T—NHL TCRγ多重引物基因重排PCR参数优化

PCR常用优化策略特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。

PCR的高特异性是指PCR反应只产生预期的靶序列。

PCR的有效性是指经过相对较少的PCR循环能获得更多的产物。

而PCR的忠实性则是指PCR反应的精确性，其产物中几乎没有由DNA聚合酶诱导的碱基错配。

理想的PCR反应应该体现高度特异、高效和忠实。

研究表明这三个参数都受到PCR 反应体系中的众多成分及反应参数的影响，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性、高产量的条件并不一致。

因此，我们在建立PCR反应时，必须明确哪一个参数对于预期的扩增是最为重要的，并据此优化反应条件。

PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。

这时，改变已知的对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。

其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH 值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。

1. 模板核酸：模板核酸可以为多种形式的DNA，可以预先纯化除去蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。

理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增最好只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板，但其PCR产量较低。

实验表明，在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。

为了获得较高的产量同时保证较高的反应特异性，通常PCR反应的模板加入量为102－105拷贝的靶序列。

需要指出的是，扩增相同拷贝数的靶序列时，向PCR反应体系中加入的含靶序列的模板核酸的量是不同的。

例如，3×105单拷贝的靶分子相当于1?g人基因组DNA、10ng酵母DNA和1ng大肠杆菌DNA，而1% M13噬菌体相当于106靶分子。

2. 加入增强剂：一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG－6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲酰胺（1.25%～10%）和牛血清蛋白（10～100μg/mL）等都可以作为增强剂加到反应中以提高特异性和产量。

PCR反应程序设置哪些参数最重要PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA序列，从而在实验室中大量产生特定的DNA片段。

PCR反应的成功与否，关键在于合理设置PCR反应的各项参数。

本文将讨论PCR反应中最重要的参数设置。

引物设计PCR反应的第一个重要参数是引物设计。

引物是PCR反应中的两个短DNA片段，能够识别并结合到待扩增的目标DNA序列的两端。

引物的序列需要与目标序列高度特异性匹配，避免与其他非目标DNA序列发生非特异性扩增。

合理选择引物还需要考虑引物的长度、GC含量和互补性。

通常来说，引物长度应在18到25个核苷酸之间，GC含量应在40%至60%之间。

此外，引物的互补性也要避免引物之间形成二聚体或异聚体，影响PCR反应的效率和特异性。

温度参数温度是PCR反应中的另一个重要参数，包括Denaturation（变性）、Annealing（退火）和Extension（延伸）三个阶段的温度。

Denaturation阶段通常需要高温（通常为94℃至98℃）来使DNA双链解开成两条单链。

Annealing阶段需要将温度降低到与引物匹配的特定温度，使引物与目标DNA序列结合并引发扩增。

通常，合适的退火温度应在引物的Tm值（熔解温度）附近。

Tm值是指DNA的两个单链在一定条件下解开的温度。

Tm值的计算可以用公式Tm= 4 × (G + C) + 2 × (A + T)，其中A、T、G和C分别表示核苷酸A、T、G和C的数量。

Extension阶段需要较低的温度（通常为68℃至72℃），使DNA聚合酶结合在引物的3’端，并合成新的DNA链。

反应时间反应时间是PCR反应中确定的一个重要参数。

反应时间需要考虑参与PCR扩增的DNA模板的长度以及目标DNA的扩增比例。

通常情况下，PCR反应时间不宜过长也不宜过短。

如果反应时间过长，可能会导致非特异性扩增的发生，产生多个不需要的DNA片段。

PCR优化策略特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。

PCR的高特异性是指PCR反应只产生预期的靶序列。

PCR的有效性是指经过相对较少的 PCR循环能获得更多的产物。

而PCR的忠实性则是指PCR反应的精确性，其产物中几乎没有由DNA聚合酶诱导的碱基错配。

理想的PCR反应应该体现高度特异、高效和忠实。

研究表明这三个参数都受到PCR反应体系中的众多成分及反应参数的影响，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性、高产量的条件并不一致。

因此，我们在建立PCR反应时，必须明确哪一个参数对于预期的扩增是最为重要的，并据此优化反应条件。

PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。

这时，改变已知的对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。

其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。

1. 模板核酸：模板核酸可以为多种形式的DNA，可以预先纯化除去蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。

理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增最好只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板，但其PCR产量较低。

实验表明，在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。

为了获得较高的产量同时保证较高的反应特异性，通常PCR反应的模板加入量为102－105拷贝的靶序列。

需要指出的是，扩增相同拷贝数的靶序列时，向PCR反应体系中加入的含靶序列的模板核酸的量是不同的。

例如，3×105单拷贝的靶分子相当于1?g人基因组DNA、10ng酵母DNA和 1ng大肠杆菌DNA，而1% M13噬菌体相当于106靶分子。

2. 加入增强剂：一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG－6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲酰胺（1.25%～10%）和牛血清蛋白（10～100μg/mL）等都可以作为增强剂加到反应中以提高特异性和产量。

PCR反应条件的优化1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。

变性不完全,往往使PCR 失败,因为未变性完全的DNA 双链会很快复性,减少DNA 产量.一般变性温度与时间为94℃1min。

在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。

对于富含GC 的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

2. 退火：这是PCR 的一个关键参数。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比引物的Tm 低5℃, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度。

较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

如果两个引物Tm 不同，将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃。

或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。

这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

退火温度越高,所得产物的特异性越高。

有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。

退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。

3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb 长的DNA。

pcr反应循环参数PCR反应是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、亲子鉴定等领域。

要想成功进行PCR反应，循环参数的设置至关重要。

本文将介绍PCR反应的循环参数，并提供一些建议，帮助读者正确设置PCR反应的参数，提高反应效率。

PCR反应循环参数包括：变性、退火、延伸。

下面我们分别来介绍这三个参数。

首先是变性参数。

变性步骤的目的是使DNA双链解开，变成单链。

通常情况下，变性温度在95℃左右，时间约为30秒到1分钟。

合适的变性温度和时间可以有效地解开DNA双链，为后续的扩增提供条件。

接下来是退火参数。

退火步骤是为了使引物与目标DNA碱基序列结合。

通常退火温度比变性温度稍低，一般在50-68℃之间。

退火时间一般为30秒到1分钟。

合适的退火温度和时间可以使引物与目标DNA准确结合，确保扩增的特异性和准确性。

最后是延伸参数。

延伸步骤是在特定的温度下，使DNA聚合酶以引物为模板合成新的DNA链。

延伸温度一般为60-72℃，延伸时间根据扩增片段的长度来确定。

一般每增加100-1000bp，推荐延伸时间增加30秒到1分钟。

适当的延伸温度和时间可以确保扩增产物的合成及扩增效率。

为了理解PCR反应循环参数的设置更具体，我们以一个典型的PCR 反应为例。

假设我们要扩增一段150bp的目标DNA片段，以下是一个参考的循环参数：1. 变性：95℃，30秒2. 退火：55℃，30秒3. 延伸：72℃，30秒以上的循环参数可能需要进行25-35个PCR循环，具体视实验需求而定。

当然，以上只是一个参考设置，不同实验可能需要进行调整。

在实际操作中，我们可以根据目标片段的大小、引物设计和模板DNA的特性等因素来灵活调整PCR反应的循环参数。

此外，一定要进行试验来优化循环参数，以提高PCR反应的效率和特异性。

综上所述，PCR反应的循环参数是影响反应效果的关键因素。

正确设置变性、退火、延伸参数，可以提高PCR反应的特异性和效率，从而获得准确和可靠的实验结果。

荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因重排标准品质粒及标准曲线的构建江小工;徐兵;许文娟;李冰【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2004(020)002【摘要】目的:构建荧光定量PCR检测TCR VγI-Jγ基因标准品重组质粒和标准曲线,为建立实时荧光定量PCR准确检测淋巴系肿瘤微小残留病奠定基础.方法:对TCR VγI-¨基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针.提取急性淋巴细胞白血病患者的DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pMD 18-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒.结果:重组质粒进行荧光定量PCR扩增出现强烈的荧光值增长,表明TCRVγI-Jγ基因已成功克隆.以100～10-5不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增,Ct值分别为21.08、24.34、27.53、30.58和33.25.统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系,回归系数为0.998.结论:所构建的TCR VγI-Jγ基因荧光定量PCR检测标准品特异性和线性关系好,准确可靠,利于统一标准.【总页数】3页(P115-117)【作者】江小工;徐兵;许文娟;李冰【作者单位】510515,广州市,第一军医大学南方医院血液科;510515,广州市,第一军医大学南方医院血液科;510515,广州市,第一军医大学南方医院血液科;510515,广州市,第一军医大学南方医院血液科【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.实时荧光定量PCR检测鳜IgM mRNA标准品质粒的构建 [J], 刘雨果;潘厚军;陈偿;巩华;石存斌;吴淑勤2.荧光定量PCR检测TRECs的标准品质粒和标准曲线的构建 [J], 李红兵;陈明;朱学文;汪莉萍;葛国洪;李秀华3.小尾寒羊瘦素长型受体基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建 [J], 张桂山;徐晶;娄玉杰;张善鹏;姜怀志4.实时荧光定量PCR检测PrP基因表达标准品质粒和标准曲线的构建 [J], 宁章勇;赵德明;杨建民;崔亚利;孟丽平;吴长德;秦秀慧;马李颖5.实时荧光定量PCR检测多鳍鱼Shh基因表达标准品质粒和标准曲线的构建 [J], 张昌盛;王俊杰;李湘涛;翟红;刘群因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

〔PCR的循环参数〕1、预变性（Initial denaturation）．模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。

2、引物退火（Primer annealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。

复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

3、引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。

延伸时间随扩增片段长短而定。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。

3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。

延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。

对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

4、循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

每完成一个循环需2～4分钟5、循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。

3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。

延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。

对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

多重荧光定量pcr步骤解释说明以及概述1. 引言1.1 概述多重荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的生物学实验方法，通过引入多个荧光探针实时监测PCR反应过程中特定DNA 序列的扩增情况。

与传统PCR相比，多重荧光定量PCR具有高通量、高灵敏度和高精确性的优点，广泛应用于基础科学研究、医学诊断和环境检测等领域。

1.2 文章结构本文将首先介绍多重荧光定量PCR的步骤，包括PCR反应体系、荧光探针选择和设计以及PCR条件调优等内容。

随后，详细解释多重荧光定量PCR的原理和工作机制，包括简要介绍PCR原理、多重荧光探针PCR的工作原理以及荧光信号检测和数据分析方法。

接着，讨论多重荧光定量PCR在生物医学研究、临床诊断和农业环境检测等领域中的应用，并展望其未来发展前景。

最后，在结论部分总结多重荧光定量PCR步骤及其优势点，并分析目前面临的挑战，提出进一步发展方向。

1.3 目的本文旨在全面介绍多重荧光定量PCR的步骤、原理和应用，帮助读者深入理解该技术，并掌握其操作要点和相关应用领域。

通过本文的阐述，读者将对多重荧光定量PCR有一个清晰而全面的认识，以便在实验和研究中更好地利用该技术，并为未来的探索和创新提供启示。

2. 多重荧光定量PCR步骤:2.1 PCR反应体系:多重荧光定量PCR是通过同时使用多个荧光探针对目标DNA进行定量分析的一种PCR技术。

在进行多重荧光定量PCR之前，需要准备一个合适的PCR反应体系。

该体系包含以下组成部分：1. 模板DNA：即待扩增的目标DNA片段，可以是基因组DNA或cDNA。

2. 引物：用于引导DNA聚合酶在目标序列上扩增。

根据所需扩增的目标片段，设计并购买合适的引物。

3. 荧光探针：用于检测PCR反应过程中产生的特定产品。

根据需要同时检测的不同靶序列，选择合适的荧光探针，例如TaqMan探针、Molecular Beacon 等。

多重PCR攻略多重PCR能够在提高通量的同时节省样品降低成本，它需要耗费更多的时间和精力，同时也会给用户回报更丰富的数据。

本文介绍了一些实验技巧和商业化工具，希望能帮您轻松获得好结果。

PCR的重要性毋庸赘述，这一诺贝尔获奖技术的普及带动了现代基因组学、鉴定技术、医疗诊断等领域的发展。

如今，PCR几乎是每个实验室必备的通用技术，不过要跑好一个PCR也并非那么简单，由于PCR反应很灵敏，PCR的效果很容易受到污染和脱靶效应的影响。

我们在设计PCR实验时须得将引物设计、反应条件和酶的选择一一考虑周全。

这一点在多重PCR中尤为明显，因为多重PCR需要在一个管中同时检测多个目标（通常二至五个）。

多重PCR应用也很广泛，可以用来做基因表达分析、SNP分型、STR分型等鉴定以及病原菌检测等等。

多重PCR的反应数相对较少，所消耗的试剂也较少，是一个颇为经济的选择。

人们往往选用多重PCR来处理临床样本等珍贵样本，或者用来增加实验通量，每个样本所需的孔少了，那么一个微孔板自然就能容纳更多的样本。

多重PCR的挑战传统PCR反应体系包括模板DNA、两个扩增引物、酶和缓冲液，一般最后通过凝胶电泳来检测所得的扩增产物。

定量PCR除上述元素之外，还需要荧光探针以便检测反应的进行，不过就不需要进行凝胶电泳了。

从一般PCR到多重PCR，其实验设计的难度也随之翻倍。

如果说扩增一个片段需要三条引物，那么两个片段就需要六条，三个片段需要九条，以此类推。

这些引物既不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。

此外，我们还要考虑同时检测不同的扩增子，要么就使不同扩增子大小不一以便凝胶电泳，要么就让它们带上不同荧光染料以便区分。

更麻烦的是，多重PCR 中的不同扩增片段还会互相竞争资源，其结果是高丰度模板能够被很容易的检测到，而低丰度的模板彻底沦为背景。

上述困难都是进行多重PCR的绊脚石，“大多数人都嫌太麻烦了，”Life Tech 的资深科学家Jonathan Wang说“有许多客户对多重PCR感兴趣，但遇到这些麻烦之后，他们都选择了放弃，”安捷伦公司的产品经理Laura Mason补充道。

石蜡淋巴瘤组织中IgH FR3区基因重排引物分析齐宗利1,2,张　宝2,韩西群1,霍　霞2,朱梅刚1,赵　彤1摘要:目的　利用生物信息学方法分析免疫球蛋白重链(I gH )框架区(FR3)基因重排引物并探讨其在石蜡包埋非霍奇金淋巴瘤(NHL )组织中应用价值。

方法　通过ClustalW 软件比较44条有效的I gH 可变区和6条J 区的基因片段,选取I gH FR3区3对(P1,P2,P3)基因重排引物,其中,P2为改进的引物。

另选一对T CRγ引物作为T 细胞淋巴瘤重排引物,通过PCR 扩增,检测经形态学及免疫组织化学确诊的144例石蜡包埋组织标本,包括113例B 细胞淋巴瘤、24例T 细胞淋巴瘤和7例淋巴结反应性增生组织。

以DG75淋巴瘤细胞系DNA 作为对照组。

结果　引物对P1、P2、P3在B 细胞淋巴瘤检出阳性率分别为7117%(81/113),8213%(93/113)和7611%(86/113),三者检出率差异无统计学意义;在T 细胞淋巴瘤检出率分别1215%(3/24)、1215%(3/24)、1617%(4/24)。

将P1和P2引物组合分析,B 细胞淋巴瘤阳性检出率可以达到9213%。

以上重排引物在7例反应性淋巴结中均未检出。

结论　3对I gH FR3区中,新改进的P2引物在B 细胞淋巴瘤中的检出率最高(82.3%)。

2对I gH FR3区引物联合检测可明显提高石蜡组织中B 细胞淋巴瘤的检出率。

关键词:淋巴瘤;B 淋巴细胞;基因重排;聚合酶链反应;石蜡包埋中图分类号:R 392.12;R 73314 文献标识码:A 文章编号:1001-7399(2008)01-0091-05Ana lysis of im m unoglobuli n heavy cha i n gene rearrangem en t by the fram e reg i on 3pr i m ers and the i r appli ca ti on i n paraff i n 2em bedded lym phoma tissuesQ I Z ong 2li 1,2,ZHANG Bao 2,HAN Xi 2qun 1,HUO Xia 2,Z HU Mei 2gang 1,ZHAO Tong 1(1D epart m ent of Pathology,N anfang M edical U niversity,Guangzhou 510515,China;2the Key I mm unopathology L aboratory ofGuangdong Province,Shantou U niversity M edical College,Shantou 515041,China )Abstract:Purpose To analyze i m munogl obulin heavy chain (I gH )rearrangement by fra me regi on 3(FR3)p ri m ers and t o exp l ore their app licati on in paraffin 2e mbedded ly mphoma tissues .M ethods Three pairs of p ri m ers fr om I gH FR3regi on (P1,P2and P3)were chosen with comparis on of 44I gH variable and 6j oined regi on gene frag ments by the ClustalW s oft w are,of which the P2p ri m er was modified .144cases of hist opathol ogically confir med ly mphop r oliferative sa mp les included 113cases of B cell ly mphoma,24cases of T cell ly mphoma,and 7cases of reactive p r oliferative ly mph nodes .The DNA fr om DG75and Jurkat cell lines were emp l oyed as positive contr ols of B and T cell ly mphoma,res pectively .Results The positive rates of I gH FR3regi on p ri m ers (P1,P2and P3)were 7117%(81/113),82.3%(93/113),and 7611%(86/113)in 113cases of B cell ly mphoma,and 1215%(3/24),1215%(3/24),and 1617%(4/24)in 24cases of T cell ly mphoma,res pectively .There was no significantly statistical difference a mong three I gH FR3p ri m ers in detecti on of 113cases of B cell ly mphomas .The positive rate could be increased t o 9213%by combined use of the P1and P2p ri m ers .There were no positive cases a mong 7cases of p r oliferative ly mphoid tissues .Conclusi on Among 3I gH FR3regi on p ri m ers,ne wly modified P2p ri m er has a high detecti on rate in the gene rearrange ment of paraffin 2e mbedded ly mphoma tis 2sues .The detecti on rate could be increased by combining the t w o I gH FR3p ri m ers in the I gH gene rearrange ment analysis .Key words:ly mphoma;B cell;gene rearrange ment;PCR;paraffin e mbedded tissues收稿日期:2007-05-10　修回日期:2007-12-28基金项目:广东省社会发展攻关项目(No B30101)、广州市科技计划项目(No Z32E4061)作者单位:1南方医科大学南方医院病理科,广州　5105152汕头大学医学院中心实验室,汕头　515041作者简介:齐宗利,男,副教授,博士,E 2mail:qiz ongli@赵　彤,教授,博士生导师,通讯作者。