荧光素酶报告基因检测试剂盒

一、荧光素酶报告基因的检测原理荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。

自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。

细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。

目前，以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。

发光机制生物荧光实质是一种化学荧光。

萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下，催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～580 nm 的荧光，其化学反应式如下。

这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。

荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强，灵敏度高，由于没有激发光的非特异性干扰，信噪比也比较高。

二、荧光素酶报告基因的检测流程1、重组质粒制备: 制备含有待检测基因-Luc/Rluc的重组质粒；2、细胞系选择: 根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T细胞或原代细胞等；3、共转染: 将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转染，设置不同的检测时间点，一般为24h/48h；4、外界干预: 转染后，可进行物理/化学/病毒等的相应刺激；5、细胞处理: 采用进口/国产双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；6、荧光检测: 使用GENios Pro 酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测。

三、荧光素酶报告基因的优点1、优越的灵敏度，比Westernbloting灵敏度高1000倍以上；2、内源性低，哺乳动物无内源性表达；3、荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响；4、发光检测，检测方便；5、灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子；6、检测范围广，大于7个数量级。

双荧光素酶报告基因检测实验步骤引言：双荧光素酶报告基因检测是一种常用的实验方法，它利用双荧光素酶（Dual-Luciferase）系统来研究基因表达的调控机制。

本文将详细介绍双荧光素酶报告基因检测的实验步骤，以及实验中需要注意的事项。

一、材料准备1. 双荧光素酶报告基因载体：包含荧光素酶基因和Renilla荧光素酶基因。

2. 细胞培养基：适用于所研究细胞的培养基。

3. 转染试剂：常用的转染试剂有聚乙烯醇（Polyethylenimine，PEI）、脂质体等。

4. 荧光素酶底物：如荧光素、Renilla荧光素等。

5. 其他实验所需试剂：如维生素C、PBS缓冲液等。

二、细胞处理1. 细胞培养：将所研究的细胞株接种在含有适当浓度的培养基中，培养至适当的细胞密度。

2. 细胞分组：根据实验设计，将细胞分为实验组和对照组。

3. 细胞转染：将双荧光素酶报告基因载体转染至细胞中，可以使用PEI等转染试剂进行转染。

三、荧光素酶检测1. 收集细胞：根据实验设计，收集转染后的细胞。

2. 细胞裂解：使用细胞裂解缓冲液裂解细胞，释放内部的荧光素酶和Renilla荧光素酶。

3. 荧光素酶检测：将细胞裂解液与荧光素酶底物混合，测定荧光素酶活性。

4. Renilla荧光素酶检测：将细胞裂解液与Renilla荧光素酶底物混合，测定Renilla荧光素酶活性。

四、数据处理与分析1. 荧光素酶活性计算：根据荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算荧光素酶活性。

2. Renilla荧光素酶活性计算：根据Renilla荧光素酶底物降解产生的荧光信号强度，计算Renilla荧光素酶活性。

3. 相对荧光素酶活性计算：将荧光素酶活性除以Renilla荧光素酶活性，得到相对荧光素酶活性。

4. 统计分析：使用适当的统计方法，如t检验、方差分析等，对实验数据进行统计分析。

五、注意事项1. 实验条件统一：实验过程中，保持细胞培养条件的统一，如培养基组成、温度、湿度等。

第1篇摘要：双荧光素酶报告系统（Dual Luciferase Reporter Assays, DLRA）是一种广泛应用于生物科学研究中的细胞功能检测技术。

通过分析荧光素酶的活性，可以评估细胞内信号通路的激活情况，从而研究基因表达调控、细胞增殖、细胞凋亡等多种生物学过程。

本文将对双荧光素酶报告数据分析的方法、注意事项以及结果解读进行详细阐述。

一、引言双荧光素酶报告系统是一种基于荧光素酶活性的细胞功能检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

荧光素酶是一种在细胞内自然存在的酶，能够将荧光素底物催化生成荧光物质。

在双荧光素酶报告系统中，通常使用两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, FL）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase, RL）。

FL的荧光强度通常作为报告基因的活性，而RL的荧光强度则作为内参基因，用于校正实验误差和细胞活力。

二、实验原理双荧光素酶报告系统的基本原理是：将目的基因与荧光素酶基因（FL或RL）的启动子连接，构建报告基因质粒。

将报告基因质粒转染到细胞中，细胞内荧光素酶的活性与目的基因的表达水平成正比。

通过检测细胞内两种荧光素酶的荧光强度，可以评估目的基因的表达水平。

三、实验方法1. 构建报告基因质粒（1）设计荧光素酶基因（FL或RL）的启动子序列，并与目的基因序列连接。

（2）将连接好的基因序列克隆到载体质粒中，构建报告基因质粒。

2. 细胞培养与转染（1）培养细胞至对数生长期。

（2）用脂质体或电穿孔等方法将报告基因质粒转染到细胞中。

3. 荧光素酶活性检测（1）收集转染后的细胞，用荧光素酶底物进行孵育。

（2）使用荧光光度计检测细胞内FL和RL的荧光强度。

4. 数据分析（1）计算FL和RL的相对荧光强度（RFU）。

（2）计算目的基因的表达水平（FL/Rlu）。

四、数据分析方法1. 相对荧光强度（RFU）计算RFU = 荧光强度 / 标准曲线斜率2. 目的基因表达水平计算目的基因表达水平 = FL/Rlu其中，FL为FL的相对荧光强度，Rlu为RL的相对荧光强度。

双荧光素酶报告基因分析1. 介绍荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。

荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。

Dual-Luciferase®双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。

通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。

实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。

实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。

萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。

由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。

双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DMEM，F12等。

这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开，单独使用。

具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas™微孔板发光检测仪特别适合DLR 报告基因检测系统，Veritas™软件中预装了DLR 的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。

Veritas™微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II (LAR II)最低可以检测到1X10-19 mol 荧光素酶分子，使用Stop & Glo®试剂可以检测到1X10-18 mol 海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8 和6 个数量级。

所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶(E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。

图1－3 使用Promega 公司Dual-Luciferase®双荧光素酶报告基因检测系统，萤火虫荧光素酶(1x10-19 到1x10-11 mol)和海肾荧光素酶(1x10-14 mol)在Modulus™仪上测量结果。

免疫共沉淀实验（Coimmunoprecipitation）1，细胞接种和质粒转染：将消化完全的293T细胞（8×105）接种于6孔板，待细胞密度达到50-70%时，按照标准磷酸钙沉淀法进行转染；或者将消化完全的BHK细胞或pk15细胞（（8×105）接种于6孔板，按照Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染试剂说明进行转染。

2，细胞蛋白的收取：细胞转染24h-36h后，弃取培养液，并用预冷PBS洗涤两次。

每孔加入200μl蛋白裂解液（50mM Tris.Hcl,PH 8.0；150mM Nacl; 5mM EDTA,1% NP-40; 10% Glycerol, 配制成蛋白裂解基础液。

使用前，加入100×proteinase inhibitor cocktail 和10mM DTT）。

冰上孵育10min，涡旋1min，重复三次。

4℃，12000rpm，离心20min，收集上清，即为收取蛋白液。

3，杂蛋白的去除：向收取蛋白液中加入20μl Gamma Bind TM G Sepharose Beads ,于 4℃旋转摇床作用1h左右，以去除同Beads 非特异性结合的蛋白质。

4，4℃，3000rpm，离心3min，取上清。

BCA法测定蛋白浓度，并取500μg，调整到500 μl。

加入到预先混匀的15 μlBeads 和2μg 抗体中。

颠倒混匀，4℃旋转摇床最慢速度作用，2h至过夜。

5，4℃，3000rpm，离心3min，去除上清，并使用Lysis Buffer 基础液洗涤三次。

最后加入20μl 2X Loading Buffer, 煮沸5-10min。

4℃，3000rpm，离心3min，取上清。

6，选用合适浓度的分离胶电泳。

转印后进行Western blot检测。

激光共聚焦实验（Confocal assay）1，将玻片（Fisher brand，cover slips）预先在培养基中浸润，轻轻放入培养板孔内。

双荧光素酶报告实验
双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告系统是一种用于研究基因调控的重要工具，通过测定荧光素酶和Renilla荧光素酶的活性，可以分析基因的转录水平和转录后
调控。

本文将介绍双荧光素酶报告实验的步骤和注意事项。

首先，准备实验材料和试剂。

包括双荧光素酶报告载体、荧光素酶底物、Renilla荧光素酶底物等。

同时，需准备好细胞培养基、细胞培养耗材、离心管、
吸头等实验常用器材。

其次，进行细胞转染。

将双荧光素酶报告载体和感兴趣的基因表达载体共转染
入细胞，使其在细胞内表达。

转染后，培养细胞以使其充分表达目的基因。

接着，进行荧光素酶和Renilla荧光素酶活性检测。

使用双荧光素酶检测试剂盒，按照说明书操作，测定细胞中荧光素酶和Renilla荧光素酶的活性。

通过比较
两者的活性，可以得出基因的转录水平和转录后调控信息。

需要注意的是，在进行实验过程中，要严格控制实验条件，确保实验结果的准
确性。

另外，要注意避免细胞过度增殖或过度损伤，影响实验结果的可靠性。

总之，双荧光素酶报告实验是一种重要的基因调控研究方法，通过测定荧光素
酶和Renilla荧光素酶的活性，可以对基因的转录水平和转录后调控进行分析。

希
望本文介绍的实验步骤和注意事项能够帮助到实验人员顺利开展相关研究工作。

1ABP 海肾萤光素酶检测试剂盒货号: FP306, FP307表 1. 试剂盒组分和储存条件 材料 体积 浓度 储存条件 有效期ABP 海肾萤光素酶检测试剂盒 (货号 FP306)按照推荐的储存条件保存有效期为6个月，请注意避免反复冻融。

海肾荧光素酶底物 (组分 A)100 µL 100X -20 o C ，避光海肾荧光素酶Buffer (组分 B) 10 mL1X ABP 海肾萤光素酶检测试剂盒 (货号 FP307)海肾荧光素酶底物 (组分 A)500 µL 100X -20 oC ，避光海肾荧光素酶Buffer (组分B) 50 mL1X产品介绍通过检测报告基因的表达来研究真核基因表达调控是在生物技术和制药工业中常用的方法。

其中萤火虫荧光素酶是最常用的报告基因，目前通过寻找更小的报告基因及不需要ATP 作为辅酶的报告基因产生了一些其它报告基因。

海肾荧光素酶来源于海肾，是一个分子量为36 kDa 的单体蛋白。

这个酶不依赖于ATP (图1)，并且信号强度与荧光素酶含量成正比。

图1. 海肾荧光素酶反应.ABP 海肾荧光素酶检测试剂盒是一种简单可靠的用于测定样品中含海肾荧光素酶报告基因的检测系统。

试剂盒中的海肾荧光素酶底物和Buffer 混合后形成海肾荧光素酶检测试剂，可直接加入到细胞生长的培养基中，无需清洗和预处理。

检测试剂与细胞培养常用的培养基兼容，并且光信号的半衰期在1个小时左右。

海肾荧光素酶检测试剂可在培养基中直接裂解细胞并产生发光的信号具有以下特征 :简单: 可在培养基中直接裂解细胞并测定荧光素酶活性，无需清洗。

信号稳定: 发光信号稳定性强，半衰期在1h 左右。

适应性强: 试剂盒适用于多种真核细胞 (包括贴壁的和悬浮的)。

高通量: "add-and-read"模式适用于高通量检测。

注意事项1. 用于细胞培养的多孔板（96- 或384- 孔板）必须与用于检测化学发光的仪器兼容。

荧光素酶报告基因检测试剂盒荧光素酶报告基因检测试剂盒是一种用于检测基因表达的实验试剂盒。

该试剂盒利用荧光素酶作为报告基因，可以对目标基因的表达做出可见度良好的检测。

该测试盒适用于多种生物学研究领域，例如细胞生物学、分子生物学、免疫学、神经科学等。

通过使用该试剂盒，能够准确、快速地检测到目标基因的表达情况，为研究人员提供了强有力的工具。

使用荧光素酶报告基因检测试剂盒，需要按照以下步骤操作：
1. 收集细胞或组织
2. 分离总RNA
3. 利用逆转录酶将RNA转录成cDNA
4. 使用PCR扩增目标基因
5. 克隆PCR产物至质粒中
6. 转染细胞
7. 检测
在使用荧光素酶报告基因检测试剂盒的操作过程中，需要注意
以下几点：
1. 试剂的保存，需要在-20℃保存，且避免多次重复冻融。

2. PCR扩增需要设置负对照和阳性对照，以确保扩增的可靠性，从而保证检测结果的准确性。

3. 对于不同类型的样本，需要进行不同的操作，例如对于组织
样本，需要进行切片、裂解等处理。

在使用荧光素酶报告基因检测试剂盒时，需要严格按照说明书
进行操作，以避免操作误差，从而影响检测结果的准确性。

总之，荧光素酶报告基因检测试剂盒是一种重要的生物学研究工具，可以为研究人员提供准确、快速的基因表达检测服务，有助于推动生物学研究领域的发展。

双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Dual-Lucy Assay Kit)货号：D0010规格：100T保存：低温运输，-20℃或-80℃避光保存。

有效期6个月。

产品内容：名称数量保存条件5×Universal Lysis Buffer(通用裂解液)20ml-20℃Fassay Buffer I(虫酶缓冲液)10ml-20℃Fassay Substrate I(虫酶底物)0.5ml-20℃Rassay Buffer II(海酶缓冲液)10ml-20℃Rassay Substrate II(海酶底物)0.2ml-20℃产品说明：报告基因检测，是真核基因表达调控研究的常用方法。

由于检测光量子的方法非常敏感，采用生物发光(bioluminescent)法，是报告基因检测最常用的有效手段。

荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素的转化，发射出光子。

萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)催化的发光反应，具有相似的光学特征和很好的浓度线性范围(7~8个数量级的线性范围)，酶的检测灵敏度达10-18mol到10-20mol，但两者催化的化学反应底物和最适反应条件完全不同。

这两种荧光素酶配合形成了十分有效的双荧光素酶报告基因系统，其中Ranilla luciferase通常作为内参照。

本试剂盒提供了一体化形式的双荧光素酶检测系统。

采用通用裂解缓冲液，适合于两种荧光素酶活性的保持，且与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容；优化的两种酶反应体系，使每种发光反应持续数十分钟，以便于手工操作多个样品；并保证Firefly luciferase发光及时淬灭，不影响后续Ranilla luciferase的测定；优化的反应体系还使两种荧光素酶活性比值趋于合理的敏感范围，更有利于后续数据的比较。

自备试剂：PBS、双蒸水等。

操作步骤：一、裂解细胞：1)新鲜配制裂解液：临用前，取适量5×Universal Lysis Buffer(ULB)，用双蒸水稀释至1×ULB，混匀。

Dual-luciferase reporter assay kit(1) Promega公司双荧光素酶报告基因(DLR TM)检测系统试剂盒组分：Promega的DLR TM检测试剂盒专利给出了Luciferase assay bufferII和Stop & Glo® buffer的相关组分和浓度范围，没有具体的数值。

我在专利和文献中也没有找到针对DLR TM检测试剂盒中的passive lysis buffer的成分。

Assay protocol：(2) 文献中用到的几种非商业性双荧光素报告基因检测系统细胞裂解液（cell lysis buffer）配方：(a)源自promega公司的单荧光素酶报告试剂盒：T ris-phosphate（PH7.8）25mMEGTA or EDTA2mMDTT2mMBSA1mg/mlTriton X-1001%Glycerol10%(b) Make the following stock solutions.1M HEPES pH 8 (室温RT)1M DTT (4℃)100mM MgCl2 (RT)裂解液第二种配方（100ml体系）：来自/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=250710ml 1M HEPES PH80.5ml 1M DTT2ml 100mM MgCl22ml Triton X10085ml distilled water反应缓冲液：Firefly Luciferase Assay；Renilla Luciferase Assay Reagent。

a>“A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis”文献作者给出了2种荧光素酶活性检测的反应试剂配方，并与promega公司试剂盒进行了效果比较，检测效率和灵敏度都很高，不逊于promega产品。

Dual-Luciferase® Reporter Assay试剂准备Luciferase Assay Buffer II 10mlLuciferase Assay Substrate 1vialStop & Glo® Buffer 10mlStop & Glo® Substrate, 50X 200ulPassive Lysis Buffer (PLB), 5X 30ml1.1X PLB: 加1体积的5X Passive Lysis Buffer (PLB)到4体积的dH0中，40C2保存（一个月）。

R II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase Assay BufferII 中（-200C保存1个月，-700C保存1年）。

3.1X Stop & Glo 试剂：1体积50X Stop & Glo® Substrate加入49体积的Stop& Glo® Buffer中（-200C保存15天）。

（每次试验需要100ul）细胞处理1. 吸除细胞培养液2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞3. 加入1X PLB（推荐用量）4.细胞溶解室温条件下，轻摇细胞15min，瞬时转染和报告基因实验采用脂质体介导技术转染。

重组质粒分别为p-629/+100，p-401/+100，p-238/+100，p-80/+100，p-25/+100。

pGL3- basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。

具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent)说明书进行。

1. 将质粒DNA(3.2µg)与phRL-tk (0.8µg)按1:4混合后为A液，混匀30s，PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s;2. A+B混匀(B加入A)15s，室温下孵育5-10 min;3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB混合液，每孔0.8mL;4. 6h后，加入2mL完全DMEM;5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM;6. 100µg H2O2或B(a)P处理lh或24h;（200 µM MMS，24h-溶解于Me2SO, Sigma)；（H2O2不引起OGG1升高）7. 采用Promega公司的双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，检测仪器为化学发光仪(30IOC化学发光测定仪)，所有实验严格平行操作。

双荧光素酶报告实验引言。

双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告实验是一种常用的生物学实验技术，用于研究基因表达调控、转录因子活性、信号转导通路等生物学过程。

该实验利用双荧光素酶作为报告基因，通过测定其产生的荧光信号来研究目标基因的表达水平和调控机制。

本文将介绍双荧光素酶报告实验的原理、操作步骤和数据分析方法，以及该技术在生物学研究中的应用。

一、双荧光素酶原理。

双荧光素酶系统由火萤酶（Luciferase）和甲基火萤酶（Renilla Luciferase）两种荧光素酶组成，分别对应于两种不同的底物荧光素和甲基荧光素。

在双荧光素酶报告实验中，将目标基因的启动子区域与火萤酶基因或甲基火萤酶基因连接，构建成双荧光素酶报告载体。

通过转染该报告载体到细胞中，利用双荧光素酶底物依次检测火萤酶和甲基火萤酶的活性，从而测定目标基因的表达水平和调控机制。

二、实验操作步骤。

1. 构建双荧光素酶报告载体，将目标基因的启动子区域克隆至双荧光素酶报告载体中，构建成双荧光素酶报告载体。

2. 细胞培养和转染，选择适当的细胞系进行培养，将构建好的双荧光素酶报告载体转染到细胞中。

3. 荧光素酶活性检测，使用双荧光素酶检测试剂盒，按照说明书进行火萤酶和甲基火萤酶的活性检测。

4. 数据采集和分析，测定荧光素酶活性的荧光信号，并进行数据的统计分析和图表展示。

三、数据分析方法。

1. 荧光素酶活性比较，分别测定转染实验组和对照组的火萤酶和甲基火萤酶活性，计算两者的荧光信号比值，用于比较目标基因的表达水平。

2. 荧光素酶活性调控分析，在不同处理条件下进行双荧光素酶报告实验，比较不同条件下的火萤酶和甲基火萤酶活性，分析目标基因的调控机制。

四、双荧光素酶报告实验的应用。

1. 研究基因表达调控，通过双荧光素酶报告实验，可以研究转录因子对目标基因启动子的调控作用，揭示基因表达调控的分子机制。

2. 研究信号转导通路，利用双荧光素酶报告实验，可以分析信号转导通路中的关键分子对目标基因表达的调控作用，揭示信号转导通路的调控机制。

Luc-Pair ™ Renilla Luciferase HS Assay Kit- 高灵敏性海肾荧光素酶检测试剂盒Cat. No. LF010 (100 reactions) Cat. No. LF011 (300 reactions) Cat. No. LF012 (1000 reactions)使用说明书GeneCopoeia, Inc. 广州易锦生物技术有限公司9620 Medical Center Drive, #101 地址：广州科学城揽月路 3 号 F 区 F 801（510663） Rockville, MD 20850 电话： 4006-020-200、************、************USA 网站： ***********************************866-360-9531© 2016 GeneCopoeia, Inc.G C n p o eiae e o TMExpressway to Discovery使用说明书Luc-Pair™ Renilla Luciferase HS Assay KitI. 产品概述II. 产品信息及储存条件III. 细胞裂解IV. RLuc 工作液的配制V. 荧光素酶检测流程VI. 有限使用许可及质保声明I. 产品概述对报告基因表达的转录调控的研究常被应用于生物学研究和药物发现。

荧光素酶在基因表达研究中应用最为广泛，其主要包含以下几个优点：1) 在广泛动态范围内具有高灵敏度2) 在哺乳动物细胞内无荧光素酶、背景极低3) 实验重复性好4) 成本低5) 操作简单海肾（Renilla reniformis）荧光素酶是一个 36 kDa 单亚基蛋白质，酶活性不需要翻译后修饰，因此它可以作为一个实时转录报告基因，催化下面的生物发光反应：萤光素酶报告基因的测定需要用光度计或多功能微孔板检测仪，且发光强度与荧光素酶的数量成正比。

一、实验背景双荧光素酶报告基因检测实验是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达调控、蛋白-DNA互作以及非编码RNA的靶向互作等生物学过程。

该实验利用荧光素酶的发光特性，通过检测荧光强度来评估目的基因或蛋白的表达水平以及与DNA的结合情况。

二、实验目的本实验旨在通过双荧光素酶报告基因检测技术，研究特定转录因子对目的基因的调控作用。

三、实验材料与试剂1. 细胞株：HEK293细胞2. 载体：pGL3基本载体（含萤火虫荧光素酶基因）、pCMV- Renilla荧光素酶载体（内参基因）3. 试剂：胎牛血清、DMEM培养基、转染试剂、荧光素酶底物、荧光素酶测定仪、DNA序列分析软件等四、实验方法1. 构建报告基因质粒：将目的基因的启动子序列克隆到pGL3基本载体中，构建报告基因质粒。

2. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后进行转染。

3. 转染：按照转染试剂说明书，将报告基因质粒和pCMV-Renilla荧光素酶载体共转染细胞。

4. 细胞培养：转染后继续培养细胞，收集细胞并进行裂解。

5. 荧光素酶活性检测：将裂解液加入荧光素酶底物，在荧光素酶测定仪上检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。

6. 数据分析：计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值，分析特定转录因子对目的基因的调控作用。

五、实验结果1. 成功构建了报告基因质粒，并进行了转染。

2. 通过荧光素酶活性检测，获得了萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性值。

3. 计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值，分析了特定转录因子对目的基因的调控作用。

六、实验讨论本实验成功构建了报告基因质粒，并通过双荧光素酶报告基因检测技术，研究了特定转录因子对目的基因的调控作用。

实验结果表明，该转录因子能够显著提高目的基因的表达水平。

七、实验结论本实验通过双荧光素酶报告基因检测技术，成功研究了特定转录因子对目的基因的调控作用，为后续相关研究提供了实验依据。