免疫组化染色过程中存在的问题原因分析及对策

影响免疫组化的因素及对策（一）免疫组化染色假阳性及其对策1 、消除内源酶的影响在涉及免疫过氧化酶的各种染色中，均用过氧化物酶来标记抗体，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，正常组织中也含有一定量的过氧化物酶，其同样也能催化底物显色，而影响免疫组化染色的特异性，因此在加入标记酶前应设法将其灭活，以保证染色反应的特异性。

通常情况下，去除内源酶的方法是先用3%的过氧化氢溶液作用，但在含有丰富血细胞的标本中，由于血细胞中存在大量具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢产生强烈的反应，产生气泡而破坏组织结构和细胞形态。

在OCT 包埋的冰冻切片中，使用3%的过氧化氢化溶液亦会产生类似现象。

此时可用3%的过氧化氢甲醇溶液孵育20 分钟的方法灭活内源性酶。

灭活内源酶对正确判断含血细胞较多的标本，如骨髓、胎盘、脾等的染色结果十分重要。

同样，正常细胞也含生物素，尤以肝、脾、肾组织含量为多。

在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形成亲和素（或链亲合素）- 生物素复合物，导致假阳性发生。

消除这种非特异性着色的方法，是在采用生物素方法染色前，对标本进行亲和素处理，使其结合位点饱和。

2 、抗体导致的非特异性着色高纯度、高效价的抗体是免疫组化染色的关键。

出现下列情况时，可能发生非特异性着色。

（ 1 ）因抗原不纯而导致制备的抗体不纯，常见于多克隆抗体。

可用亲和层析的方法除去非特异性抗体或应用高纯度的抗原制备抗体，采用单克隆抗体能避免非特异着色。

（ 2 ）标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇，解决的方法只有采用针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体。

3 、消除非特异性背景着色非特异性着色最常见的情况是蛋白质（抗体）吸附到组织切片中高度荷电的胶原及结缔组织成分上，防止非特异性背景着色的方法之一是在滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液，封闭荷电点不给一抗留有吸附余地，以保证一抗不会吸附到胶原纤维及结缔组织成分上。

最常用的无关蛋白质溶液是所用二抗的同种动物非免疫血清。

免疫组化染色出现棕色团块
免疫组化染色过程中出现棕色团块，可能是由于以下原因造成的：
1.抗原与抗体结合：免疫组化技术利用抗原抗体反应的原理，当抗原与抗体特异性结合时，会形成棕色的免疫复合物沉淀，这是正常的反应结果。

2.显色剂显色：免疫组化染色过程中，使用特定的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）对组织细胞内的抗原进行标记和显色。

如果显色剂使用不当或出现异常情况，可能会导致棕色团块出现。

3.其他因素：免疫组化染色过程中，操作不当、组织处理不当、缓冲液浓度不合适、抗体浓度不合适等因素也可能导致棕色团块的出现。

如果免疫组化染色过程中出现棕色团块，可以尝试以下方法进行解决：
1.检查显色剂：首先检查使用的显色剂是否正确、新鲜、无污染等，并按照说明书上的要求正确使用。

2.检查抗原抗体：确认抗原抗体是否正确配比，并保证抗体浓度合适。

如果发现抗原或抗体的质量有问题，需要更换优质的抗原或抗体。

3.检查缓冲液：检查所使用的缓冲液是否正确配制，浓度是否合适。

如果缓冲液有问题，需要重新配制缓冲液。

4.检查操作过程：仔细检查整个免疫组化染色过程，确认每一步操作都正确无误。

如果操作不当导致棕色团块的出现，需要重新按照
正确的方法进行染色。

1941年co ons首先用荧光素标记抗体,检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功,从而创建了免疫组织化学技术。

经过60余年的不断发展,由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了间接法,免疫酶法,免疫胶体金法,酶标记复合法等等。

该方法的敏感性和特异性不断得到提高,使其成为医学和生命科学领域中研究组织形态、功能和代谢的一项有力工具[1—3]。

随着该技术应用的普及和深入,免疫组织化学(免疫组化)染色技术作为病理诊断的主要辅助手段,各种新技术的引入以及新抗体相继问世,使免疫组织化学技术得到了更广泛的推广和应用,为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供了重要依据。

但是,由于影响其操作的因素较多,免疫组化质量不稳定常常困扰着免疫组化工作人员。

本文举出了一些染色过程中出现的问题,并分析其中可能原因。

1.阴性反应染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。

排除掉组织或细胞中确实不表达与抗体相关的抗原的原因外,还可能是染色过程中的某一或某些环节出了问题,出现了假阴性结果。

可能原因如下:1.1操作失误有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达,却未进行抗原修复[1,2];或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,也可见于染色过程中漏掉了某一环节;还可能是所选用的检测系统与一抗不匹配,如选用的一抗是兔源性抗体,二抗错选了抗鼠源性抗体。

解决办法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗滴在一张白纸上,再将配制好的DAB滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。

如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程正确。

如果不出现棕色反应,则三抗或DAB的配制过程有误。

1.2假阴性造成假阴性结果的因素一般来自三方面:1.组织处理不当,抗原损失过多或被遮蔽;2.抗体(包括特异性一抗和标记抗体)失活,效价过低或稀释度不合适;3.染色步骤的差错或其他试剂的问题,如显色剂、缓冲液的离子强度及ph值[3]。

解决阴性染色的问题,需要设立“阳性对照”和“阴性对照”。

免疫组化染色结果不清爽的原因
免疫组化染色是一种重要的实验技术，用于检测细胞或组织中的蛋白质表达。

但是，有时候免疫组化染色结果会不清晰，这可能是由于以下原因：
1. 样品质量不佳。

如果样品中的蛋白质含量不足或存在严重的脱水、变性或降解等现象，免疫组化染色结果可能会不清晰。

2. 抗体质量问题。

如果使用的抗体质量不佳，可能会导致免疫组化染色结果不清晰。

例如，抗体可能过期了，或者存在批次差异。

3. 操作不当。

在免疫组化染色过程中，如果操作不规范或者不仔细，可能会导致结果不清晰。

例如，过度洗涤、过度染色或者不恰当的显色反应条件等。

4. 数据分析问题。

如果在数据分析过程中没有正确地处理图像，可能会导致结果不清晰。

例如，图像可能过于模糊或者过于亮，这可能会影响结果的解读。

因此，在进行免疫组化染色实验时，需要注意样品质量、抗体选择和操作规范等问题，以确保结果的清晰和可靠性。

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免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及其对策良好的免疫组化染色切片是正确推断染色结果的基础和前提。

由于免疫组化染色过程中存在许多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件特别简单的事。

需要病理技术员和病理医生亲密协作、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。

虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和"杂音'染色片（有阳性信号）。

一、无色片染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。

这是常规工作中比较常见的现象，消失这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有消失问题，组织或细胞的确不表达与抗体相关的抗原。

2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。

假阴性结果又可分为两种状况：（1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。

消失这种状况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。

获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。

由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不行缺少的作用。

（2）染色过程中的某一或某些环节出了问题。

比如，组织未进行抗原修复，有的组织必需经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个渐渐的过，但间或也遇到突然失效的状况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的缘由。

也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如遗忘加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。

为了避开这种简洁的错误，有一种简洁的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观看是否消失棕色。

假如消失了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。

假如这种DAB再滴到切片上没有消失任何阳性信号，问题肯定是出在三抗以前。

一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。

在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。

因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。

另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。

离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。

标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。

虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。

因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。

二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。

如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。

由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。

因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。

三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。

如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。

免疫组化没染上的原因一、基本概述免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗原 - 抗体特异性结合原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量研究的技术。

没染上可能是由于多方面原因造成的。

二、原因类型介绍1. 样本相关原因样本固定问题固定剂的选择和使用不当。

例如，使用福尔马林固定时，如果浓度不合适或者固定时间过长或过短，可能会破坏抗原结构，导致后续抗体不能与之结合，从而染不上色。

样本处理过程中的损伤在组织切片制备过程中，如切片过厚或过薄都会影响染色效果。

过厚的切片可能会使抗体难以穿透到组织内部与抗原结合；过薄的切片则可能会丢失部分抗原。

2. 抗体相关原因抗体特异性和质量问题选择的抗体特异性不强，可能会与非目标抗原发生交叉反应，或者根本不能识别目标抗原。

此外，抗体的质量不佳，如保存不当导致抗体失活，也会使染色失败。

抗体浓度不合适抗体浓度过高时，可能会产生非特异性结合，导致背景染色过深而目标抗原染色不清晰；抗体浓度过低则可能无法与抗原充分结合，导致染不上色。

3. 检测系统相关原因显色底物问题显色底物的选择、保存和使用条件不当。

例如，底物过期或者与检测系统不匹配，可能无法产生有效的显色反应。

检测方法和设备问题检测方法的灵敏度不够，如采用的放大系统不合适。

同时，检测设备如显微镜的性能不佳，不能准确观察到染色结果，也可能被误认为是没染上。

三、原因构建方法1. 样本方面通过对固定剂种类、浓度和固定时间的逐一排查来确定固定是否存在问题。

例如，设置不同浓度的福尔马林固定组和不同固定时间组，然后进行免疫组化染色，观察染色结果。

在样本处理过程中，使用不同厚度的切片进行染色实验，对比染色效果，从而确定切片厚度是否合适。

2. 抗体方面进行抗体特异性验证实验，如采用多种抗体针对同一抗原或者采用已知阳性和阴性对照样本进行测试。

对抗体进行梯度稀释，设置不同浓度的抗体染色组，观察染色效果，以确定合适的抗体浓度。

免疫组织化学技术常见问题分析及对策阳性对照标本和待测标本均无着色1. 可能原因分析1.1 抗体选择不当，不适合做IHC。

抗体保存不当，超过有效期或反复冻融导致抗体效价过低或失活。

1.2 抗体工作浓度过低，特别是一抗的浓度过低。

同时也有可能是抗体孵育时间过短、温度偏低。

1.3 二抗与一抗种属不匹配，如一抗为鼠源性抗体，二抗没有使用抗鼠的抗体。

1.4 贴片法IHC染色有可能是抗体流失导致切片干燥。

1.5 石蜡切片未进行抗原修复或酶消化等前处理时间过长破坏了待检测抗原决定簇。

1.6 缓冲液PH值不当或含有酶活性抑制剂，如叠氮钠是过氧化物酶活性抑制剂。

1.7 DAB显色时间过短；显色底物不应该含有叠氮钠；在DAB显色时，显色液应该新鲜配制。

1.8 复染、脱水和封片剂的选择与显色系统不匹配。

1.9 阳性对照标本选择不合适，该标本不含有待检测抗原或与所用一抗试剂不匹配。

2. 处理方法2.1 确认使用抗体的各类抗体试剂的正确保存方法，保证其效价。

如果确认抗体已经失效，及时更换。

2.2 检查二抗是否与一抗种属匹配。

2.3 适当提高抗体浓度，优化孵育条件。

保证抗体孵育箱温度为37℃，或增加孵育时间，如4℃孵育48小时。

2.4 标本孵育盒平稳放置，防止孵育液流失。

2.5 参考文献选择标本类型适合的蛋白酶消化方法和抗原修复处理方式与条件。

2.6 调节缓冲液至对应正常的PH值，保证不含酶活性抑制剂。

2.7 重新配制DAB显色液，并保证配制方法、浓度、正确、有效，适当延长显色时间。

2.8 选择正确的阳性对照切片。

阴性对照标本未着色，而阳性对照标本和待测标本呈弱阳性1. 可能原因1.1 标本固定方式不正确，如固定不及时、固定液量太少、固定液失效或组织处理方式不当。

1.2 抗体保存不当，超过有效期或反复冻融导致抗体效价过低或失活。

1.3 抗体浓度太低，特别是一抗的浓度过低，或者抗体孵育时间过短、温度偏低。

1.4 贴片法染色时标本上含有缓冲液，导致抗体浓度稀释。

免疫组化实验遇到的问题分析及改进方法1石蜡切片在染色过程中出现脱片现象1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；2）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做；3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。

2边缘效应1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。

解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。

2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。

解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。

用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

3产生组织切片非特异性染色1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。

这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。

这是最重要的一条；2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5）DAB孵育时间过长或浓度过高；6）PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；7）标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

4免疫组化染色呈阴性结果1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；2）抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。

有人做过实验，这是最佳的时间和次数。

若不行，还可高压修复；3）组织切片本身这种抗原含量低；4）血清封闭时间过长；5）DAB孵育时间过短；6）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；7）开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

免疫化学染色技术常见问题及解决方法染色不足
2. 阳性对照有足够的特异性染色，背景干净；组织显示很少或没有特异性染色，但在几种组织成分中有不同的程度的背景染色。

背景染色
1. 背景染色见于所有对照组织和标本组织，或在一些组织成分，如结缔组织、脂肪和上皮组
2. 标本组织和阴性试剂对照玻片显示背景染色，阳性和阴性对照组织显示正确的特异性染色；
局灶性背景染色
1. 在对照、标本和玻片的局部区域出现染色不一致
2.标本中的脂肪或结缔组织、阴性对照组织和阳性对照试剂玻片中，背景染色出现在结缔组织和上皮组织中
3. 标本中的上皮组织、阴性对照组织、阳性对照组织和阴性对照试剂玻片中，特别在上皮呈中至强染色；背景染色出现在结缔组织和上皮组织中
7. 应用生物素—链菌素卵白素染色系统时，在所有对照和标本组织中均见背景染色
不正确的“特异性”染色
1.在标本组织、阳性对照、阴性组织对照和阳性试剂对照的白细胞胞膜出现阳性染色。

鸡胚石蜡组织切片免疫组化中的问题探讨及方法改进介绍鸡胚是实验室中常见的材料，被广泛用于生物学研究中。

在对鸡胚进行研究时，组织切片免疫组化技术是常见的研究手段之一。

但是，在实际应用中，鸡胚石蜡组织切片免疫组化中常常会遇到一些问题，例如染色效果不理想、特异性较差、溶解度低等。

本文将针对这些问题进行探讨，并提出相应方案进行改进。

问题探讨染色效果不理想染色效果不理想是鸡胚石蜡组织切片免疫组化中常见的问题之一，其主要原因可能有以下几种：1.酶解反应不充分酶解反应是制备免疫组化切片的重要步骤之一，其目的是从组织中去除内源性过氧化物酶和碱性磷酸酶等干扰因素，以提高染色效果。

如果酶解反应不充分，会导致去除的内源性干扰因素不足，影响染色效果。

2.抗体浓度过低抗体是免疫组化染色的关键因素之一，抗体浓度过低会导致对靶分子的检测能力下降，从而影响染色效果。

3.蛋白质结构破坏在组织处理过程中，蛋白质可能会被破坏，这会影响抗体的结合能力，从而影响染色效果。

特异性较差特异性较差是另一个常见的问题，其主要原因可能有以下几种：1.交叉反应在染色过程中，抗体可能会与非目标蛋白质发生交叉反应，导致特异性下降。

2.细胞外固定化合物（CFAs）的影响CFAs是细胞表面或细胞外的分子，可以与抗体结合并影响染色效果。

3.协同作用某些蛋白质可能存在协同作用，这会导致当其中一个蛋白质的表达发生改变时，其他蛋白质的表达也会被影响，从而影响免疫组化的特异性。

溶解度低溶解度低是另一个常见的问题，其主要原因可能有以下几种：1.缓冲液配制不当缓冲液是影响溶解度的关键因素之一，配制不当会导致溶解度降低。

2.聚集抗体可能会发生聚集，聚集体的溶解度较低，这会导致溶解度降低。

3.pH值不当 pH值对溶解度也有较大的影响，如果pH值不当会导致溶解度低。

方法改进针对上述问题，我们可以从以下方面进行改进：酶解反应酶解反应是影响染色效果重要因素之一，我们可以通过以下措施来优化酶解反应：1.时间控制酶解反应的时间应该控制在适当范围内，时间过短会导致去除内源性干扰因子不足，时间过长则会影响细胞的结构，从而影响染色效果。