形态相应的组织和器官,从而达到修复创伤和重建功能的目的[1].选择合适的材料作为细胞生长支架是组织工程研究的基础,而作为支架的材料则必须符合以下基本要求[2]:(1)具有足够的机械强度支持细胞分化增生;(2)材料来源充足,易于重复制作,加工成型;(3)良好的生物相容性,其本身及降解产物对细胞和机体无毒性,不会或较少引起炎症和免疫排斥反应;(4)有适度的生物降解速率,且该降解速率需和组织再生的速率相匹配,最后可被完全吸收或安全排出体外;(5)良好的表面相容性,即材料表面具有足够的细胞吸附能力,有利于细胞的粘附和生长.其中支架材料的生物相容性和细胞粘附能力又是至关重要的.目前在组织工程中使用的合成高分子材料,主要是聚乳酸等脂肪族聚酯材料,它们在降解性等方面都基本上能满足支架材料的应用,但在生物相容性和细胞粘附能力方面却远不如天然高分子.因此,天然高分子材料或者天然高分子对合成高分子进行改性后的材料用作支架材料便成为理想的途径之一.1　丝蛋白的性质丝素蛋白(Silk Fibroin,以下简称SF),由蚕茧缫丝脱胶而得到,来源丰富,是一种无生理活性的天然结构性蛋白,主要由三种简单的氨基酸:甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成,它们占蛋白总量的大概85%.丝纤维用于临床上,如用作手术缝合线等,已经有几十年的历史.在多年的应用中,逐渐发现丝纤维和丝素蛋白有更多的潜力应用于临床修复和组织工程支架及作为改性材料,因为它们有着很多优异的条件,例如:丝纤维容易大量得到;而将丝纤维直接溶在中性盐溶液中(例如氯化钙溶液)后,经透析就可以得到纯的丝素蛋白水溶液;丝素蛋白有良好的生物相容性,无毒,无刺激性;由丝引起的炎症反应不会比一般用于缝合Ξ收稿日期:2003207230基金项目:国家自然科学基金资助项目(29974004,20274009)作者简介:于同隐(1917—),男,资深教授,博士生导师.线的材料所引起的大.与此同时,丝的降解性也引起了人们关注.Minoura 等认为,丝素蛋白是可部分生物降解的,其降解产物本身不仅对组织无毒副作用,还对如皮肤、牙周组织等有营养与修复的作用.一般认为,在体内丝会被缓慢吸收,吸收速率受种植地点、力学环境以及其他多种因素的影响,而且还可以通过制作不同结构形态的丝蛋白材料来调节其降解速率[3].丝蛋白正是由于具有上述性质,在生物医用领域得到了日益广泛的应用.而将其用于细胞培养的基质,或对一些生物高分子进行修饰,改善它们的生物性能,使其适用于组织工程,更是近年来丝素蛋白的应用研究的热点.2　在丝蛋白上细胞的生长情况早在1995年,日本的Minoura 等就研究了鼠细胞L 2929在丝蛋白膜上的生长情况,并与其在胶原蛋白上的生长情况加以对比,证明细胞在丝素蛋白膜上的生长速度与在胶原质上的生长速度相当[4].1998年,Minoura 等又进一步研究了不同的人体细胞株在丝素蛋白膜上的生长情况,与在胶原蛋白涂层上以及亲水的聚苯乙烯的生长情况加以对比后发现细胞在丝蛋白和胶原蛋白这两种介质上的生长情况几乎一样,而且都比亲水的聚苯乙烯上的细胞生长情况要好[5].这些研究工作表明,丝蛋白和胶原蛋白一样,能促进细胞的生长,虽说胶原蛋白已经被广泛用作细胞生长的基质,但丝蛋白完全可以作为其替代品.上海医科大学吴海涛等在2000年首次采用蚕丝与软骨细胞进行复合培养,探索了蚕丝作为软骨细胞体外培养支架的可行性[6].他们将胰蛋白酶消化后的蚕丝任意缠绕成网状,用聚乳酸活鼠尾胶进行包埋,制成三维支架,观察软骨细胞生长情况,发现蚕丝对软骨细胞具有良好的吸附作用,并能维持软骨细胞正常形态和功能,是适合软骨细胞立体培养的良好天然支架.Gregory 等则直接将蚕丝纤维用于人工十字韧带(Anterior Cruciate Ligaments ,ACL )的制作[7].他们的方法是将30根单纤维丝组成一股,每6股成一束,再这样3束成一股,6股成一束,然后直接用作ACL 基质.经SEM 、DNA 定量以及胶原含量等测试后的结果显示,这样做成的支架能支持成人BMSCs 细胞的生长和扩散以及分化.他们认为蚕丝纤维具有良好的力学性质,生物相容性以及缓慢的降解性,是制作人工韧带的良好支架材料.在丝上引进磷酸基团时,蛋白纤维就能够吸收钙离子,从而又可用于制造人工肌腱.因为它能够吸附在羟基磷灰石(骨头的主要成分)上,形成很强的结晶.而且,这些经过修饰的丝纤维有良好的拉伸性能.Tsutomu Furuzono 等就使用交替浸泡法使得磷灰石沉淀到丝纤维上,得到这种很有潜力的生物材料[8].David Kaplan 等研究了成骨细胞在蚕丝蛋白上的生长情况[9].他们同时将丝接上R G D (Arg 2G ly 2Asp )等不同的多肽以后的细胞生长情况加以对比,并与细胞在塑料板上的生长情况加以对比.实验结果表明,在丝蛋白以及不同改性的丝蛋白等介质上的细胞生长情况均良好,而对照组的塑料平板上的细胞含量则比较少.总体上来说,R G D 2丝基质从各方面似乎更能促进成骨细胞的生长.所有这些研究工作都表明了丝作为一种良好的细胞生长介质,能促进细胞的生长和繁殖.而且可以通过对丝进行修饰,使得其更适于不同的细胞的生长.但是,人们更希望能将天然生物大分子与合成高分子结合起来,综合利用它们的优良性质,从而得到性能优异的支架材料,以满足在组织工程应用工程中对支架材料的多方面性能要求.运用丝蛋白对一些生物高分子材料进行改性,近年来引起了研究人员广泛的关注.3　用丝蛋白对合成高分子材料修饰后支架应用由于丝蛋白的表面和内部结构性质,使得它成为一种极具潜力的细胞生长的基质材料.但是,有时它的力学性质和体系结构却不容易调节以来满足一些特殊应用的要求,合成高分子材料在这方面有其独特的优势.利用丝蛋白的良好的生物相容性,对合成高分子材料进行表面改性,则能综合利用两者的优势,按照不同的应用目的制备出符合不同要求的复合材料.Petrini 等用SF 来改性聚氨酯(PU )的表面性质,得到二维和三维的可用于组织工程的支架材928第6期 于同隐等:丝素蛋白在组织工程中的应用料[10,11].他们采用浸渍法将丝蛋白涂抹于PU 基质上,然后通过醇处理使其发生构象转变,变成固相,来固定蛋白涂层.细胞生长研究表明:用SF 改性后的PU 对于啮齿动物的细胞吸附能力和增殖能力都得到改善.天津大学的蔡等用化学和物理两种方法将丝蛋白对聚2D ,L 2乳酸(PDLLA )进行改性,并对改性前后的材料的细胞培养情况进行观察[12,13].膜表面的亲水/疏水性将影响到细胞吸附的程度,一般认为,亲水性好的表面更有利于细胞的吸附.接触角的测试结果表明,用两种方法的SF 改性后的PDLLA 的表面接触角比改性前的要小,说明改性后材料的亲水性得到了改善.ESCA (表面元素含量分析)测试表明改性后的膜的表面富集了氮原子,这是由于SF 的氨基基团和酰氨基团造成的.材料的最表面直接和组织或细胞接触,因此改性后的材料的生物相容性必然和改性前不同.通过M TT 测试,看出吸附在改性后的膜上的细胞数量比没有改性的更多.而且物理改性的PDLLA 膜上细胞的数量要比化学改性的膜上的多,这说明用物理方法改性比用化学方法改性更有利于细胞在材料上的吸附.无论是丝蛋白本身,还是其对合成高分子改性后的材料,都能给细胞的生长带来很好的效果.研究丝蛋白对生物高分子材料的改性以使之更好地应用于组织工程上,具有非常大的理论和实际应用价值.本课题组正尝试用SF 对聚己内酯(PCL )和聚羟基烷酸酯(PHA )进行改性[14,15].由于PCL 和PHA 这些材料有良好的力学性质,但材料表面的生物相容性相对来说不够理想,因此我们希望能通过丝蛋白对其表面进行修饰,改善它们的亲水性,从而增强其生物相容性和细胞吸附能力.初步的实验结果表明:改性后的PCL 和PHA 的亲水性都有明显改善,细胞培养结果也证实改性后的复合支架细胞数量扩增显著,更有利于人胚肺成纤维细胞(HFL 21)的生长繁殖(图1,2).同时,考虑到蛋白的吸附对三维多孔支架孔隙率的影响,尝试用不同浓度的丝蛋白溶液对具有不同孔径的的多孔支架进行改性.细胞培养结果显示,虽然丝蛋白的改性更有利于细胞的吸附和繁殖,但高浓度的蛋白的吸附,会使得多孔支架的孔隙率下降,从而影响细胞在其上的扩展(图3),因此,用蛋白对基质进行改性时,浓度不宜过高.从总体上说,通过丝蛋白的改性,基质材料的亲水性能得到不同程度的改善,从而更有利于细胞的吸附和生长.图1　HFL 21细胞在PCL 2SF 支架上生长不同天数的扫描电镜(SEM )图Fig.1　SEM of HFL 21cells attach and s pread on the scaffold for different daysA 2B :1d ;C :4d ;D :7d ,细胞已经扩散繁殖形成连续的细胞层038复旦学报(自然科学版) 第42卷 通过诸多研究可以知道:表面物理化学性质对细胞2生物材料之间的反应有着很重要的影响,这些影响在某些程度是可以通过改变吸附继而改变它们之间信号而得以调节,这就是表面改性的主要目的.当丝蛋白用于改性时,其将影响到细胞的生长和繁殖,展示了丝蛋白作为生物高分子的改性剂应用于组织工程的广阔前景.但是如何对丝蛋白进行修饰,使得经过修饰的丝蛋白能对特定的细胞有更好的吸附能力,并且如何将丝蛋白更稳定地结合于其他生物医用高分子材料上,仍然需要研究者们不断的探索和研究.图2　PCL和SF改性PCL上细胞培养M TT测试结果Fig.2　M TT assay of cells viability on PCLand SF2modifiedPCL 图3　PHA和SF改性PHA上细胞培养M TT测试结果Fig.3　M TT assay of cells viability on PHAand SF2modifiedPHA 参考文献:[1]　Langer R,Vacanti J P.Tissue engineering[J].Science,1993,260(5110):9202926.[2]　Hutmacher D W,Schantz T,Zein I,et al.Mechanical properties and cell cultural res ponse of polycaprolactonescaffolds designed and fabricated via fused de position modeling[J].J Biomed M ater Res,2001,55:2032216.[3]　Altman G H,Diaz F,Jakuba C,et al.Silk2based biomaterials[J].Biom aterials,2003,24(3):4012416.[4]　Minoura N,Aiba S,G otoh Y,et al.Attachment and growth of cultured fibroblast cells on silk protein matri2ces[J].J Biomed M ater Res,1995,29:121521221.[5]　Inouye K,Kurokawa M,Nishikawa S,et e of Bombyx mori silk fibroin as a substratum for cultivationof animal cells[J].J Biochem Biophys Methods,1998,37:1592164.[6]　吴海涛,钟翠平,顾云娣.蚕丝在软骨细胞立体培养中的应用[J].组织工程,2000,14(5):3012304.[7]　Altmana G H,Horan R L,Lu H H,et al.Silk matrix for tissue engineered 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～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～顾翼东与包头稀土资源的发现邱德仁,程晚霞(复旦大学化学系,上海　200433)顾翼东先生由于研究稀有元素的需要,常常到光谱实验室来.在上个世纪50年代末60年代初,光谱室已经拥有大型光谱仪、中型光谱仪,CΦ24紫外可见分光光度计等仪器.当时有这么多世界级最先进的分析仪器的实验室,国内是很少的.有一次,顾先生(我们都这样称呼他)带了1袋牛皮纸袋的样品到光谱室来.告诉我们,包头钢厂是苏联援建的,钢渣全部运到苏联去.现在苏联撤走了专家,钢渣不运了,做了抽水马桶,别的钢渣做的全都退了回来,指定要这种产品.这里面一定有宝.嘱咐我们快点分析出结果,报告国家.我们做分析时,顾翼东先生总是亲自到场,直到做出结果含有大量的稀土和铌钽锆铪稀有金属.顾翼东先生很高兴,不断地说:“蛮好、蛮好.”又对我们说:“你们为国家做了件好事.”顾翼东先生为世界上最大的稀土矿资源的发现做了件好事.顾先生同我们一起做实验时,问我们为什么有的光谱线细,有的光谱线粗,当时我们回答不出来.他的提问启发了我们,20年后,我们发表了一篇论文《稀土元素谱线超精细结构的间隔性规律》,回答了顾先生的提问.顾先生又说:“这么多密密麻麻的谱线,你们用土法自制的图谱完成了分析,真不容易.你们要编一套世界上最详细的图谱,出版出来.”过了20年,我们花了3年时间编了1套有一万多条谱线的世界上最详细的大色散高分辨率图谱,实现了顾翼东先生的期望.上海科技出版社出版后,我们送去1套到顾翼东先生手上.顾先生对我们说:“你们终于做到了,蛮好,蛮好,祝贺你们.”顾翼东先生是我们尊敬的师长,我们怀念他.。