脐带血单个核细胞分离及保存的优化研究_刘忠

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脐带血造血干细胞的分离和冷冻保存研究韩俊领;赵英新;武文杰;伍盛举;杨俊晔;邱录贵【期刊名称】《生物医学工程与临床》【年(卷),期】2005(9)5【摘要】目的探讨为临床移植有效地分离和冷冻保存无关供者脐带血中的造血干细胞的方法。

方法将由普通或改进的两种不同采集袋采集的脐带血,用两步离心法分离、浓缩脐带血中的有核细胞,用BioArchive System(生物档案系统)或常规的程控降温系统将之冷冻,保存在-196℃液氮中。

用流式细胞术和细胞培养法检测脐带血中的CD34+细胞和造血祖细胞含量。

结果脐带血用改进的采集袋分离后,有核细胞和红细胞的回收率分别为86.4%±4.6%和44.2%±9.6%,而普通采集袋的回收率为78.4%±7.9%和49.8%±11.7%;将富含有核细胞悬液的体积浓缩到20 ml时,有核细胞和红细胞的回收率分别为74.62±9.3%和34.9%±19.1%,浓缩体积为32 ml 回收率为86.4%±4.6%和45.1%±7.8%/但两者的CD34+细胞和造血祖细胞的回收率无统计学意义;冷冻脐带血融化后有核细胞、CD34+细胞和CFU-C回收率分别为84.2%±10.1%、96.0%±21.8%和115.1%±23.3%。

苔盼蓝拒染率93.8%±4.4%。

结论改进的采集袋能够明显提高有核细胞回收率。

采用两步离心法和两种冻存方法能够有效地富集和冻存脐带血中的造血干细胞。

【总页数】4页(P301-304)【关键词】脐带血;造血干细胞;分离;冷冻保存【作者】韩俊领;赵英新;武文杰;伍盛举;杨俊晔;邱录贵【作者单位】中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所天津市脐带血造血干细胞库【正文语种】中文【中图分类】R318.12【相关文献】1.脐带血造血干细胞采集、分离和冷冻保存研究 [J], 刘忠;孙自敏;吕蓉;李敏;郭晓睫;方勤;周学勇;刘会兰;丁利;杨红友2.脐带血造血干细胞的采集、浓缩与低温冷冻保存 [J], 刘开彦;高志勇;姜永军;董文川;李丹;王逸兰;黄宁伟;陆道培3.移植有效地分离和冷冻保存脐带血中的造血干细胞 [J], 杨俊晔;张亚斌;王福喜4.不同分离方法对脐带血造血干细胞分离及冷冻保存效果的影响 [J], 郭丽玮5.脐带血造血干细胞的分离和冷冻保存研究 [J], 韩俊领;赵英新;武文杰;伍盛举;杨俊晔;邱录贵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

脐带血单个核细胞迁移体外实验研究的开题报告一、研究背景脐带血（UCB）是一个重要的来源，包含了丰富的造血干细胞和免疫细胞，被应用于实现造血和免疫重建。

UCB对于临床的应用有很大的潜力，而单个核细胞（SNCs）作为UCB中的一种细胞类型，在此方面有着潜在的功效。

SNCs在UCB中占比较低，但具有独特的功能，能够迁移至其他组织，并发挥生物学效应。

虽然对SNCs进行了广泛的研究，但其迁移机制仍不完全清楚。

因此，进一步研究SNCs在细胞水平上的迁移机制具有很大的意义。

二、研究问题UCB中的SNCs可以迁移至其他组织发挥生物学效应，但其迁移机制仍未被完全阐明。

因此，本研究旨在探究SNCs在体外的迁移机制。

三、研究内容和方法本研究将采用体外细胞迁移试验，建立SNCs迁移的体外模型，评估SNCs迁移的能力和机制。

具体步骤如下：1. 提取UCB，并通过梯度离心法分离SNCs。

2. 构建细胞迁移实验体系，将SNCs放置在Boyden室中。

3. 向Boyden室中加入不同的化学物质，例如CXCL12、CCR7等，以评估这些物质是否能促进或抑制细胞迁移。

4. 使用荧光染色和显微镜观察和记录细胞迁移的情况。

5. 分析和比较不同组的数据，探索SNCs的迁移机制。

四、预期成果通过体外实验，本研究将探索UCB中SNCs的迁移机制，为进一步研究其在体内的作用奠定基础。

预计可以得到以下成果：1. 得到SNCs在体外迁移的能力和方式。

2. 确定影响SNCs迁移的因素和机制。

3. 为UCB的临床应用提供理论基础。

五、研究意义UCB作为一种重要的来源，SNCs具有在体外和体内迁移的功能，具有良好的生物学效应。

本研究将探索SNCs迁移的机制和影响因素，为其在临床应用中的发挥作用提供理论基础。

此外，研究结果还可以为相关研究提供参考，促进干细胞和免疫细胞的研究和应用。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710678118.3(22)申请日 2017.08.10(71)申请人 河南省银丰生物工程技术有限公司地址 450000 河南省郑州市高新技术产业开发区长椿路11号(72)发明人 朱学义　张雪梅　闫爽　王彦　李雯雯　魏天迪　(74)专利代理机构 南京源古知识产权代理事务所(普通合伙) 32300代理人 马晓辉(51)Int.Cl.C12N 5/0789(2010.01)A01N 1/02(2006.01)(54)发明名称一种脐血造血干细胞分离及存储的方法(57)摘要本发明公开了一种脐血造血干细胞分离及存储的方法，包括以下步骤：取新采集的脐血，并加入有抗凝剂的采血袋中，并密封；将羟乙基淀粉与非结合胆红素加入纯水中；将混合液过树脂筛过滤；将脐血缓慢加入到混合液中，静置30-120分钟；静置后，收集上层含有白细胞的血浆层；将收集的血浆加入冲洗液冲洗多次，得到分离的造血干细胞；向造血干细胞中加入诱导液，在细胞培养瓶内进行诱导处理，然后培养；然后在造血干细胞置装入储存容器，于冰块中1-3h，然后取出，置于干冰中放置12-24h，之后取出，放置于液氮中冻存。

本发明能够从脐血中分离出造血干细胞，并进行冷冻保存，分离及存储过程简单，操作方便。

权利要求书1页 说明书3页CN 107446889 A 2017.12.08C N 107446889A1.一种脐血造血干细胞分离及存储的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取新采集的脐血，并加入有抗凝剂的采血袋中，并密封；(2)将羟乙基淀粉与非结合胆红素加入纯水中；(3)将步骤(2)得到的混合液过树脂筛过滤；(4)将步骤(1)的脐血缓慢加入到步骤(3)得到的混合液中，静置30-120分钟；(5)静置后，收集上层含有白细胞的血浆层；(6)将收集的血浆加入冲洗液冲洗多次，得到分离的造血干细胞；(7)向造血干细胞中加入诱导液，在细胞培养瓶内进行诱导处理，然后在37℃、5％CO 2培养箱中培养12-48h，之后加培养液继续培养12-48h；(8)然后在造血干细胞置装入储存容器，于冰块中1-3h，然后取出，置于干冰中放置12-24h，之后取出，放置于液氮中冻存。

脐血单个核细胞分离方法的比较及形态学改变
李敏;张季红;徐佩茹
【期刊名称】《新疆医科大学学报》
【年(卷),期】2008(031)003
【摘要】目的:探索一种简便、高效的脐血单个核细胞分离方法.方法:以Ficoll 密度梯度离心法与羟乙基淀粉(HES) 分离法进行对比,比较两种分离方法分离脐血所得的单个核细胞(MNC) 细胞数,并观察两组单个核细胞不同培养时间下形态学变化.结果:两种分离方法在分离脐血MNC方面存在着显著性差异,其中以HES法效果较好, 但HES法所得细胞培养后生长状态欠佳.结论:HES 法是一种高效的脐血单个核细胞分离方法,但该法所得细胞的生长状态欠佳,需进一步实验证实.
【总页数】3页(P316-318)
【作者】李敏;张季红;徐佩茹
【作者单位】新疆医科大学第一附属医院,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院,新疆,乌鲁木
齐,830011
【正文语种】中文
【中图分类】R34
【相关文献】
1.多种分离方法分离脐血造血细胞效率的比较 [J], 王丹丹;林莹;武文杰;李茜
2.密度梯度离心法分离脐血单个核细胞方法的优化 [J], 任思坡;吴秀娟;罗小虎;李
全双;韩光宇;谭昆;拾莉;耿跃春
3.脐血采集后分离时间对单个核细胞玻璃化冷冻效果的影响 [J], 梁雪云;薛丽娜;王国平;王燕蓉
4.两步法分离人脐血单个核细胞的最佳条件 [J], 郭继强;刘爱兵;沈丹
5.不同分离方法分离脐血造血细胞效率的比较 [J], 朱美玲;伍新尧;陈汝光;刘永梅;彭丽珍;奚永志
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移植有效地分离和冷冻保存脐带血中的造血干细胞摘要】目的：探讨临床移植有效冷冻保存和分离造血干细胞方法。

方法：采取普通、改进两种不同采血袋，采取两步离心法将脐带血的有核细胞分离、浓缩，采取常规程控降温进行冷冻，温度为-196℃的液氮之中，使用细胞培养法、流式细胞术对脐带血里CD34+细胞、造血组织分别进行检测。

结果：使用改进采集方法分离，红细胞、有核细胞的回收率为86.6%、45.2%，普通采集袋中为78.5%、50.2%；可见其方法可有效提高红细胞、有核细胞回收率。

结论：改进采集袋可有效将有核细胞的回收率提高。

两步离心法、两种冷冻保存方法，可有效将保存脐带血的造血干细胞。

【关键词】脐带血分离冷冻保存【中图分类号】R329.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）36-0218-02目前，脐带血中造血干细胞的移植已经成功。

然而，无关供者得造血干细胞移植，必须要有保存规模的血库，并将其有效的保持和分离[1]。

采集脐带血未实施分离，便直接冷冻保存，会增加存在成本与空间，在融化后会出现较多红细胞溶解后产物，在注输时，会对患者的身体造成严重的损害。

为了能够有效的保持脐带血，并节约成本与存储空间，借鉴于其他成功经验，本院也建立了脐带血中造血干细胞血库，实施有效分离、保存方法。

1 资料与方法1.1脐带血标本符合本市脐带血血库标准的共有4865分脐带血，使用二联采集袋，采集袋中含28mlCPDA。

1.2方法脐带血的浓缩、分离，皆采用基本按方法进行。

在解决条件下，将脐带血均匀取样，用于对其中血型、细胞计数、CD34+细胞等各种检测。

将采集的脐带血按照5:1的比例，加入浓度为5%的HES，摇匀后10min，离心8min。

从而对包细胞富含部分手机，以HES加入量，收集15～30g红细胞。

将包细胞血浆放入离心杯，756g，离心14min。

将过量上层血浆去除，降温系统中留31ml包细胞血浆，生物档案留20ml即可。

脐血造血干细胞分离方法的实验研究刘献志,刘紫辉1,杨波郑州大学第一附属医院神经外科　郑州市　450052 摘要　目的　优化脐血造血干细胞/祖细胞的分离方法。

方法　脐血按体积比1∶5与含有树脂海绵筛(筛孔直径约12μm )的6%羟乙基淀粉混合,静置60m i n ,提取界面有核细胞。

倒置显微镜下计数有核细胞数,集落培养记数C F U-G M 数,流式细胞仪检测C D 34+细胞数,并与按照标准的羟乙基淀粉沉淀法和淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离的脐血相对照。

结果　采用本实验方法分离脐血获得的有核细胞数、C F U-G M 数和C D 34+细胞数分别为(96.82±25.78)×105/m l ,(66.70±12.47)×105,(1.33±0.57)×105/m l ,明显高于由羟乙基淀粉沉淀法(70.72±20.93)×105/m l ,(28.79±10.25)×105,(1.01±0.36)×105/m l 和淋巴细胞分离液密度梯度离心法(25.33±7.27)×105/m l ,(20.13±7.55)×105,(0.34±0.01)×105/m l 分离的脐血(P <0.05)。

结论　本实验方法可由脐血中分离出大量的造血干/祖细胞,是一种分离脐血造血干/祖细胞的理想方法。

　 关键词　脐血;造血干细胞;细胞分离 中图分类号:R 458+.8 文献标识码:A 文章编号:1672-3422(2007)05-0052-03O p t i m i z a t i o no f I s o l a t i o no f H e m a t o p o i e t i c S t e m/P r o g e n i t o rC e l l s f r o m U m b i l i c a l C o r dB l o o dL I UX i a n z h i ,L I UZ i h u i ,Y A N GB oT h e F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Z h e n g z h o u U n i v e r s i t y ,Z h e n g z h o u 450052,C h i n aA B S T R A C T O b j e c t i v e T o o p t i m i z e t h e p r o t o c o l s f o r i s o l a t i n g h e m a t o p o i e t i c s t e m /p r o g e n i t o r c e l l s (H S P C )f r o mu m b i l i c a l c o r d b l o o d (U C B ).M e t h o d s N u c l e a t e d c e l l s (N C )d e r i v e d f r o mU C Bw e r e s e p a r a t e d b y h y d r o x y e t h y l s t a r c h (6%H E S )w h i c h m i x e d w i t h r e s i n s p o n g e (p o r e 12u m ).T h e n u m b e r o f N C ,C F U-G M a n dC D 34+c e l l s w e r ede t e c t e d b y e n u m e r i n g ,c o l o n y c u t u r e a n df l o wc y -t o m e t e r y ,a n dc o m p e r e dw i t h t h a t f r o m U C Bs e p e r a t e db y s t a n d a r d h y d r o x y e t h y l s t a r c h(6%H E S )s e d i m e n t a t i o n o r d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n(F i c o l l -H y p a q u e ,1.007g /L ).R e s u l t s T h e n u m -b e r o f N C ,C F U -G M a n d C D 34+c e l l s i s o l a t ed b y o u r me d t h o dw e r e (96.82±25.78)×105/m l ,(66.70±12.47)×105a n d (1.33±0.57)×105/m l r e s p e c t i v e l y ,w h i c h w e r e h i g h e r t h a nt h a t f r o m U C Bi s o l a t e d b y s t a n d a r dh y d r o x y e t h y s t a r c hs e d i m e n t a t i o n(70.72±20.93)×105/m l ,(28.79±10.25)×105,(1.01±0.36)×105/m l o r d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n (25.33±7.27)×105/m l ,(20.13±7.55)×105,(0.34±0.01)×105/m l (P <0.05).C o n c l u s i o n I t i s c o n c l u d e d t h a t t h e p r o t o c o l s e s t a b l i s h e d h e r e c a n a c q u i r e H S P Cw i t hh i g ha b u n d a n c e ,e n r i c h m e n t a n dv i a b i l i t y a n dm a y b e a o p t i m a l m e t h o d f o r i s o l a t i n g h e m a t o p o i e t i c s t e m /p r o g e n i t o r c e l l s f r o mu m b i l i c a l c o r d b l o o d .K E Y WO R D S U m b i l i c a l c o r d b l o o d ;H e m a t o p o i e t i c s t e mc e l l ;C e l l s e p a r a t i o n 脐血造血干/祖细胞是造血干细胞移植的一种形式,广泛地应用于治疗血液系统肿瘤性疾病、自身免疫性疾病和某些实体肿瘤等。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011412733.8(22)申请日 2020.12.04(71)申请人 深圳市北科生物科技有限公司地址 518000 广东省深圳市南山区粤海街道高新南九道59号北科大厦16楼申请人 河北北科生物科技有限公司(72)发明人 储王龙　刘沐芸　梁晓　苏华莹　胡隽源　朱丽萍　王嘉楠　张芬　钟振忠　王清芳　(74)专利代理机构 深圳市精英专利事务所44242代理人 蒋学超(51)Int.Cl.C12N 5/078(2010.01)(54)发明名称一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏方法(57)摘要本发明提供了一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏方法，包括：将复苏洗涤液放置在37℃的环境中；将低温冻存的脐带血单个核细胞置于37℃水浴锅中进行复温；将复温完成的脐带血单个核细胞转移至离心管；将复苏洗涤液分为第一复苏洗涤液和第二复苏洗涤液，其中第一复苏洗涤液与第二复苏洗涤液的容量比值为0.154‑0.25；将第一复苏洗涤液匀速滴加到离心管中，滴加时间为160‑170秒；将第二复苏洗涤液匀速滴加到离心管中，滴加时间为50‑60秒，获得细胞悬液；通过离心法将细胞悬液分层；去除上清液。

本发明的有益效果在于：通过优化细胞复苏的操作方法，在不改变冻存液和洗涤液配方的情况下，有效提高了复苏细胞活率及回收率，大大改善了复苏效果。

权利要求书1页 说明书6页 附图2页CN 112501117 A 2021.03.16C N 112501117A1.一种低温冷冻的脐带血单个核细胞的复苏方法，包括：S1、将复苏洗涤液放置在37℃的环境中；S2、将低温冻存的脐带血单个核细胞置于37℃水浴锅中进行复温；S3、将复温完成的脐带血单个核细胞转移至离心管；S4、将复苏洗涤液分为第一复苏洗涤液和第二复苏洗涤液，其中第一复苏洗涤液与第二复苏洗涤液的容量比值为0.154‑0.25；S5、将第一复苏洗涤液匀速滴加到离心管中，滴加时间为160‑170秒；S6、将第二复苏洗涤液匀速滴加到离心管中，滴加时间为50‑60秒，获得细胞悬液；S7、通过离心法将细胞悬液分层；S8、去除上清液。

两步法分离人脐血单个核细胞的最佳条件郭继强;刘爱兵;沈丹【摘要】背景:如何获得较为纯化、高活性的干细胞,目前未见深入研究报告,也未见一个标准化操作流程方案.目的:探讨两步法分离人脐血单个核细胞最佳分离条件.方法:观察羟乙基淀粉在20,30,40,50,60,70 min不同时间沉淀脐血中红细胞的效果;使用人淋巴细胞分离液,分别在800,700,600,500,400 g/min,离心30,25,20 min的条件下分离人脐血单个核细胞.结果与结论:6%羟乙基淀粉沉淀脐血60 min 效果最好;使用密度为(1.077 0±0.000 1) g/mL人淋巴细胞分离液,在4 ℃条件下以700 g/min离心力,离心30 min,洗涤3次,这样获得的人脐血单个核细胞效果最好,所得细胞沉淀中混杂细胞如红细胞及其他细胞碎片较少,人脐血单个核细胞的细胞得率及活力比较高.提示应用羟乙基淀粉沉淀和人淋巴细胞分离液分离两步法,在最佳时间条件下可提高脐血干细胞的回收率.%BACKGROUND: It has not been deeply reported howto obtain high-purity and high-vigor stem cells as well as the standardizedoperation plan has not been seen, yet.OBJECTIVE: To explore the best condition for isolating human umbilical cord blood mononuclear cells.METHODS: Umbilical cord blood red blood cells precipitated by hydroxyethyl starch were observed in different time points (20,30, 40, 50, 60, 70 minutes). The human umbilical cord blood mononuclear cells were separated in human lymphocyte separatingmedium (LSM) by using centrifugation method at 800, 700, 600, 500, 400 g/min for 30, 25, and 20 minutes.RESULTS AND CONCLUSION: The 6% hydroxyethyl starch precipitation for umbilical cord blood red blood cells was best within60 minutes. Using the human LSM of (1.0770+0.000 1) g/mL at 4 ℃, centrifugation at 700 g/min for 30 minutes, and rinsing for 3times the best conditions to harvest human umbilical cord blood mononuclear cells. Under the above-mentioned conditions, notonly higher umbilical cord blood mononuclear cells rate and higher mononuclear cells vigor were obtained, but fewer red bloodcells and other cell fragments were seen. The best condition for isolating the human umbilical cord blood mononuclear cells usingtwo steps methods (6% hydroxyethyl starch precipitation and LSM) at the optimal time can improve the recovery rate of humanumbilical cord blood stem cells.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)045【总页数】4页(P8447-8450)【关键词】人脐血;单个核细胞;密度梯度离心法;羟乙基淀粉;两步法【作者】郭继强;刘爱兵;沈丹【作者单位】武警总医院医学实验中心,北京市,100039;武警总医院医学实验中心,北京市,100039;武警总医院医学实验中心,北京市,100039【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言脐血(脐带血)是获取临床治疗级干细胞的常用来源之一[1]。

脐血有核细胞分离、冻存方法的研究
罗伟琼;朱美玲;邹翠贤;李沈容;罗小珍
【期刊名称】《临床输血与检验》
【年(卷),期】2007(9)1
【摘要】目的探讨脐血有核细胞的分离、冻存方法,减少脐血的贮存空间.方法脐血采集按美国脐血库标准操作规程(SOP); 68份脐血采用6%羟乙基淀粉(HES)、三联袋两次离心分离法将脐血分离成WBC层、RBC层和血浆层,脐血终体积为18～22 ml.结果分离前后有核细胞计数、各系祖细胞数、CD34+细胞获得率分别为92.4%、96.5%、89.7%、80.2%、90.4%.结论证实HES分离脐血未造成有核细胞及各系祖细胞的明显损失.脐血可用简单的方法减少体积,节省液氮消耗量,降低了贮存空间,是一种用以建立脐血库的尝试.
【总页数】3页(P55-57)
【作者】罗伟琼;朱美玲;邹翠贤;李沈容;罗小珍
【作者单位】518101,广东省深圳市宝安血站;518101,广东省深圳市宝安血
站;518101,广东省深圳市宝安血站;深圳宝安西乡人民医院;深圳宝安西乡人民医院【正文语种】中文
【中图分类】R458+.8
【相关文献】
1.不同方法分离人脐血造血细胞的比较研究 [J], 高海燕;李晓鸥;朱华
2.脐血造血干／祖细胞冻存方法研究进展 [J], 张占英
3.脐血造血细胞分离和冻存的研究 [J], 张林生;陆道培
4.三联袋两次离心法分离脐血有核细胞研究 [J], 辜少玲;廖灿;刘斌;魏佳雪
5.脐血造血干细胞分离方法的实验研究 [J], 刘献志;刘紫辉;杨波
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