健脾益智法对多发梗塞性痴呆大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶活性的影响

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实验研究论著健脾益智法对多发梗塞性痴呆大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶活性的影响于晓艳纪立金林若勤李奕祺福建中医药大学福州350308摘要:[目的]探讨健脾益智法治疗多发梗塞性痴呆(MID)的作用机制。

[方法]运用灌服小承气汤以及栓子注入的方法制作M ID 大鼠模型,检测比较各组大鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶(AchE)活性。

[结果]中药组大鼠脑组织中AchE 活性明显降低,与手术组比较差异非常显著(P <001),与假手术组及西药组比较差异显著(P <005)。

[结论]健脾益智法可以明显降低大鼠脑组织中AchE 活性,从而改善中枢胆碱能神经系统的功能,起到治疗MID 的目的。

关键词:痴呆;多发性梗塞;中医药疗法;健脾益智中图分类号:R74333文献标识码:A文章编号:10055509(2010)06081903Effect of the Therapy by Strengthen the Spleen to Enhance Intelligence on the AchE Activity in Rats Br ain with MID Yu Xiaoyan,Ji Lijin,Lin Ruoqin,et al F uj ia n Univer sity of T ra ditional Chinese Medicine,College of T CM,F uz hou(350308)Abstr act:[Object ive]To explor e the mechanism of the therapy by str engthening t he spleen t o enhance intelligence in tr eatment of M ID.[Methods]The MID r ats model was made by administr ation of Small Chengqi Decoction and injection of emboli into the in ter nal carot id ar tery.T he activity of AchE in the rat s brain of differ ent gr oups was detected and compar ed.[Results]T he AchE activity of the Chinese mater ia medica gr oup was significantly reduced,compar ed with that of the operation group,it had highly significant difference,while compared with that of the sham operation group and the wester n medicine group,it had significant differ ence.[Conclusion]The therapy of strengthening the spleen to enhance intelligence can r educe AchE activity in r ats brain,so the function of choliner gic centra l nervous system was improved.It had the therapeut ic eff ect on MI D.Key w ords:dementia;multi infarct;Chinese materia medica therapy;st rengthen the spleen to enhance intelligence基金项目国家自然科学基金项目(N 33)F j I f N N S F (N 33)多发梗塞性痴呆(multi infarct dementia,MID)是血管性痴呆(vascular dementia,VD)的主要类型,多发生于老年人,是一种以智能阶梯性恶化为主要表现的临床综合征。

近几年来,西医对本病的发病机理、临床诊断等各方面都进行了大量的研究工作,取得了很大的进展,但在治疗上仍没有满意的疗效,而中医药治疗本病有其独特的优势。

从2000年起我们自拟健脾益智胶囊(组方:人参、黄芪、制首乌、石菖蒲、远志等)治疗MID 取得了一定的临床疗效,在此基础上[1],进一步设立动物实验,进行观察,以期揭示其作用机理。

1实验动物清洁级12周龄雄性SD 大鼠50只,体重18020g,由浙江省实验动物管理委员会提供,合格证:浙实动设施准第2001001号,浙实动单项准第2001001号。

2方法21脾虚造模应用小承气汤参照傅湘琦等的方法稍加改进塑造大鼠脾虚模型[2]:给各组大鼠小承气汤灌胃2次/d,上下午各1次(1ml/100g),控制饮食,自由饮水,连续30d 。

脾虚造模第25~30d,随机选取10只进行Morris 水迷宫训练,第30d 记录成绩作为其学习记忆能力的参考值。

22MID 造模实验第31d,参照Kaneko [3]、陈俊抛等人[4]的方法,制作MID 大鼠模型:SD 大鼠腹腔注射盐酸氯胺酮注射液(1ml/只),麻醉满意后,将其固定于手术台上,常规消毒,颈部正中切口,暴露左侧颈总动脉,用金属动脉夹暂时夹闭,于颈外动脉处逆行插管缓慢推注栓子溶液03ml,推注后立即结扎颈外动脉,并开放颈总动脉,使栓子通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉,复制MID 模型。

23分组和给药动物适应性饲养9d 后,所有大鼠进行脾虚造模,30d 后随机分出10只作为假手术组,按复制MID 的方法进行操作,只是在颈外动脉注入03ml 生理盐水代替栓子溶液;其余40只则进行MID 造模。

将存活的27只大鼠随机分为模型组,中药组,西药组,每组9只。

术后第8d 各组动物进行为期5d 的Morris 水迷宫训练,最后1d 记录成绩,作为大鼠学习记忆能力的参考值,以判断痴呆造模浙江中医药大学学报2010年11月第34卷第6期:o:097708und pr o ect:tem o ational atur al cience oundation o:097708于晓艳,等:健脾益智法对多发梗塞性痴呆大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶活性的影响是否成功(即术前组)。

术后第13天,各组大鼠开始灌胃给药,每日上下午各1次(1ml/100g),连续20d,假手术组、模型组给予生理盐水,中药组给予健脾益智胶囊(1粒0228g,自拟经验方,由原福建中医学院制药厂加工)混悬液(02g/mL),西药组给予脑复康(由天津金世制药有限公司提供,批号020606)混悬液(0032g/mL)。

24指标测定大鼠给药结束后,迅速断头取血,取脑,分离出海马后取左侧大脑皮层固定部位10!10cm组织,称重后,以冰生理盐水作匀浆介质,研磨制成10%的脑匀浆,离心取上清,冰箱储存待测。

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinester ase,AChE)水解乙酰胆碱生成胆酸及乙酸,胆碱可以与巯基显色剂反应生成TNB(对称三硝基苯,sym tr initrobenzene)黄色化合物,根据颜色深浅采用微量羟胺比色法,计算出AchE的活性。

具体操作参照南京建成生物工程研究所生产的AchE试剂盒上说明书。

25统计学处理实验结果均采用SPSS110统计软件分析,所得数据用均数标准差(x s)表示,组间比较采用Q检验。

3实验结果31Mor ris水迷宫实验结果的比较见表1。

术前组#为测定学习成绩(即实验第25~30d随机选出的10只)作为大鼠学习记忆能力参考值的一组。

表1各组大鼠M WM学习成绩的比较(x s)组别n潜伏期(s)术前组103581289假手术组93558243(1)模型组94593400(2)中药组94570338(2)西药组94640305(2)与术前组比较(1)P>005,(2)P<005;模型组、中药组、西药组之间两两比较,P>00532各组大鼠脑匀浆中AchE活性的比较见表2。

表2各组大鼠脑匀浆中Ac hE活性的比较(x s)组别n AchE活力(U/pg)假手术组988914235899手术组992334230910中药组985128135690(2)(3)(5)西药组988983730148(1)(4)与手术组比较(1)P<005,(2)P<001;与假手术组比较(3)P<005;(4)P>005;与西药组比较(5)P<0054讨论MID应属中医学老年呆病#、中风痴呆#的范畴,为脾藏意主思#的病理改变,脾虚、精亏、浊瘀是MID发病的病理基础,而脾虚是精亏、瘀浊病理发展的主导;脾虚志衰、精亏失养、瘀浊阻脑三者相互作用是导致MID意智失用的内在机理,而脾虚失志是其病机的中心环节,精亏失养、瘀浊阻脑是加重脾虚失志产生痴呆的重要因素,因此确立了健脾益智为本病的治疗大法。

健脾即补益脾气,健脾可以化精充肾,健脾可有助于化瘀,而化瘀又有利于脾志恢复;益智则是针对意智失用之病机而立,因此,本法针对了MID发病的中心环节,为集健脾养神、化瘀通神、祛浊醒神于一体的治法。

20世纪80年代Bartus等[5]提出了老年记忆障碍的胆碱能假说,中枢胆碱能系统与学习记忆能力密切相关[6]。

乙酰胆碱(A cetylcholine,Ach)是其中重要的神经递质,由胆碱乙酰化酶(Choline acetylase,ChAT)合成,胆碱酯酶分解,通过乙酰胆碱受体(mAch R)发生作用,而mAch R参与大脑的唤醒、选择性注意力、情绪和运动协调等功能的调节,特别在现象和认知等方面被认为是关键环节之一[7]。

有报道指出,痴呆患者的认知功能受损程度和AChE活性相对增高及乙酰胆碱合成减少呈正相关[8],故可通过增加脑内Ach含量、抑制AchE活性或增加ChAT活性来改善学习记忆功能。

在脑内乙酰胆碱仅作为神经递质存在于胆碱能神经元的囊泡中,它是迄今发现的与学习、记忆关系最为密切的一种神经递质,一旦释出,则在细胞间隙内被胆碱脂酶迅速水解。

故脑组织内的Ach含量可被作为胆碱能结构和功能的一项特异性指标。

由于Ach性质极不稳定,容易水解,极难准确测定其含量,而AchE是Ach的降解酶,测定脑组织中AchE的活性,可判断脑内Ach含量的变化。

因此,目前许多研究均以AchE活性作为反映中枢胆碱能神经系统功能状态的重要指标[910]。

本实验的研究结果表明,健脾益智胶囊可以明显降低MID大鼠脑组织中AchE活性。