生物化学实验设计
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实验:从牛奶中分离制备酪蛋白
一、实验目的与要求:
学习从牛奶中分离制备酪蛋白的原理和方法。
二、实验基本原理:
一种蛋白质混合液,如果需将所有的蛋白质与其他杂蛋白质分离出来,可根据这种蛋白质与其他杂蛋白理化性质的差异,用适当的方法将该蛋白质从蛋白质混合液中分离出来。
一般常用的分离方法(粗分离)有等电点,演盐析法,有机溶剂的分级沉淀法等。
这些方法简便、处理量大,能除去大量的杂蛋白,又能浓缩蛋白质溶液。
牛奶中的主要蛋白质是酪蛋白,含量约为35g/L。
酪蛋白是一些含磷蛋白的混合物,等电点为4.7,且不溶于乙醇。
利用蛋白质在等电点是溶解度最低的原理,将牛奶的PH调至4.7时,酪蛋白就能沉淀出来,用乙醇,无水乙醚洗涤沉淀物,除去脂类等杂质后便可得到较纯的酪蛋白。
三、实验材料与试剂:
1、实验材料:纯鲜牛奶
2、实验试剂:(1)0.2mol/L乙酸——乙酸钠缓冲液(PH4.6)
(2)95%乙醇
(3)无水乙醚
(4)无水乙醇——无水乙醚混合液[1:1(V/V)]
四、实验器材:
1、离心机
2、离心管(50ml)
3、精密PH试纸或酸度计
4、抽滤装置
5、100℃温度计
6、恒温水浴箱(40℃)
7、电子天平 8、烧杯 9、量筒
10、吸管及表面皿
五、实验操作方法:
1、酪蛋白的分离制备
(1)将10mL牛奶加热到40℃,倒入50mL离心管中,在搅拌下慢慢加入预热到40℃、PH4.6的0.2mol/L乙酸——乙酸钠缓冲液10mL,用
PH试纸或酸碱度检验,混合物的最后PH应是4.6。
(2)将上述悬浮液冷却至室温,离心5min(5000r/min)。
弃去上清液。
得酪蛋白粗制品(沉淀物)。
(3)用水洗沉淀2次,向沉淀中加入20mL左右的水(用玻棒将沉淀打碎)。
离心5min(5000r/min)。
弃去上清液。
(4)用乙醇,无水乙醚洗涤沉淀,在沉淀中加入20mL95%乙醇,搅拌片刻(尽可能充分地把沉淀块打碎)将全部悬浊液转移至布氏漏斗中
抽滤,用无水乙醇——无水乙醚混合液洗涤沉淀2次,抽干。
最后
用无水乙醚洗涤沉淀2次,抽干。
(5)将沉淀摊开在表面皿上,风干,得酪蛋白纯品。
2、计算酪蛋白的质量浓度和得率
准确称量从牛奶中分离出来的酪蛋白纯品
(1)计算酪蛋白实际的质量浓度
实际质量浓度以1L牛奶中酪蛋白的质量(g)表示
(2)计算得率
酪蛋白得率%=(酪蛋白实际质量浓度/ 酪蛋白理论质量浓度) * 100% 式中:牛奶中酪蛋白的理论质量浓度为35g/L。