聚乳酸载药纳米微粒的表面修饰及体外评价_胡云霞
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文章编号:0258-8021(2004)-01-30-07聚乳酸载药纳米微粒的表面修饰及体外评价胡云霞, 原续波, 张晓金, 郭 毅, 常 津*(天津大学材料科学与工程学院纳米生物技术研究所,天津300072)摘 要: 本研究的目的是用O -羧甲基壳聚糖作乳化剂和表面修饰剂,采用超声乳化法制备聚乳酸载药纳米微粒,并对聚乳酸载药纳米微粒进行表面修饰,然后分别对载药纳米微粒的表面形貌、粒径分布、微粒结构、表面元素、体外释放和肿瘤细胞抑制率等微粒性能进行考察与评价。
实验证明,O -羧甲基壳聚糖可用于制备纳米药物载体系统,对聚乳酸载药纳米微粒的制备起到很好的乳化性能和表面修饰作用。
采用复乳法制备包载5-Fu 的PL A/O -CM C 纳米微粒的平均粒径在50nm,在P BS 缓冲溶液中释放时间可达12d 。
在对胃癌、乳腺癌和大肠癌三种肿瘤细胞的抑制率测定实验中,PL A/O -CM C 纳米微粒的肿瘤细胞抑制率分别可以达到72.8%、77.3%和75.6%,接近或等同于游离5-F u 药物的抑制率。
在作用时间上,PLA /O -CM C 载药纳米微粒也显示出良好的缓释效应。
关键词: O -羧甲基壳聚糖;聚乳酸;纳米微粒;表面修饰;缓释中图分类号: R318.08文献标识码:A 引言由于O -羧甲基壳聚糖是一种水溶性良好的壳聚糖衍生物,有很好的乳化性能,可以用来制备聚乳酸-O -羧甲基壳聚糖载药纳米微粒,并对载药纳米微粒可以起到很好的表面修饰作用。
利用O -羟甲基壳聚糖为新的纳米药物缓释载体和表面修饰剂有如下优点[1]:(1)O -羧甲基壳聚糖是具有良好生物相容性和生物降解性的高分子材料,对人体无毒无害;(2)聚乳酸端链含有羧基,带负电荷,O -羧甲基壳聚糖带正电荷,将二者制备成纳米微粒,可调节微粒结构中正负电荷的比例,从而降低由过强正电荷产生的载体本身的细胞毒性;(3)O -羧甲基壳聚糖为水溶性高分子,可改善微粒表面的亲水性;(4)O -羧甲基壳聚糖表面富含两种官能团:-NH 2和-COOH,便于对微粒表面修饰,同时可以与其它靶向性物质(如单抗)相连接,增强微粒的靶向性,提高疗效;(5)O -羧甲基壳聚糖为多糖类物质,可与某些肿瘤表面的多糖受体结合,增加载药纳米微粒的肿瘤靶向性。
本实验拟准备采用广谱抗癌药物5-Fu 作为水溶性药物模型,采用复乳法[2]制备载药纳米微粒,用O -羧甲基壳聚糖为复乳乳化剂,对载药纳米微粒进行表面修饰。
进而改善载药纳米微粒的表面亲水性,调整纳米微粒的表面电荷,降低载体本身的细胞毒性和提高纳米微粒的分散性。
1 实验部分1.1 仪器与材料聚乳酸(DL 型)(重均相对分子质量分别为10KD,50kD):山东医疗器械研究所。
降解后的聚乳酸(重均相对分子质量分别为10kD):自制。
O -羧甲基壳聚糖(O -CMC)(重均相对分子质量分别为100kD):自制。
5-氟尿嘧啶原药:天津市人民制药厂。
H ITACH IX -650型扫描电子显微镜:PH ILIPS 公司。
PHI -1600光电子能谱仪(XPS):Perkin -Elm er 公司。
100CX -Ò透射电子显微镜:Gelo 公司。
表面张力仪DCAT21型:Data Physics 公司。
1.2 复乳法制备载药纳米微粒将1ml 5%(w /w)的5-Fu 碱溶液在超声条件下加到一定体积的1%(w/w )降解聚乳酸二氯甲烷溶液中,超声5min 使之成为均一稳定的初乳液。
然后在超声条件下将100m l 0.4%(w /w )O -羧甲基壳聚糖水溶液滴加到初乳液中,超声10min 后形成复乳体系。
将此复乳在电磁搅拌条件下挥发4h,形成固体纳米微粒。
第23卷第1期2004年2月中国生物医学工程学报CHINESE JOURNAL OF BIOMEDICAL ENGINEERING Vol.23N o.1Februar y 2004基金项目:国家重大基础研究(973)项目前期研究专项基金资助(2001CCC01400);国家自然科学基金(50373033)天津市科委重点基金资助项目(013616611);天津市科委重点科技攻关项目(023111711)*联系人收稿日期:2003-07-23;修回日期:2003-10-31采用高速离心得到白色沉淀,冷冻干燥后得到白色粉末。
1.3 聚乳酸/O -羧甲基壳聚糖载药纳米微粒的表征1.3.1 载药纳米微粒表面分析用原子力显微镜观察O -羧甲基壳聚糖-聚乳酸载药纳米微粒表面形态,并用透射电子显微镜观察载药纳米微粒的结构和粒径,结合光电子能谱仪对载药纳米微粒表面进行能谱分析。
1.3.2 O -羧甲基壳聚糖溶液表面张力的测定取30ml 不同溶度的O -羧甲基壳聚糖溶液,置于表面张力仪专用的测量杯中,用表面张力仪测量溶液的表面张力。
1.3.3 载药纳米微粒的体外释放精密称量10m g 的载药纳米微粒,置于透析袋中,放入10ml PBS 溶液。
然后在37e ,72RPM 的摇床中进行释放。
每隔一段时间用紫外检测释放出的药的含量,并更换新的PBS 溶液[1]。
1.3.4 MTT 法测定载药纳米微粒对肿瘤细胞的抑制率采用MDA -M B -231乳腺癌细胞系,H CT -8大肠癌细胞系和803胃癌细胞系。
分别设载药纳米微粒,5-Fu,空白微粒和对照组,加药量分别为20L g/100L l,在37e 下分别培养24h,48h,72h,96h,120h 后按照参考文献[4]进行观测和测定。
2 结果与讨论2.1 载药纳米微粒的表面分析2.1.1 原子力显微镜(AF M)分析本实验采用原子力显微镜(AFM )分析了载药纳米微粒的表面形貌和粒径分布。
通过载药纳米微粒的AFM 照片(图1),我们可以看到微粒具有光滑的表面形貌和相对均一的粒径分布。
因此可以得出:利用O -羧甲基壳聚糖作为乳化剂和表面修饰剂,通过超声乳化法可制得平均粒径为50nm的载药粒子。
图1 载药纳米粒子的AFM 照片图2 载药纳米粒子的TEM 照片(@100000)31 第1期胡云霞等:聚乳酸载药纳米微粒的表面修饰及体外评价2.1.2 透射电子显微镜(TEM)分析本实验还采用透射电子显微镜(TEM )分析纳米微粒的表面结构和粒径大小。
由纳米载药微粒的透射电镜照片(图2)可以看出:采用W/O/W 复乳法制备的纳米微粒有明显的核-壳结构存在,微粒表面有高聚物包裹或缠绕,并且包裹的高聚物占整个微粒的1/4~1/2。
这可以说明O -羧甲基壳聚糖对微粒表面起到很好的修饰作用。
2.1.3 光电子能谱(XPS)分析本实验利用光电子能谱仪对载药纳米微粒的表面进行元素分析。
图3是载药纳米粒子表面的XPS 全谱,图谱显示表面含有N 元素,而制备聚乳酸-O -羧甲基壳聚糖纳米微粒所用的基质材料中只有O -羧甲基壳聚糖含有N 元素,这就说明了所制备的纳米微粒的外层含有O -羧甲基壳聚糖。
从表1和图3可以看出,经O -羧甲基壳聚糖表面修饰的载药纳米微粒的C1s 和N1s 峰与O -羧甲基壳聚糖的C1s 和N1s 峰十分相似,而与聚乳酸微粒的差别很大,这可进一步说明O -羧甲基壳聚糖覆盖在微粒表面,起到很好的表面修饰作用。
然而O -羧甲基壳聚糖表面修饰的载药纳米微粒的C -O 和C=O 的相对含量都要比O -羧甲基壳聚糖的含量高,这可能是由于微粒中PLA 的C -O 和C=O 造成的。
由于微粒粒径在20~100nm 之间,表面O -羧甲基壳聚糖所覆盖的范围在5nm~50nm 之间,光电子能谱仪(入射角60~90b )对高聚物所测量的范围在几十纳米,所以完全能测到微粒中聚乳酸部分。
O -羧甲基壳聚糖表面修饰的载药纳米微粒的NH +3的增强可能是由于微粒表面的-NH 2被降解聚乳酸的-COOH 所质子化所致。
因此,XPS 证实了O -羧甲基壳聚糖对聚乳酸微粒表面起到很好的修饰作用,即微粒表面含有NH +3和-COOH,为以后连接靶向制剂(如单克隆抗体和表皮生长因子等)和采用联合用药的方案(如微粒表面吸附和络合基因)奠定了基础。
图3 各种微粒的X 光电能谱32中国生物医学工程学报第23卷表1 不同样品的XPS 数据样品元素峰位(eV)归属面积(%)284.8C -C 36.7O -CM C 表面C1s 286.4C -OH 40.8修饰的载药287.8C -N 15.3纳米微粒288.7C=O 7.2N 1s 399.24NH 349.8400.58+NH 350.2284.8C -C 68.2C1s 286.4C -OH 20.4O -CM C 287.8C -N 4.9288.7C=O 6.5N 1s 399.24NH 371.4400.58+NH 328.6284.95C -C 47.2PLA 载药纳米微粒C1s287.06C -O 25.5289.08C=O 27.32.2 O -羧甲基壳聚糖的乳化性能2.2.1 O -羧甲基壳聚糖,壳寡糖和聚乙烯醇的乳化性能比较在复乳法制备纳米微粒的过程中,乳化剂对微粒的粒径和成粒性影响很大。
而乳化剂溶液的表面张力与其乳化性能呈明显的负相关性。
一般来说,乳化剂的表面张力越小,其乳化性能越好。
聚乙烯醇是目前广泛应用的乳化剂,具有良好的乳化效果。
由图5可以看出,同浓度下O -CMC 的表面张力与PVA 的差别很小。
从制得微粒的SEM 照片(图4)可以看出,同样条件下采用O -CM C 作外水相比PVA 作外水相制得的纳米微粒粒径小且分布均一,这进一步证明O -CM C 具有比PVA 更优良的乳化性能。
相对来说,壳寡糖的表面张力较大,这也间接说明其乳化性能不如PVA 与O -CMC,所制得的微粒粒径较大。
然而聚乙烯醇仅用作乳化剂,而自身官能团单一,不能对聚乳酸微粒表面起到很好的改性作用。
而O -羧甲基壳聚糖不仅具有类似于聚乙烯醇的乳化效果,而且由于其分子链上官能团较多并便于与其他官能团反应,可以对微粒表面起到很好的表面修饰和改性作用。
这为今后在纳米微粒表面连接抗体等靶向制剂奠定了基础。
0.4%PV A(2万倍)0.4%O -CM C(1万倍)0.4%寡聚糖(1万倍)图4 不同外水相制得的NP s 的SEM 照片2.2.2 O -羧甲基壳聚糖浓度与其乳化性能及表面修饰效果的关系从图6可以看出,随着O -CM C 浓度的增加,其表面张力有依次降低的趋势,O -CM C 的乳化性能逐渐提33 第1期胡云霞等:聚乳酸载药纳米微粒的表面修饰及体外评价高,对微粒表面的修饰效果变好,微粒表面N 元素的含量提高(图7),说明O -CMC 在微粒表面的分布增多,对微粒表面的修饰效果变好。
而且随着O -CM C 浓度的增加,微粒的粒径逐渐减小,这进一步证实O -CMC有很好的乳化性能。