脐带血分离protocol

脐血造血干细胞分离方法的实验研究作者：王永娟来源：《科学与财富》2018年第18期摘要：脐血作为一种造血干细胞来源可替代骨髓进行造血干细胞移植，脐血移植在治疗儿童遗传性疾病和血液病方面取得了巨大的成效。

为进一步推广脐血移植，必须相应地建立起完备的脐血库。

脐血库不同于骨髓库，它必须冻存实物。

为减少冻存体积，降低成本，需要采取有效的方法分离脐血中有核细胞，从而使大规模、广泛地建立脐血库成为可能。

本文对脐血造血干细胞分离进行实验研究分析。

引言脐带血（umbilical cord blood，UCB）是产后留存在胎盘和脐带中的血液，以往被作为医学废物而丢弃。

近十几年的研究发现，人脐带中存在大量间充质干细胞，间充质干细胞（mesenchymal sterncells，MSCs）是成体干细胞的一种，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能，可以重建人体造血和免疫系统的造血干/祖细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。

一、试验方法1.1脐带血造血干细胞分离利用离心沉降法和自然沉降法分离脐带血有核细胞，计算有核细胞回收率和红细胞回收率，比较两种分离方法的分离效果。

离心沉降法：将6%的羟乙基淀粉注射液和脐带血按照1∶5的比例混合，慢速摇匀10min，以50g、10℃离心7min，收集上层富白细胞血浆，再以400g、10℃离心15min，去除血浆。

自然沉降法：将6%的羟乙基淀粉注射液和脐带血按照1：5的比例混合，慢速摇匀10min，悬挂让其内细胞自然沉降1h后，收集上层富白细胞血浆，同样以400g、10℃离心15min，去除血浆。

1.2脐带血造血干细胞冻存将分离后的脐带血分别与4种不同的冷冻保护剂混合，脐带血与冷冻保护剂的体积比为4∶1，混合时应将冷冻保护剂缓慢注入脐带血中，边注入边晃动。

用程控降温仪按以下程序降温，4℃保持10min，以-1℃/min的速率降温至-40℃，再以-10℃/min的速率降温至-80℃，完成后将脐带血混合物放入液氮罐中储存。

脐带血分离nk细胞实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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脐带血分离protocol脐带血分离protocol2012-3-17 更新密度梯度离心1.估算脐血样本的体积并做相应标记；2.脐带血单个核细胞计数：10μL脐血+190μL3％冰乙酸（稀释20倍），计数板计数细胞，得出浓度和有核细胞总数；3.若脐血浓度为≦1×107个/ml，不用稀释，否则用PBS溶液稀释脐血浓度至约1×107/ml；4.颠倒几次充分混匀Ficoll-PaguePREMIUM，用移液枪吸取Ficoll-PaguePREMIUM 15ml至50ml离心管内；5.小心将30ml稀释的血样品加到Ficoll-PaguePREMIUM上(滴加血液时一定要轻柔，避免加入的血液与Ficoll液相混合,确保二者分层清晰）；6.离心：400g，30min，200C，↗Max ↘Slow；7.用吸管将单个核细胞层移到无菌的离心管中（离心后分为四层,从上至下依次为:血浆、单个核细胞层、Ficoll、红细胞与多核细胞，注意此时要轻拿轻放，切勿将已分层的液体重新混合。

吸取少量血浆不会影响结果，但需避免吸入大量Ficoll）单个核细胞计数并留样1.将收集的单个核细胞均分至新的50ml离心管中，每管10ml,加3倍（30ml）平衡盐溶液PBS,混匀后离心：400g，10min，200C，↗Max ↘Max，弃上清；2.先用1mlACK充分重悬，再补加9mlACK，混匀后室温静置10min，添加PBS溶液至50ml，上下颠倒混匀；3.离心：400g，10min，200C，↗Max ↘Max，弃上清；4.先用1mlPBS充分重悬，再补加9mlPBS，并对单个核细胞计数：10μL细胞悬液+90μL台盼蓝（即稀释10倍，稀释后立即计数）；5.用无菌进口1.5mlEP管保存脐血筛查用细胞（标注日期、脐血编号），每袋血样留2份样本，每份4×106个；6.离心：400g，10min，200C，↗Max ↘Max，弃上清；磁珠分选1.a)若细胞总数＜2×107 ，用100μL磁珠buffer 重悬细胞；b)若细胞总数为2×107 ～2×108，用磁珠buffer将细胞重悬到终浓度为2×108个/ml；c)若细胞总数为2～5×108，用1ml磁珠buffer 重悬细胞；2.以100μL/ml细胞悬液的比例添加EasySep Positive Selection Cocktail（e.g.1ml细胞悬液添加100μL Cocktail），混匀细胞，室温静置15min；3.以50μL/ml细胞悬液的比例添加EasySep磁珠，用枪头上下吹吸至少五次使溶液混匀（切记不要vortex）；室温静置10min；4．添加磁珠buffer使细胞悬液总体积为2.5ml，用枪头上下吹吸2～3次混匀，然后将细胞悬液转移至流式管中，，并在管壁上标注2.5ml刻度线。

移植有效地分离和冷冻保存脐带血中的造血干细胞摘要】目的：探讨临床移植有效冷冻保存和分离造血干细胞方法。

方法：采取普通、改进两种不同采血袋，采取两步离心法将脐带血的有核细胞分离、浓缩，采取常规程控降温进行冷冻，温度为-196℃的液氮之中，使用细胞培养法、流式细胞术对脐带血里CD34+细胞、造血组织分别进行检测。

结果：使用改进采集方法分离，红细胞、有核细胞的回收率为86.6%、45.2%，普通采集袋中为78.5%、50.2%；可见其方法可有效提高红细胞、有核细胞回收率。

结论：改进采集袋可有效将有核细胞的回收率提高。

两步离心法、两种冷冻保存方法，可有效将保存脐带血的造血干细胞。

【关键词】脐带血分离冷冻保存【中图分类号】R329.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）36-0218-02目前，脐带血中造血干细胞的移植已经成功。

然而，无关供者得造血干细胞移植，必须要有保存规模的血库，并将其有效的保持和分离[1]。

采集脐带血未实施分离，便直接冷冻保存，会增加存在成本与空间，在融化后会出现较多红细胞溶解后产物，在注输时，会对患者的身体造成严重的损害。

为了能够有效的保持脐带血，并节约成本与存储空间，借鉴于其他成功经验，本院也建立了脐带血中造血干细胞血库，实施有效分离、保存方法。

1 资料与方法1.1脐带血标本符合本市脐带血血库标准的共有4865分脐带血，使用二联采集袋，采集袋中含28mlCPDA。

1.2方法脐带血的浓缩、分离，皆采用基本按方法进行。

在解决条件下，将脐带血均匀取样，用于对其中血型、细胞计数、CD34+细胞等各种检测。

将采集的脐带血按照5:1的比例，加入浓度为5%的HES，摇匀后10min，离心8min。

从而对包细胞富含部分手机，以HES加入量，收集15～30g红细胞。

将包细胞血浆放入离心杯，756g，离心14min。

将过量上层血浆去除，降温系统中留31ml包细胞血浆，生物档案留20ml即可。

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定概述脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。

WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。

在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细胞培养和鉴定。

分离过程脐带血样获取首先需要从人体获得脐带血样。

脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺等方式获取。

获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。

分离WJ-MSCs脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。

具体分离步骤如下： 1.将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。

细胞培养在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。

具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。

鉴定方法确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。

免疫学鉴定通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。

活力检测通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。

多向分化鉴定通过对WJ-MSCs进行分化培养，如脂肪细胞培养、软骨细胞培养等，检测WJ-MSCs是否显示多向分化的潜能。

结论通过脐带血样的分离，可以获得WJ-MSCs，并通过相关的培养和鉴定方法，确定其为WJ-MSCs，并进一步应用于生物医学实验中，具有潜在的临床应用前景。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011426548.4(22)申请日 2020.12.09(71)申请人 湖南源品细胞生物科技有限公司地址 410000 湖南省长沙市长沙经济技术开发区东五路南段102号中南源品干细胞科技园(72)发明人 王成　杨雅评　廖雨　张浪　王丹　(74)专利代理机构 北京天盾知识产权代理有限公司 11421代理人 李琼芳　肖小龙(51)Int.Cl.C12N 5/0789(2010.01)A01N 1/02(2006.01)(54)发明名称一种脐带血造血干细胞的分离方法(57)摘要本发明属于生物技术领域，尤其是一种脐带血造血干细胞的分离方法，包括如下步骤：将羟乙基淀粉溶液加入脐血中混匀后离心得到上层液体和下层红细胞；将上层液体和下层红细胞分别离心，上层液体离心后得到上层血浆和底层细胞，底层细胞重悬；红细胞离心后得到表面白膜层，表面白膜层用上层血浆定容，然后离心得到的下层细胞沉淀去除红细胞后重悬；将上述重悬后的细胞加入冻存液，混均后在液氮罐保存。

并且采用本发明的脐带血造血干细胞的分离方法，能够有效的从全血中分离出造血干细胞，羟乙基淀粉可以尽可能地去除血浆，提高分离效率，细胞的损失率低，能够减少冻存体积，降低成本；并且最终分离后得到的造血干细胞的回收率达到了96.94%。

权利要求书1页 说明书3页CN 112522197 A 2021.03.19C N 112522197A1.一种脐带血造血干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：将6%的羟乙基淀粉溶液加入脐血中混匀，其中羟乙基淀粉溶液与脐血的体积比为4:1；混匀后分装至离心管中，静置，然后离心得到上层液体和下层红细胞；将上层液体和下层红细胞分别离心，上层液体离心后得到上层血浆和底层细胞，底层细胞用上层血浆重悬；红细胞离心后得到表面白膜层，表面白膜层用上层血浆定容，然后离心得到的下层细胞沉淀去除红细胞后用上层血浆重悬；将步骤3）和4）中重悬后的细胞汇集在一起，加入上层血浆定容，再加入冻存液，混合均匀后一起转移至冻存袋中；使用程控降温机降温，然后转入液氮罐保存。

脐血造血干细胞分离方法说实话脐血造血干细胞分离这事，我一开始也是瞎摸索。

我试过好多方法呢，走了不少弯路。

我最早的时候啊，就按照一些书上那种很粗略的说法去做，感觉像是在黑暗里摸东西，根本找不着北。

那时候我想当然地觉得先把脐血收集起来，然后就开始用离心法，我想着这就跟淘米似的，把轻的杂质甩掉，重的干细胞就留下来呗。

结果啊，大错特错，根本不是那么回事。

这样做出来的东西杂质特别多，干细胞的纯度低得可怜。

后来我才知道，收集来的脐血里面成分复杂着呢，不是简单一离心就能搞定的。

再后来我就学乖了。

我在离心之前先进行了一定的预处理，这就好比给菜洗菜似的，先得把表面那些脏东西清理干净。

我会先往脐血里面加一些试剂，这些试剂呢就像是小刷子，能把那些可能影响分离的东西先给标记出来或者中和掉。

比如说，有些蛋白之类的东西会干扰干细胞分离，那这些试剂就能和它们起反应。

然后再进行离心操作就比之前好一点了。

但是这个离心也有讲究。

离心的速度和时间就像煮饭的火候一样，掌握不好可不行。

我试过不同的速度和时间组合。

速度快了时间长了，干细胞虽然能和大部分杂质分开，可是干细胞自身也会受到一定损伤。

速度慢了时间短了呢，又分不开。

我小心翼翼地调整，慢慢找到一个相对合适的范围，但是这个范围也不是固定死的，不同的脐血样本可能在这个基础上还需要微调。

还有一个我不断尝试的地方是过滤。

过滤就像是筛沙子，想把那些颗粒特别大的杂质筛出去。

开始我用的过滤装置孔径选择不好，不是把干细胞挡住了，就是让一些杂质也通过了。

后来经过各种尝试，才确定了比较合适的孔径大小。

不过呢，这个也不是对所有脐血都完全适用，还得根据具体情况来看。

另外，在整个分离过程中，环境因素也很重要。

温度就像给细胞盖的被子一样，如果不合适，细胞也会闹情绪。

我试过如果温度偏低一点或者偏高一点，最后得到的干细胞质量就是会有差别。

我现在明白了，做脐血造血干细胞分离啊，就得像照顾小孩子一样，方方面面都得考虑周到，一个小环节没做好就可能前功尽弃。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010925834.9(22)申请日 2020.09.04(71)申请人 中康再生医学科技（海南）有限公司地址 570000 海南省海口市秀英区南海大道226号海口国家高新区创业孵化中心A楼5层A9-5室(72)发明人 李伟　王熙凯　赵庆义　(51)Int.Cl.C12N 5/0789(2010.01)(54)发明名称一种脐带血干细胞分离制备方法(57)摘要本发明涉及一种脐带血干细胞分离制备方法，具体包括以下步骤：S1，脐带血的采集；S2，将脐带血预处理样品按体积比1:1加入含有脑蛋白水解物和生理盐水的稀释剂，得到稀释细胞液；S3，在稀释液中，加入红细胞沉淀剂，移取上层细胞液分装至离心管中，分三步进行梯度离心分离；S4，移取中层脐带血干细胞至另一离心管内；S5，在收集脐带血干细胞的离心管内加入生理盐水进行稀释，轻轻混匀后进行离心分离，离心分离的条件设置500g ×5min，离心后再用生理盐水洗涤沉淀层；其中，所述的生理盐水中含有浓度为1‑3％的脑蛋白水解物，最后收集离心管底部的脐带血干细胞。

本发明所述的脐带血干细胞分离制备方法可大批量分离纯化脐带血干细胞，且干细胞回收率高、活性高。

权利要求书1页 说明书4页CN 112029726 A 2020.12.04C N 112029726A1.一种脐带血干细胞分离制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，脐带血的采集：在产妇胎盘脱落后，使用含枸橼酸钠或肝素的抗凝液的采血袋，将采血袋上的针头插入脐静脉中，一边采集一边轻轻晃动采血袋，使抗凝液与脐带血充分混合，得到脐带血预处理样品；S2，将脐带血预处理样品倒入大容量无菌培养瓶中，按体积比1∶1向培养瓶中加入含有脑蛋白水解物和生理盐水的稀释剂，盖上瓶盖，摇匀，得到稀释细胞液；S3，在步骤S2得到的稀释液中，加入红细胞沉淀剂；混合均匀后，静止30-60分钟，观察到有明显分层，且分层不再变化时，移取上层细胞液分装至离心管中，进行梯度离心分离，所述梯度离心分离，分三步进行：第一步，设置离心条件：300g ×5min；第二步设置离心条件：600g ×5min；第三步设置离心条件为：1100g ×5min；S4，离心完毕后，离心管内的细胞液分为三层，上层为血浆，中层为脐带血干细胞，下层为红细胞，移取中层脐带血干细胞至另一离心管内；S5，在收集脐带血干细胞的离心管内加入生理盐水进行稀释，轻轻混匀后进行离心分离，离心分离的条件设置为500g ×5min，离心后再用生理盐水洗涤沉淀层；其中，所述的生理盐水中含有浓度为1-3％的脑蛋白水解物，最后收集离心管底部的脐带血干细胞。