MAGE-A1、MAGE-C2及SSX-1在原发性肝细胞癌中的表达及意义
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山东医药２００８年第４８卷第４５期 ＭＡＧＥ—Ａ１、ＭＡＧＥ。Ｃ２及ＳＳＸ一１在原发性 肝细胞癌中的表达及意义
蔡俊 ，张富喜 ，陈红松 （１北华大学附属医院，吉林吉林１３２０１１；２北京大学人民医院）
・论著・
［摘要］ 目的检测肿瘤一睾丸抗原（ＣＴ抗原）ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ—Ｃ２和ＳＳＸ一１ ｍＲＮＡ在原发性肝细胞癌 （ＨＣＣ）中的表达情况。方法采用ＲＴ—ＰＣＲ方法检测ＭＡＧＥ—Ａ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２和ＳＳＸ一１ ｍＲＮＡ在５５例ＨＣＣ患者癌及 癌旁组织中的表达，对产物进行测序，并对检测结果与Ｉ临床指标进行分析。结果５５例ＨＣＣ患者的癌组织中， ＭＡＧＥ—Ａ１、ＭＡＧＥ．Ｃ２和ＳＳＸ—ｌ ｍＲＮＡ的表达率分别为６０．０％、１４．５％和４０．０％；癌旁组织无表达。结论 ＣＴ抗原 ＭＡＧＥ—Ａ１、ＭＡＧＥ—Ｃ２和ＳＳＸ．１ ｍＲＮＡ在ＨＣＣ中呈高表达，是ＨＣＣ免疫治疗的理想靶位。 【关键词］ 肿瘤一睾丸抗原；癌，肝细胞；逆转录一聚合酶链反应 ［中图分类号］ Ｒ７３５．７ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １００２—２６６Ｘ（２００８）４５－０００１－０３
Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ－ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ｃ２ ａｎｄ ＳＳＸ一１ ｍＲＮＡ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ＣＡ／Ｊｕｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｆｕ—ｘｉ，ＣＨＥＮ Ｈｏｎｇ—ｓｏｎｇ （１ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＢｅｉｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｊｉｌｉｎ １３２０１１，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＡＧＥ—Ａ１，ＭＡＧＥ－Ｃ２ ａｎｄ ＳＳＸ一１ ｍＲＮＡ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｅｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｒｅｖｅｒｓｅ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｇｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ・ＰＣＲ）ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｃａｎｃｅｒ－ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ（ＭＡＧＥ—Ａ１，ＭＡＧＥ—Ｃ２ ａｎｄ ＳＳＸ－１）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔ｝ｌ ＨＣＣ．ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ—ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ－ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐ￣ａｍｅ— ｔｅｒｓ ｗａｇ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ ５５ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＣＣ，ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ＭＡＧＥ—Ａ１，ＭＡＧＥ－Ｃ２ ａｎｄ ＳＳＸ一１ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ６０．０％，１４．５％ａｎｄ ４０．Ｏ％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｍＲＮＡｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ＣＴ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｊａｃｅｎｔ ｎｏｎ— ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＭＡＧＥ—Ａ１，ＭＡＧＥ—Ｃ２ ａｎｄ ＳＳＸ一１ ｍＲＮＡｓ ａｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ ｉｎ ＨＣＣ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅｙ ｍａｙ ｂｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ＨＣＣ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃａｎｃｅｒ－ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ；ｈｅｐａｔｏｅｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ
２００５年１１月～２００６年３月，我们应用ＲＴ—ＰＣＲ 法对５５例原发性肝细胞癌（ＨＣＣ）患者的癌及癌旁 组织中肿瘤一睾丸抗原（ＣＴ抗原）ＭＡＧＥ－Ａ１、 ＭＡＧＥ．Ｃ２和ＳＳＸ．１ ｍＲＮＡ的表达进行了检测，了解 这些ＣＴ抗原ｍＲＮＡ在ＨＣＣ中的表达情况，并探讨 其ｍＲＮＡ表达与临床指标间的关系，以期为ＨＣＣ的 特异性肿瘤疫苗免疫治疗提供依据。 １材料与方法 １．１材料ＨＣＣ标本５５例，癌组织及癌旁组织标 本均取自术中，先切取癌旁组织（距肿瘤边缘５ ［基金项目］教育部２００７年度“新世纪优秀人才支持计划”（９８５－２— ０９９—１１３）；８６３项目（２００７ＡＡ０２１１０３）。 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｈｅｎ２９９９＠ｓｏｈｕ．ｔｏｎｉ ｃｍ），再切取癌组织。将取下的标本迅速切成０．３ ｃｍ ｘ０．３ ｃｍ ｘ０．３ ｃｍ大小装入冻存管中，经液氮速 冻后保存于液氮罐中。癌及癌旁组织均经病理证 实，并记录临床资料，包括年龄、性别、ＨＢＶ感染、血 清ＡＦＰ水平、肿瘤大小、临床分期等。ＴＮＭ分期参 照国际抗癌协会的ＴＮＭ分期标准…。其中男５Ｏ 例、女５例，年龄２２～７６岁、平均４９岁。 １．２方法 １．２．１ ＲＮＡ的提取 取标本３０ ｍｇ，用ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ试剂盒（ＱＩＡＧＥＮ）提取组织总ＲＮＡ。根据 试剂盒中方法提取组织总ＲＮＡ后，电泳鉴定ＲＮＡ 提取质量，并根据２６０ ｎｍ波长处的吸光度对ＲＮＡ 进行定量。 １．２．２ ｃＤＮＡ的合成取２ ｔｒｇ ＲＮＡ标本，加入５００ ｎｇ随机引物和５００ ｎｇ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５后，加ＤＥＰＣ处 理的超纯水至１２ ｌ。７０℃水浴１０ ｒａｉｎ，冰浴２ ｒａｉｎ。加入８ ｔｒｌ反应混合液（包括１ ｌ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ的 ＤＴＹ、ｌ ｌ １０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ、２０ Ｕ ＲＮＡ酶抑制剂、 ２００ Ｕ逆转录酶ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔⅢ、４ ｌ逆转录缓冲液， ？昆匀后４２℃水浴１ ｈ，然后７Ｏ℃水浴１５ ｍｉｎ。 １．２．３ 目的基因的ＰＣＲ扩增取ｃＤＮＡ ２００ ｎｇ，用 ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ聚合酶进行ＰＣＲ扩增。引物： ＭＡＧＥ．Ａ１： ５ 一ＣＧＧＣＣＧＡＡＧＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＣＡＧ＿３ ， ５ 一ＧＣＴＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＧＣＧＴＴＧＣＣ一３ ，４２１ ｂｐ；反 应条件：９４ ｏＣ １ ｍｉｎ，６５℃１ ｍｉｎ，７２℃１ ｍｉｎ。 ＭＡＧＥ—Ｃ２：５ 一ＴＧＴＡＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＴＧ一 ３ ， ５ ．ＡＡＧＣＴＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＡＣＧＧＧＣＴＣＴＣＴＴＧ—３ ， ７５６ ｂｐ；反应条件：９４ ｏＣ １ ｍｉｎ，６８ ｏＣ １ ｍｉｎ，７２℃１ ｒａｉｎ。ＳＳＸ一１：５ 一ＣＴＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＣ－ ３ ，５ 一ＡＧＡＴＣＴＣＴＩ ＩＴＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡ．３ ，４２２ ｂｐ；反应条件：９４ ｏＣ １ ｍｉｎ，５７℃１ ｍｉｎ，７２℃１ ｍｉｎ。 １３．ａｃｔｉｎ：５ ．ＧＧＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＧ－３ ，５ 一ＧＣＴＧ— ＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡ一３ ，６１３ ｂｐ；反应条件：９４ ｑＣ １ ｒａｉｎ，５５℃１ ｍｉｎ，７２ ｏＣ １ ｒａｉｎ。所用引物均为跨外 显子设计。在ＰＴＣ一１００ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ 仪（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ公司）中扩增３５个循环。ＰＣＲ反应 重复３次，均在产物大小位置出现特异性条带视为 阳性。睾丸组织做为阳性对照，试剂空白作为阴性 对照。Ｂ—ａｃｔｉｎ做为内参照检测ｃＤＮＡ合成质量。取 ＰＣＲ产物１０ ｌ进行１．５％琼脂糖凝胶电泳（含终 浓度为０．５ ｍｌ的ＥＢ），ＧＥＬ Ｄｏｃ２０００凝胶自动 成像仪下观察电泳结果并分析。 １．２．４ ＤＮＡ序列测定为了验证ＰＣＲ扩增结果， 在各种目的基因呈阳性表达的ＲＴ—ＰＣＲ产物中随机 选择５例，进行ＤＮＡ序列测定（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＤＮＡ自 动测序仪）。 １．２．５统计学方法采用ＳＰＳＳ １１．５统计软件。 计数资料用百分数，计量资料以 ±ｓ表示；两组间 计量资料比较用ｔ检验，计数资料比较用 检验。 检验水准 ＝０．０５。 ２结果 ２．１ ＣＴ抗原在ＨＣＣ中的表达ＭＡＧＥ—Ａ１、ＭＡＧＥ— ｃ２和ＳＳＸ．１ ｍＲＮＡ在５５例ＨＣＣ患者中的阳性率 分别为６０．０％（３３／５５）、１４．５％（８／５５）和４０．０％ （２２／５５），癌旁组织无表达。见图ｉ。 ２．２ ＣＴ抗原的共表达在所检测的５５例ＨＣＣ患 者中，至少表达一种ＣＴ抗原的有６１．８％（３４／５５）， 至少表达两种ＣＴ抗原的有３８．２％（２１／５５），３种 ＣＴ抗原都表达的有１２．７％（７／５５）。 ２
＾ＩＩＡＧＥ．Ａｆ ＭＡＧＥ．Ｃ２ ＳＳＸ．｛
山东医药２００８年第４８卷第４５期
图１ ３种ＣＴ抗原ｍＲＮＡ在ＨＣＣ中的表达 注：Ｍ为Ｍａｒｋｅｒ；１为癌旁组织；２～９为ＨＣＣ组织标本；Ｐ为阳 性对照（睾丸组织）；Ｎｅ为阴性对照 ２．３ ＣＴ抗原的表达与临床指标的关系除了ＳＳＸ．１
ｍＲＮＡ的表达与年龄有关外（Ｐ＜０．０５），ＣＴ抗原的表 达与其他临床指标（年龄、性别、ＨＢＶ感染、血清ＡＦＰ 水平、肿瘤大小、临床分期）无显著相关性（Ｐ＞ ０．０５）。ＳＳＸ一１ ｍＲＮＡ表达阳性组的平均年龄高于 ｍＲＮＡ表达阴性组的平均年龄（Ｐ＜０．０５）。 ３讨论 ＣＴ抗原广泛表达于多种肿瘤组织中，而在除睾 丸外的其他正常组织中不表达。睾丸不表达ＨＬＡ 分子，为免疫豁免组织，因此以ＣＴ抗原为主要成分 的疫苗可以通过诱导患者的免疫应答杀伤肿瘤细 胞，而不损伤正常细胞。ＣＴ抗原目前发现有３８个 基因家族，８５个成员，如ＭＡＧＥ家族、ＢＡＧＥ家族、 ＳＳＸ家族等 。 本研究中，ＭＡＧＥ—Ａ１、ＭＡＧＥ—Ｃ２和ＳＳＸ一１ ｍＲ ＮＡ在ＨＣＣ组织中的阳性表达率分别为６０％、 １４．５％和４０％，在癌旁组织无表达，这就使得利用 这３种ＣＴ抗原作为肿瘤疫苗用于肝癌患者的特异 性免疫治疗成为可能。在这３种ＣＴ抗原中， ＭＡＧＥ—Ａ１和ＳＳＸ一１表达率较高，因而是对肝癌进行 免疫治疗的理想靶抗原。ＭＡＧＥ—Ｃ２的阳性率为 １４．５％，低于王万祥等 Ｊ和赵力等 报道的３２．６％ 和５６．２％，这可能与发患者群、地区不同有关。 肿瘤细胞表达ＣＴ抗原常为异质性表达，因此 多价瘤苗的疗效要好于单一多肽瘤苗，可以避免因 某一种抗原的丢失而导致免疫治疗的失败，从而扩 大了免疫治疗适用的范围。多价疫苗使用的基础是 肿瘤表达多种ＣＴ抗原。我们研究发现联合３种ＣＴ 抗原可以覆盖６１．８％的肝癌患者，这使得利用多价 疫苗进行肝癌的免疫治疗成为可能。 我们还对ＣＴ抗原的表达与患者年龄、性别、 ＨＢＶ感染、血清ＡＦＰ水平、肿瘤大小和ＴＮＭ分期等 临床指标的关系进行了统计学分析。其中ＳＳＸ．１ ｍＲＮＡ表达与年龄有关，表达阳性组的平均年龄高 于阴性组的平均年龄。其余两种ＣＴ抗原的阳性表 达组的平均年龄均高于阴性表达组，但统计学分析 未见显著性差异。这种随年龄增高表达率升高的趋
