免疫组化经验总结
冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么？
1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染色效果要比冰冻切片好一些。
2、从研究目的来看。石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。
3、从抗原的保真性来看。冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程中可能会对抗原的性质造成影响。
4、从操作步骤的繁琐程度看。染色过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。
5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立即固定、染色效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。
如何避免荧光素提前衰退？
1、从荧光标记的二抗孵育开始、二抗孵育后的清洗、保存均要进行避光；
2、选择质量好的荧光素标记的二抗：亲和力强且衰退时间延长；
3、用含有抗荧光萃灭的封片液来封片；
4、拍照时尽量缩短激发光对切片的照射时间，最好在暗场环境；
5、保存要用指甲油封固后4度避光保存。
6、荧光素标记的二抗浓缩液一定要避光保存：没加石蜡，最后-70度以下低温保存；若加了石蜡油，则-20度保存即可。
普通荧光显微镜的操作指南和注意事项？
1、操作指南：
（1）关闭房间内的电灯，开启显微镜汞灯。为延长汞灯的使用寿命，汞灯开启不到15-30分钟的请在15-30分钟后关闭汞灯。再次打开汞灯电源的间隔时间也应该在15-30分钟以上，避免反复开关。
（2）根据样品荧光素选择相应荧光组件。使用减光片对荧光强度适当调整（因为荧光强度不可调，所以只能使用各种减光片来调整观察效果）
（3）选择滤光片。常用的有绿、蓝、紫、紫外等，分别对应不同的激发光波长。
（4）放好染色切片，找到合适的视野。在荧光状态下观察标本，标本内的荧光会较快的衰减，所以要避免长时间的在荧光下观察，可以先在明场下调整好要观察的位置再使用荧光。
（5）需拍照先确认照相机已装好。
（6）使用结束关闭所有电源并做好使用记录。
（7）如需详细说明，请借阅说明书。
2、主要事项：
（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。
（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5~15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。
（3）防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。
（4）检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h。
（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后。
（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。
（7）荧光亮度的判断标准：一般为四级，即“—”——无或可见微弱自发荧光。“+”——仅能见明确可见的荧光。“++”——可见有明亮的荧光。“+++”——可见耀眼的荧光。
（8）所使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油。
（9）电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
如何最大限度地降低非特异性染色和背景着色？
产生原因：
（1）游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
（3）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
（6）荧光素不纯、标本固定不当等。
（7）一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。
（8）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。
消除方法：
（1）购买高质量、高纯度的荧光素二抗。
（2）二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。
（3）调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。
（4）增加清洗次数和延长清洗时间。
（5）延长血清封闭时间。
（6）适当稀释二抗浓度至出现特异性染色阳性，而非特异性染色保持阴性。
一抗孵育的条件和浓度如何摸索？
1、孵育条件选择：根据大量外文文献参考，4度过夜的最多，37度或直接室温的较少。故可以按照4度过夜+室温或37度复温（增进抗体抗原结合和防止脱片）。
2、组织切片的选择：仅选择某一组同一只动物标本，这样才有可比性，且最好是预想肯定阳性的组别中的动物切片。
3、一抗浓度摸索：主要参照说明书推荐的浓度，并结合文献中对于某种组织的大概浓度范围，同时也要考虑不同公司之间同一抗体的浓度和效价的不同。从最高浓度向低浓度方向多摸索几个梯度，等浓度摸索好后，在大量的做不同组别的切片。
自发荧光可能原因有：
（1）游离荧光素残留在二抗中，故新买的二抗最好进行透析或层析除去游离荧光素，尽量买高质量的二抗。
（2）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之相应抗体结合。通过延长血清孵育时间来封闭非特异性抗原。
（3）一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。
（4）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。
（5）适当稀释二抗浓度至出现特异性染色阳性，而非特异性染色保持阴性。
1、石蜡切片和冰冻切片的比较？
（1）要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是今天我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
（2）冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
（3）石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻
切片比较麻烦，一定要存在-80度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
2、一抗的选择要点和技巧是什么？
（1）单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
（2）应用范围的选择。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。
（3）种属反应性的选择（species reactivity）。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。
(4)种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。
(5)生产厂家的选择。如santa Cruz公司抗体一般1ml，价格2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul，价格2800元左右。这两个厂家的同一种抗体它的实际效价稳定是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做Western blotting效果还可以。
3、在什么情况下使用Triton-X100？
（1）Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学(>10um厚切片) 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。
（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
（3)Triton X-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用，具体参阅：https://www.doczj.com/doc/ba15838185.html,/bbs/post/view?bid=68&id=12301317&sty=1
4、封闭血清的选择原则是什么？
（1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！
（2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。
（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
5、抗体孵育条件的比较？
（1）一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。
（2）二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。
6、一抗4度孵育后为什么要进行37度复温？
（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；
（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
（3）其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩！
7、DAB显色时间如何把握？
（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；
（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；
（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；
（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
8、免疫组化结果如何分析？
（1）阳性着色细胞计数法。在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。
（2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
（3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。
对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。
9、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？
（1）由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。
（2）修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。
（3）微波修复，我们一般用6min*4次，效果不错。
10、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？
（1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min。
（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片.
（3）现用现配，配好后4度避光保存。
11、如何才能充分脱蜡？
（1）蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；
（2）脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。
（3）当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果魁伟更好。
总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。
12、如何最大限度地降低组织非特异性染色？
（1）缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。
（2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。
（3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
（5）缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；
（6）适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；
（7）防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。
13、苏木素复染时间的把握？
（1）苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。
（2）盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。
（3）如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。
14、PBS的清洗方式选择、次数和时间的选择？
（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。
（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。
冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。
（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。
冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续2分钟左右就完全足够了。
（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。
刘彦仿指出：中性及弱硷性条件（PH7－8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。［］免疫组化P56我们目前常用的PBS的PH在7.4-7.6浓度是0.01M，根据本室十几年来的使用情况，认为该溶液价格便宜配制方面，使用效果好。
（5）常用试剂的配制和使用。
在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加、换、切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。
15、脱片产生的原因和如何防止脱片？
（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。
（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。
（3）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。
（4）没烤好，时间短温度不够之类。
（5）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
（6）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。
（7）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。
16、背景染色较深的原因有哪些？
（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
（4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记
滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO 笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4oC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
17、苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长?
答：返蓝可以用碱性溶液（PBS/NA2HPO4/淡氨水）或45度温水、冷水蓝化均可。一般蓝化5~10 min。淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵。
免疫组化技术及其注意事项 一、免疫组化染色前处理技术操作规范 1、取材：理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm，大多数实验室都认为组织在加热抗原修复过程中造成脱片的主要原因是取材过厚或脱水浸蜡处理不当所致。良好的取材、固定、脱水过程是免疫组化质控的前提，如果H&E切片都做不出满意的染色结果，那么免疫组化染色也将无从谈起,根本无法保证染色质量。 2、固定：在众多的组织固定液中（如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛等），不同的实验方法在使用上各有千秋。但在保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上，福尔马林是最好、既经济又通用。而含酸或含汞的固定液对抗原保存均不理想。组织离体后固定一般不要超过30分钟，在常温条件下固定时间为8-24小时。同时还要注意避免福尔马林过度固定造成的组织抗原丢失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林一周固定后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检测，因为组织固定后会引起蛋白或蛋白分子之间形成交联，导致抗原位点遮盖，可以通过抗原修复方法来修正，若加抗体前不采用抗原修复，则免疫组化染色常不能到达理想结果或不成功。组织同样不能长时间放置在70%的乙醇中，酒精固定后的组织形态不如福尔马林固定的组织.脱钙液对抗原破坏较为严重，因此在组织脱钙前最好在福尔马林液中固定48小时，若组织没有固定透则酸会破坏抗原，脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在最低的限度。 3、浸蜡：我们认为浸蜡温度应控制在58~60℃左右，浸蜡用的石蜡应经常更换，以减少石蜡中二甲苯的含量。高温下的二甲苯容易使组织发脆，细胞收缩，更容易掉片。 4、切片厚度：用于免疫组织化学染色的切片厚度为3-4微米。为防止在染色过程中脱片，需要使用硅化玻片裱片。 5、硅化玻片的制备：载玻片经酸洗冲洗干净后烤干；2%APES丙酮或无水酒精中浸泡1~2min；丙酮或无水酒精洗1~2分钟；蒸馏水浸洗1~2min；烤干备用。 6、烤片：切片在60℃~65℃烤箱中烤片30-60分钟左右。有些实验室采用烤片过夜。有报导烤片温度超过60℃时，烤片时间超过18小时的切片，免疫组化染色强度比烤4小时的切片要略弱。温度过高或时间过长均会影响抗原的活性，原因是在高温干燥条件下可以加速组织切片中抗原的氧化。 7、切片保存：一些实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温
文读懂 免疫组化步骤、结果分析及注意事项 导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：想拿高分 文章，不学免疫组化怎么行？” 免疫组化王子毛博旁边插话： 是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry ），是 项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。这实在是一件憾事。 如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机10 个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0 分阴性着色，1 分淡黄色，2 分浅褐色，3 分深褐色）
和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。 免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝技。 1.对照染色 和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照 般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身 对照。般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照 就足够了。 2.定位 抗原表达必须在特定部位。如LCA 应定位在细胞膜上；CK 应定位在细胞浆内；PCNA 及p53 蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。 3.半定位 现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。 因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的 半定量一般就分为三级：弱（+ ），中++ ），强（+++ ）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
免疫规划工作总结 通过我们的不懈努力，在消灭和控制相应传染病中，已显现出免疫规划工作的良好效果。**年我县与全省同步实施扩大国家免疫规划以来，为保证该项工作的顺利实施，我县及时制订了《扩大国家免疫规划实施方案》和《实施扩大国家免疫规划民生工程工作督导方案》，以科学发展观为先导，积极探索新时期工作新模式，取得了较好工作效果。 一、加强领导，认真贯彻落实《 我县把实施扩大国家免疫规划作为卫生工作的重点，切实加强了领导。成立了*县实施扩大国家免疫规划民生工程工作督导活动领导小组，全面负责活动的组织实施，以保证扩大国家免疫规划各项工作落实到位，确保全县适龄儿童享受一类疫苗免费接种政策。 二、进一步加强预防接种单位管理和人员培训工作。 继续按照《关于进一步加强预防接种单位认定和人员培训工作的 三、加大免疫规划知识的宣传。 免疫规划知识和免疫规划国家政策的宣传对免疫规划接种工作的开展十分重要。根据省、市卫生厅(局)关于开展预防接种宣传周活动的通知精神，为落实扩大国家免疫规划工作，向公众宣传国家免疫规划政策和预防接种知识，每年的4月21至25日开展了形式多样的宣传活动。根据宣传主题在电视台播放了预防接种知识光碟，各预防接种门诊今年悬挂了“及时接种疫苗，人人享有健康”的宣传横幅，张贴宣传画，在街头开展了现场宣传咨询活动，发放了宣传单等。通过宣传，广泛普及了预防接种知识，提高了全社会参与国家免疫规划工作的积极性和主动性，营造了全社会参与实施国家免疫规划的氛围。
四、进一步加强冷链、疫苗和注射器使用管理。 实施扩大国家免疫规划工作以后，一类疫苗的种类和注射器的种类都增加了，给管理带来一定的难度。因此，县疾控中心根据《规范》要求统一印刷了疫苗出入库登记簿、注射器出入库登记簿、冷链温度记录簿、疫苗发放登记簿、冷链设备档案记录表等，免费发放给各接种单位。建立健全各项管理 五、全面加强规范化接种门诊建设和常规免疫接种工作。 我县自20**年县疾控中心预防接种门诊率先达到a级规范化接种门诊后， 20**年至20**年先后有12家乡级预防接种门诊通过了县卫生局b级规范化接种门诊的考核验收，实现了定时、定点、定人员为适龄儿童提供及时的免疫接种服务，确保国家免疫规划疫苗接种率达到目标要求。为适应扩大免疫规划接种服务的需要，县疾控中心新建设了设施和功能更为齐全规范的预防接种门诊，提高了接种服务水平。 我县20**年通过省卫生厅“以乡(镇)为单位儿童计划免疫接种率90%达标”考核以后，进一步加强了常规疫苗的接种工作，巩固了90%达标的成果。近三年接种率调查显示均在95%左右。**年以来，为了确保新增的一类疫苗接种率达80%以上，各乡级接种门诊改变了以往按月接种模式，乡级实行按旬或按周接种制度，确保了适龄儿童得到及时、有效、安全的预防接种服务。 六、进一步提高扩大国家免疫规划疫苗接种率。 目前，我县有21家预防接种单位，由于地域关系及流动儿童和留守儿童的 增多，使得以往的免疫接种服务形式很难适应如今的扩大免疫规划工作。为此，我县下发了有关文件，每年开展两次以上免疫规划查漏补种工作，要求各乡结合学校查验儿童预防接种证有效开展免疫规划疫苗查漏补种工作，特别是加强新增一类疫苗和脊灰疫苗等加强免疫的查漏补种工作;加强免疫薄弱地区、流动和留守
免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切 片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
2017免疫规划工作总结3篇 xx年我疾控中心免疫规划工作，在县卫生局和中心领导的领导下，在上级业务部门的指导下，按照工作计划要求，为广大适龄儿童提供了全面、规针接种率%。 二、疫苗冷链管理工作： (1)县疾控中心对疫苗冷链管理高度重视，在中心网站上上传了《疫苗冷链管理制度》，要求各乡镇预防接种单位要规轮强化免疫活动。开展全面培训、宣传工作，成立流动服苗组对城区人群聚集区进行了投苗活动，确保活动全面覆盖，全统计应种儿童人，实种儿童人，接种率100%，达到了上级制定的≥95%活动目标。 四、规十多年来，在各级党政部门的正确领导下，在上级业务主管部门的大力支持和精心指导下，我县广大卫生防疫工作者，坚持贯彻预防为主的方针，通过我们的不懈努力，在消灭和控制相应传染病中，已显现出免疫规划工作的良好效果。**年我县与全省同步实施扩大国家免疫规划以来，为保证该项工作的顺利实施，我县及时制订了《扩大国家免疫规划实施方案》和《实施扩大国家免疫规划民生工程工作督导方案》，以科学发展观为先导，积极探索新时期工作新模式，取得了较好工作效果。一、加强领导，认真贯彻落实《条例》和《方案》。 我县把实施扩大国家免疫规划作为卫生工作的重点，
切实加强了领导。成立了××县实施扩大国家免疫规划民生工程工作督导活动领导小组，全面负责活动的组织实施，以保证扩大国家免疫规划各项工作落实到位，确保全县适龄儿童享受一类疫苗免费接种政策。 二、进一步加强预防接种单位管理和人员培训工作。 继续按照《关于进一步加强预防接种单位认定和人员培训工作的通知》，完善接种单位资质认定工作。20**年6月底前已认定25家预防接种单位。20**年以来对预防接种人员进行了多次培训，今年4月15日，再次对从事免疫规划工作人员74人进行了扩大国家免疫规划知识与技能培训，培训结束后进行了考试，对考核合格者发给了上岗证。 三、加大免疫规划知识的宣传。 免疫规划知识和免疫规划国家政策的宣传对免疫规划接种工作的开展十分重要。根据省、市卫生厅关于开展预防接种宣传周活动的通知精神，为落实扩大国家免疫规划工作，向公众宣传国家免疫规划政策和预防接种知识，每年的4月21至25日开展了形式多样的宣传活动。根据宣传主题在电视台播放了预防接种知识光碟，各预防接种门诊今年悬挂了”及时接种疫苗，人人享有健康”的宣传横幅，张贴宣传画，在街头开展了现场宣传咨询活动，发放了宣传单等。通过宣传，广泛普及了预防接种知识，提高
教你如何看懂花了好几千的免疫组化报告单 免疫组化是用标记的特异性抗原（抗体）对组织内抗体（抗原）的分布进行检测。免疫组化虽然价钱昂贵，却有不能替代的作用： ①恶性肿瘤的诊断和鉴别②确定转移性恶性肿瘤的原发部位③对某类肿瘤进行病理分型④明确软组织肿瘤的正确组织学分类，明确软组织的诊断⑤发现微小转移灶⑥为临床治疗方案提供支持虽然免疫组化有那么多作用，但是很多患友拿到手了根本就看不懂，都是些英文缩写，代表着什么意思呀，别着急，下面小编就按照字母顺序列张表，告诉大家各个代表什么意思： 项目临床意义Actin肌动蛋白，间叶组织来源标记，平滑肌、血管内皮、肌上皮组织表达。AE1/AE3细胞角蛋白 AE1/AE3，标记上皮及上皮来源的肿瘤，鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性，如胆管细胞阳性，肝细胞阴性，鉴别肝癌和胆管癌。AFP甲胎蛋白，肝癌细胞表达，胃和肝脏同时肿瘤时，胃肝样腺癌HepPar-1、AFP、CK19 和CDX-2等4 种不同程度阳性表达，而肝细胞癌CK19 和CDX-2不表达。ALK间变型淋巴瘤激酶，用于淋巴造血来源标记，间变性大细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和炎症性肌纤维母细胞瘤的诊断。AMACR甲基酰基辅酶A消旋酶，癌特异
性指标，只存在于癌症组织。结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤和黑素瘤等过度表达，以结直肠癌和前列腺癌表达最高。Bax促进凋亡蛋白，同Fas/FasL。Bcl-2抑制细胞凋亡相关基因-2，肿瘤预后指标，高表达者对多数抗癌药物、放射治疗耐受，高表达者预后差。Bcl-6B淋巴细胞凋亡相关基因-6，抑制细胞凋亡作用，淋巴造血细胞来源标记，用于B淋巴瘤诊断。Bel-XL抑制细胞凋亡相关基因-XL，Bcl-2 抑制细胞凋亡基因家族成员之一，作用同Bcl-2 。Cam5.2人角蛋白抗原决定簇，正常分泌上皮表达，复层鳞状上皮不表达，用于鉴别腺癌和鳞癌。CD10分化簇10，间叶组织来源标记，未成熟淋巴细胞阳性表达，用于B细胞淋巴瘤、慢性髓性白血病等诊断，某些非造血肿瘤子宫内膜间质肉瘤、恶性黑色素瘤、肾细胞癌也可阳性。CD117分化簇117，间叶组织来源标记，胃肠间质瘤细胞阳性表达，阳性者可用格列卫靶向治疗。某些肿瘤如黑色瘤、白血病、皮肤纤维瘤、血管肉瘤、尤文氏瘤、胶质瘤也可阳性。CD14脂多糖LPS受体，单核细胞、巨噬细胞等细胞表面分化抗原,用于单核细胞和组织细胞相关病的鉴别诊断。CD15半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原标记，成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等阳性表达。用于霍奇金淋巴瘤、胃癌、结直肠癌、甲状腺癌、乳腺
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
免疫规划工作整改材料 在县局及疾控部门的领导下，我镇儿童预防接种工作发展迅速，为保障儿童和青少年健康成长发挥了巨大作用。 一、全镇免疫规划工作所取得的成就 从2007年国家扩大免疫规划工作以来，全镇免疫预防工作历经8年，通过村医的不懈努力，打下了良好的工作基础，取得了令人瞩目的成就。主要体现在： 1、建立了覆盖全镇的接种服务体系，完善了疫苗冷链系统和疾病监测网络。 2、实施免疫接种机构的规范化管理，健全了一系列预防接种管理制度。 按照《免疫接种工作管理规定》，依据“区域规划、定点接种、资格认证、规范管理”的原则，对全镇免疫接种点、接种门诊、接种人员进行统一规划，合理设置，实行资格认证。为保证免疫规划得到科学、规范、有序的实施，为免疫规划工作实施提供了管理和技术保障。 3、实现区域无脊髓灰质炎证实目标。 4、将乙肝疫苗纳入免疫规划，努力提高新生儿及时接种率。 通过实施乙肝疫苗纳入免疫规划和GAVI项目工作，设立产科接种点并加强管理，全镇新生儿乙肝疫苗及时接种率有了较大的提高。乙肝疫苗首针及时接种率达到100%，全程接种率99%。 5、实施加速控制麻疹策略，努力预防和控制麻疹发病。 6、有效预防和控制了疫苗可预防的传染性疾病。 免疫预防是我国卫生事业成效最为显著、影响最为广泛的工作之一。60年代初期，全国通过接种牛痘疫苗消灭了天花，通过坚持和推广预防接种工作，其他疫苗可预防疾病都得到有效控制。其它疫苗
可预防的传染性疾病如流脑、乙脑、新生儿破伤风、风疹、甲肝、腮腺炎发病率均显著下降。 7、全镇儿童预防接种信息化管理系统建设工作顺利推进。 根据卫生部建立全国儿童预防接种信息化管理系统的统一安排，2008年初，儿童预防接种信息化管理系统建设试点，信息化管理系统建成后，不仅可以为适龄儿童提供更为便捷的预防接种服务，而且可以为公众提供实时预防接种信息查询，增强了预防接种的管理和服务能力。 二、全镇免疫预防工作存在的问题和面临的挑战。 1、免疫预防专业人员有待补充，队伍需要稳定。 免疫预防专业人员数量本来就不足，素质需要进一步提高，扩大国家免疫规划后，工作量将成倍增加，对免疫预防工作队伍提出了更高的要求，免疫规划队伍急需得到调整、充实。 2、人口的流动等因素使免疫规划管理工作难度增加。 人口的流动性为免疫规划管理增加了难度。目前全镇可预防传染病还时有发生，暴露出我镇个别行政村的疫苗接种、特别是流动人口的接种管理存在问题；全镇乙肝感染率仍然很高，相关疾病的负担依然很重；全镇甲肝发病率虽然呈持续下降趋势，尤其在农村中、小学；流脑、乙脑、风疹、腮腺炎等传染病的预防和控制，尚需引起高度重视，扩大国家免疫规划疫苗接种，是利国利民的大事，全镇要学习和借鉴兄弟单位的经验，针对免疫预防工作中存在的问题，落实各项工作措施，保证全镇实施扩大国家免疫规划的工作落到实处。 孟坝中心卫生院 二0一五年八月七日
细胞免疫组化染色步骤 1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。 2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。 5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。PBS洗三次，每次5分钟。 6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。 9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。 10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min 11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。 12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。 稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。 淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化) 另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。我没用淡氨水溶液。若为悬浮细胞则需涂片，20μl即可。
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
2019-‘免疫规划信息管理系统’应用工作总结-精选word文档 本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！ == 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ == ‘免疫规划信息管理系统’应用工作总结 免疫规划信息管理系统应用工作总结 自201X年6月份沧州市“免疫规划信息管理系统”正式运行以来，经过一年半的应用，系统越来越完善，我们的工作质量也越来越提高了。“免疫规划信息 管理系统”是现代信息科技和计划免疫完美结合的结晶，它的诞生标着着我市 计划免疫工作站上了一个新的高度，本人有总结三点如下： 一：告别落后，与时俱进。 传统的扒大卡时代已经跟不上时代的进程了，落后的就要淘汰。上级领导和计 算机业界精英的搞联合的创举是英名的，睿智的，广的人心的。二：告别虚假，迎来真实 不可否认，以前手工的报表是不完全真实的，现在不同了，儿童信息从一出生 就是完全真实的，打了几针，该打什么针，清清楚楚。全地区联网，区域内的 流动儿童可以全程正规接种。信息是真实的，接种记录是真实的，报表也是真 实的。 三：告别繁琐，方便快捷 不用微机管理几千个孩子，和用微机管理的工作效率自不可同日而语，系统给 我们带来的好处不言自明。 综上，“疫规划信息管理系统”是我们计免工作的神兵利器，有了它我们如虎 添翼，工作蒸蒸日上，接种率全面提高，传染病发病率全面下降。希望世窗公 司再接再厉，把系统维护的更好更先进，为全市的计免工作做出更大的贡献， 把系统推向全国，为全国人民服务。 窝北中心卫生院 201X-12-12 ?荐市场部副总经理半年度工作总结(共6篇) ?荐学校教科室主任履职工作总结(共6篇) ?荐药监局干部个人工作总结(共6篇) ?荐如何写申报职称的专业技术工作总结(共6篇)
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策 良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。 一、无色片 染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了
过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了
亲爱的朋友，很高兴能在此相遇！欢迎您阅读文档免疫规划年度工作总结，这篇文档是由我们精心收集整理的新文档。相信您通过阅读这篇文档，一定会有所收获。假若亲能将此文档收藏或者转发，将是我们莫大的荣幸，更是我们继续前行的动力。 免疫规划年度工作总结 免疫规划年度工作总结 XX年我疾控中心免疫规划工作，在县卫生局和中心领导的领导下，在上级业务部门的指导下，按照工作计划要求，为广大适龄儿童提供了全面、规范的预防接种服务，建立和形成了较高的群体免疫屏障，为预防和控制相应传染病打下了基础，现将上半年年工作总结如下： 一、儿童疫苗接种率： (1)XX年上半年全县新出生儿童6787人，建卡、建证率100%。 (2)儿童基础免疫报告接种率：乙肝疫苗接种率99.93%,乙肝疫苗首针及时率97.89%;卡介苗接种率99.79%;脊灰疫苗接种率99.87%;百白破疫苗接种率99.84%;含麻疫苗(麻风、麻疹)接种率99.71%;a群流脑疫苗接种率99.81%;乙脑疫苗接种率99.75%;甲肝疫苗接种率96.71%。 (3)儿童加强免疫报告接种率：百白破疫苗接种率99.81%;含麻疫苗(麻疹、麻腮、麻腮风)接种率99.7%;乙脑疫苗接种率
99.77%;脊灰疫苗接种率99.71%;a+c流脑疫苗第一针接种率 99.62%;a+c流脑疫苗第二针接种率99.75%。 二、疫苗冷链管理工作： 县疾控中心对疫苗冷链管理高度重视，在中心网站上上传了《疫苗冷链管理制度》，要求各乡镇预防接种单位要规范相关温度记录设备、制度齐全，有专人负责、资料齐全。上半年县疾控中心共启动冷链系统运转2次，均使用冷链车或冷藏包将疫苗直接运转到各预防接种门诊，疫苗冷链运输记录齐全，确保疫苗效价。运转了一次性1ml注射器12万支，自毁型0.5ml注射器10万支。保障了全县各适龄儿童得到及时、有效的’预防接种服务。 三、脊灰疫苗强化免疫工作： XX年1月5日-6日，我县按照上级安排，对XX年1月1日至XX年10月6日出生儿童进行了脊灰疫苗第二轮强化免疫活动。开展全面培训、宣传工作，成立流动服苗组对城区人群聚集区进行了投苗活动，确保活动全面覆盖，全统计应种儿童人，实种儿童人，接种率100%，达到了上级制定的≥95%活动目标。 四、规范化预防接种门诊工作： 规范化预防接种门诊创建是一项长期性工作，在XX年1-6月,疾控中心对各乡接种门诊建设、资料管理等工作情况进行了3次督导检查，对检查结果下发了通报，对预防接种门诊提出了
免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法 1)将石蜡切片置于烤片机烘烤２－３h,{因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，所以应烤片2-3h,除非组织的抗原性较稳定，则时间可长一点}后可把烤好的组织切片，放在60℃烤箱中过夜，最佳时间控制在14-18h{乳腺病理处省略此步骤}。取组织切片于切片架，用吹风机吹至产生蜡液，不可靠太近，以免使组织切片局部温度过高，破坏组织切片。 2）常规脱蜡 ({二甲苯脱蜡，在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长}二甲苯I 20min →二甲苯II 20min→二甲苯Ⅲ20min →无水乙醇10min（清洗二甲苯）→无水乙醇10min→95%乙醇5min→80%乙醇5min) {梯度酒精用无水酒精与蒸馏水配置} 目的：把水渗入组织切片中，给细胞创造一个水溶性环境 <以下步骤是为细胞染色做准备> 3）捞出，放入铁缸内，用凉清水冲洗3次{如果组织容易脱片，就尽量泡一下，这样脱片可以减少很多}； 4）将配好的柠檬酸盐抗原修复液（抗原修复液的量为稍高于横向放倒的切片架的高度）{EDTA配制方法：EDTA修复液使用比例：EDTA:蒸馏水=1:49,每次最好配制1000ml。EDTA修复液重复使用最好不要超过5次，并且3次之后要测PH值，测PH是否为9.0，如偏离太大则弃用。枸橼酸修复液只能用一次。修复的原因：因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得抗原性物质形成醛键，羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇。另外，蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。在染色时，要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态}{用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也可，因其抗原修复效果比柠檬酸盐的好，可从另外的问题上着手}灌入高压锅中，不旋紧，盖上即可，210℃烧至沸腾后，把切片架放入横向放倒，旋紧锅盖，待喷气时，开始计时2min-2min30s,如果组织不易染色，可延长修复时间，但一般不超过3min，否则容易掉片。 5）到时间后，把高压锅放入水池中用凉水冲至气体放出完，旋下锅盖，自然冷却至室温，大于30min。 6）冷却后取出切片架用凉清水冲洗3次，放入3% H2O2 罐中10min，目的：封闭过氧化物酶。【每天用前新放入10ml H2O2 】【配制方法：1000ml 3%的过氧化氢=100ml 30%过氧化氢+900ml蒸馏水，（H2O2保存需避光）】 7）捞出后用凉清水冲洗多次，应注意H2O2 有腐蚀性，最后一次用PBS（磷酸盐缓冲液），PBS
2017年免疫规划工作总结 我乡做好儿童计划免疫工作，消灭针对传染病，是造福子孙、利国利民的一项德政工程和民心工程。为认真贯彻、执行《中华人民共和国传染病防治法》、《疫苗流通和预防接种管理条例》，做好2017年免疫规划工作，特总结如下： 1、认真做好常规免疫接种工作 我院按照《预防接种工作规范》的要求，认真组织开展常规基础和加强免疫接种工作。主动搜集免疫工作薄弱区域和外来流动儿童，要保证儿童免疫接种率的持续高水平。在安全注射的基础上确保免疫规划接种疫苗的接种率达98%以上。其中, 乙肝529针次，脊灰1035剂次（包括ipv270针次），百白破916针次，白破388针次，麻风247针次，麻腮风206针次，乙脑484针次，a群流脑484针次，a+c流脑644针次,甲肝231针次,水痘101针次，ev71 78针次，hib10针次，共接种5522次，接种1746人。 2、规范计划免疫建证工作 实行儿童预防接种证制度，使用区疾控中心统一安排印制的《儿童预防接种证》，新生儿出生后一个月内应建证，确保儿童规范建证率达100%，每次接种时应核对卡、证，并填写完整。 3、完成全乡规范化接种门诊建设 规范化接种门诊建设是为加强计划免疫工作的规范化管理，提高预防接种的有效性和安全性，在原有的基础上认真完善资料的收
集整理工作。 4、保证计划免疫冷链正常运转 认真检查冷链设备的运转情况，每天上、下午都要进行运转情况检查，记录冷冻、冷藏室温度，损坏的要及时修理，报废的应立即更新，确保冷链正常运转，以保证疫苗效价，使每名儿童都能得到有效免疫接种安全注射，管理一次生注射器按时销毁处理。 5、强化儿童入托、入学预防接种证查验工作 全乡开展儿童入托、入学预防接种证查验工作，防止计划免疫针对传染病在校园内发生流行的有效手段，我院计划免疫配合学校的查验工作，对学校的入学、入托儿童查验预防接种工作的技术指导和培训，安排好未种儿童的补证、补种工作。 6、开展免疫规划宣传工作 全乡积极发挥社会各方面力量，充分利用广播，挨家挨户宣传等多种形式，大力宣传国家免疫规划政策和成就，以及实施免疫规划对保护公众健康的重要意义。开展经常性宣传与“4.25”预防接种日宣传活动，广泛普及预防接种知识，提高全社会参与国家免疫规划工作的积极性和主动性，营造良好的社会氛围。 7、完善相关资料的整理 要及时完成计划免疫相关资料的整理上报，每次接种后要及时上报儿童计划免疫常规接种率报表，全年不得少于12次。接种完成后及时上报接种数据，AFP、麻疹,乙肝，新生儿破伤风，无迟报、漏报。计划免疫工作资料应于次年的元月底前上报。
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理: 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB 显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液 应用液B Na2HPO4·12H2O 114.8g配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加8.5gNaCl。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A 枸橼酸 10.55g配成1000毫升溶液 应用液B 柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠） 29.01g 配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠0.2g，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras 1:50-1:500 H-Ras 1:50-1:500 K-Ras 1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2 切片脱蜡水化程序
2017年免疫规划工作汇总报告 2017年我乡免疫规划工作，在上级卫生主管及防疫部门的指导下，强化领导责任，提高认识，认真贯彻落实免疫规划工作使我乡、预防接种工作、儿童免疫信息化管理及流动人口管理等各项工作取得显著成效，各种疫苗接种率保持在较高水平上，相应传染病得到有效控制，现将免疫规划工作情况汇总报告如下： 一、加强免疫规划知识的宣传教育，提高群众自我保护认识 为了提高群众对传染病防护思想，有效提高各种疫苗的接种率，把疫苗相应传染病消灭在萌芽中，保护儿童身体健康，进一步促进我乡免疫规划工作的开展，按照上级要求，认真做好计划免疫知识日常宣传，利用计划免疫预防接种期间，积极向群众宣传各种疫苗预防的疾病，接种疫苗的好处等，利用在“4.25”全国预防接种宣传活动日7.28肝炎防治，发放各种疫苗防病宣传单，解答群众咨询的有关问题，在利用公共卫生健康教育宣传，张贴宣传单、挂宣传横幅、办黑板报等形式向群众宣传免疫规划针对传染病预防知识，受到群众的欢迎。 二、加强免疫规划专业知识及接种技术培训工作： 为了提高我乡免疫规划工作人员的业务素质，提高接种技术水平，我们积极参加县卫生防疫站组织的免疫规划知识培训、儿童预防接种信息管理系统操作培训，并按照上级业务部门的要求，定期对我乡预防接种人员及村级接种相关人员进行免疫规划相关知识的培训，据统计，免疫规划接种技术及
注意事项次，累计参加人次。通过培训，有效提高了我们的业务水平，杜绝了预防接种差错事故的发生。 三、加强疫苗相应传染病的主动监测，发现疫情及时上报处理： 为了防止疫苗相应传染病的发生和流行，我们根据上级要求，要求医院医务人员及各村乡村医生发现传染病可疑病例及确诊病例及时上报，同时每旬我们安排专人对医院门诊日志、病房出入院登记进行核对，是否有疑似AFP、麻疹、新生儿破伤风、病毒性肝炎等传染病病例，及时汇总监测情况，按时上报监测报表，对发现的疑似传染病及时上报。 四、流动人口管理工作： 流动人口管理是预防接种工作一项重要内容，为了防止疫苗相应传染病的输入，消除免疫空白，我们按照上级文件指示精神，加强流动人口的监测，详细记录流动人口适龄儿童迁入迁出时间及接种记录，确保免疫规划疫苗的按时接种。对接种剂次不全电话在通知. 五、加强预防接种门诊规范化建设与儿童计划免疫信息微机化管理： 根据上级有关要求，我们加强预防接种门诊的建设与管理，积极创造条件，搞好儿童计划免疫信息微机化管理，为了提高各种接种及时率，我们将日接种，及时安排上次因故未种儿童的接种时间，使各种疫苗均能在免疫程序要求时间内接种。同时为了保证儿童接种史数据上传质量，我们对新生儿全部及时录入电脑，儿保专干入户通知新生儿预防接种事项和办理手续。六、搞好适龄儿童各种疫苗接种预约和接种通知的发放，提高疫苗接种率：