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基因工程小鼠命名规则实验小鼠是目前应用最为广泛的一种实验动物，在探寻基因基础功能，疾病发病机制以及药物临床前筛选等方面有着十分重要的作用。
其原因在于小鼠和人的基因具有极高的相似度（小鼠99%的基因能在人类基因组中找到同源基因），同猴子、猪等实验动物相比，由于小鼠体型小，饲养管理方便，易于控制，生长繁殖快，因此拥有了大量的封闭群和近交系，成为目前用量最大，用途最广，品种最多，研究最清楚的实验动物。
目前，实验小鼠有许多不同的品系，在发表各种peper中所用的小鼠也不尽相同，各位伙伴是不是经常会疑惑自己的实验到底应该用哪种小鼠？本文接下来将重点介绍国内用量较大的几种小鼠品系，以供参考。
封闭群：非近交交配方式进行交配生产的一个实验动物种群，在不从其外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代以上，称为一个封闭群；杂合率高，群体基因频率基本稳定，个体存在差异性。
①KM小鼠（昆明小鼠）1926年美国Rockfeller研究所培育，我国最开始引进到昆明，故称"昆明小鼠"，一直是我国生产量、使用量最大的封闭群小鼠。
特点∶昆明小鼠面部剑突，触须较长，畏强光，体型较小。
肿瘤自发率较高。
根据KM小鼠的各种自发性肿瘤等特征，在肿瘤学研究试验中，通过诱导剌激，让其生成相应的肿瘤模型，主要作为研究人类肿瘤生长发育、转移和治疗参考应用。
由于其繁殖力强，生长速度快等特点，为人类研究多代遗传性疾病提供了快捷便利的研究条件，例如人类白化病、系统性红斑狼疮和尿崩症等人类遗传性疾病研究。
②ICR小鼠是国际通用的封闭群小鼠。
Hauschka用Swiss小鼠群选育而来，后美国癌症研究所（Institute of Cancer Researcch）分送各国饲养实验，各国称为ICR。
特点：适应性强，体格健壮，繁殖力强，生长速度快，实验重复性较好，是进行免疫药物筛选，复制病理模型较常用的实验动物。
其外周血液和骨髓细胞，具有较好的稳定性，是良好的血液学实验用动物。
遗传改造与基因工程的应用遗传改造和基因工程是现代生物科学领域中广泛应用的重要技术，它们对于人类和其他生物的生命、健康和环境都具有重要意义。
本文将探讨遗传改造和基因工程的定义、背景、应用以及其对社会和环境的影响。
一、遗传改造和基因工程的定义遗传改造是通过改变生物体的遗传物质来改变其性状的过程。
基因工程是利用分子生物学和遗传学的方法，将外源基因引入目标生物体，使其获取新的性状或功能。
这两个术语常常被混淆使用，但在本文中，遗传改造指的是任何通过遗传方法改变生物性状的技术，而基因工程则是特指利用分子生物学技术进行基因操作的技术。
二、遗传改造和基因工程的背景遗传改良和基因工程的概念起源于古代农业实践中的选择育种。
人类通过选择具有有益性状的个体进行繁育，以改良作物和动物的品质和产量。
然而，传统方法进展缓慢，并且受到遗传变异的限制。
随着分子生物学和生物技术的快速发展，遗传改造和基因工程技术得到了显著提升，为实现更快、更准确的遗传改良提供了新的手段。
三、遗传改造和基因工程的应用1. 农业领域遗传改造和基因工程技术在农业领域中的应用，可以提高农作物的抗虫、抗病和耐逆性，增加产量和质量，改善营养成分的含量，减少对农药的需求，进而提高粮食安全和农业可持续发展。
例如，通过转基因技术，可以使作物获得自身不具备的抗虫性，降低农药使用量，减少对环境的污染。
2. 生物医学领域基因工程技术在生物医学领域中有着广泛的应用。
通过基因工程技术，科学家们可以生产大量的人类蛋白质药物，如胰岛素、白细胞介素等。
此外，基因工程技术还被用于研发新的基因诊断方法和治疗手段，如基因治疗、基因敲除等，为人类疾病的预防和治疗提供了新的途径。
3. 环境保护遗传改造和基因工程技术对于环境保护也有着一定的应用。
例如，利用转基因技术可以改良微生物，使其具有高效降解污染物的能力，从而减少有机污染物对环境的危害。
此外，基因工程技术还可以用于保护濒危物种，通过将有利的遗传特征导入濒危物种，提高其生存能力。
生物学中的遗传学与生物技术应用遗传学是生物学中研究遗传变异和遗传现象的学科，它与生物技术的发展紧密相连。
生物技术应用了遗传学的原理和方法，推动了生物科学的发展和应用，对人类的生活和健康产生了巨大的影响。
一、遗传学的基本原理遗传学研究的基本单位是基因，基因决定了生物的遗传特性。
遗传学主要研究基因的遗传和变异，以及基因与环境之间的相互作用。
遗传学的核心理论是孟德尔遗传定律，即离子定律、自由组合定律和分离定律。
二、遗传学的应用领域1. 遗传疾病的诊断和治疗遗传学的研究为遗传性疾病的诊断和治疗提供了重要的理论和实践依据。
通过对基因突变的研究，可以准确地诊断某些遗传病，并为病患提供个性化的治疗方案。
2. 农业育种与改良遗传学是现代农业育种的基础。
通过对作物和家禽等品种的遗传变异的研究，可以培育出高产、抗病虫害的新品种。
遗传学还可以通过转基因技术改良农作物，使其具有抗病虫害、耐逆性等重要特征。
3. 动物育种与改良遗传学在动物育种和改良中也起到重要的作用。
通过选育具有良好遗传性状的个体，可以提高动物的产出和品质。
例如，通过选择体型大、生长快、乳汁丰富的个体进行繁殖，可以培育出肉鸡、奶牛等高产优质的家禽畜牧品种。
4. 人类基因组计划人类基因组计划是一个国际性的合作项目，旨在解析人类基因组的结构和功能。
通过人类基因组计划，我们可以更好地了解人类基因的组成与变异，揭示人类疾病的遗传机制，为疾病的预防和治疗提供基础。
5. 无性繁殖植物繁育对于无性繁殖的植物，遗传学可以通过组织培养和离体繁殖等技术手段进行繁育和改良。
例如，通过离体培养和基因工程技术，可以大量繁殖具有优良性状的植株，以满足农业和园艺上的需求。
6. 基因治疗与基因工程遗传学的应用还体现在基因治疗和基因工程领域。
基因治疗可以通过直接介入患者的基因组，修复或替代缺陷基因，治疗某些遗传性疾病。
基因工程技术可以通过改变生物体内的基因组成，创造出具有特定功能的生物体，用于生产药物、发酵和环境修复等领域。
动物繁殖技术综合练习题在我们的日常生活中，动物一直都是人们关注的重要领域之一。
无论是农业生产还是宠物饲养，动物的繁殖都扮演着重要的角色。
以下是一些与动物繁殖技术相关的综合练习题，让我们一起来探讨这个有趣且具有挑战性的话题。
1. 解释什么是人工授精技术？列举三个人工授精的应用领域。
人工授精是通过人工的方式将雄性动物的精液直接注入雌性动物的生殖道中，以达到繁殖的目的。
人工授精技术可以应用于农业生产、动物保护和繁育研究等领域。
在农业生产中，人工授精可以协助提高牲畜的繁殖效率和品质；在动物保护方面，可以帮助保护濒危物种以及遗传多样性；在繁育研究中，可以用于实验动物的繁殖控制和遗传研究等。
2. 请解释遗传工程在动物育种中的作用，并举例说明。
遗传工程在动物育种中扮演着重要的角色，它通过修改或引入特定基因，以改变动物的遗传性状。
例如，通过遗传工程技术，科学家可以在家畜中引入抗病基因，以提高它们的抵抗力和生产力；或者在实验动物中引入特定基因，以模拟人类遗传疾病，用于研究和治疗。
此外，遗传工程还可以通过改变动物的性别比例，实现性别选别和优良品种的传承。
3. 请简要解释胚胎移植技术，并列举一种利用胚胎移植技术的动物繁殖项目。
胚胎移植技术是将受精卵或早期胚胎从一个母体转移到另一个母体中，使其在新的母体体内继续发育。
这项技术可以应用于动物繁殖项目中，例如：在马术运动中，优秀马匹的繁殖、训练和竞技是非常关键的。
通过胚胎移植技术，高价值的种母马可以多次繁殖，提高优良品种的产出；同时，这也能够保持种母马参与比赛和训练，降低因繁殖而受到的影响。
4. 简要解释性别反转技术，并说明其在动物繁殖中的潜在应用。
性别反转技术是指通过干预动物胚胎发育过程，改变其正常的性别发育路径。
这项技术可以应用于动物育种和生态平衡的调控。
例如，在某些鱼类中，雌性鱼具有更高的经济价值，因此科学家可以利用性别反转技术，将雄性鱼转变为雌性鱼，提高其养殖效益；而在某些鸟类中，过多的雄性个体可能会导致种群的不平衡，科学家可以通过性别反转技术，将某些雄性个体转变为雌性个体，以平衡种群性别比例。
收稿日期：2018-07-07基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX08006002-006、2016ZX08006001-005），湖北省农业科技创新中心资助项目（2018-620-004-001）作者简介：华再东(1978-)，男，贵州省盘州市人，博士，从事动物繁殖生物技术研究*通讯作者：郑新民，E-mail：anbit20@转基因动物制备方法华再东任红艳郑新民*(1动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室,湖北武汉430064;2湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,湖北武汉430064)摘要:动物转基因技术是通过将外源性目的基因整合到动物染色体上,使其在体内整合和表达,获得表达外源基因动物的技术。
该技术广泛应用于转基因动物育种、基因功能研究、药用蛋白生产和器官移植等方面。
其主要方法包括逆转录病毒感染法、显微注射法、体细胞核移植法、胚胎干细胞介导法、精子介导法等。
本文旨在对动物转基因的各种技术和方法进行综述,甄别各自的优缺点,为科研工作者提供一定的参考。
关键词:转基因;动物;技术中图分类号:S813.3文献标识码:A文章编号:1673-4645(2018)11-0022-04转基因技术是分子生物学技术的拓展，是现代探索生命科学奥秘的有效工具，是推动人类社会进步的伟大技术。
就目前形势来看，转基因技术已经渗透到我们生活的各个方面，如疾病治疗、疫苗生产、制药、环境卫生、农作物、食品加工等多个领域，具有很好的经济价值和社会意义。
就制备历程来看，动物转基因技术发展主要经历了采用显微注射法及病毒载体法制备转基因动物和基于体细胞克隆为核心技术制备转基因家畜。
关于动物的转基因方法，最早是利用胚胎感染反转录病毒进行基因的转移，获得了世界首例转基因动物。
之后通过显微操作将外源基因注射到小鼠胚胎，获得了转基因小鼠。
1982The Transgenic Preparation Methods of AnimalHUA ZaidongREN Hongyan ZHENG Xinmin（1Hubei Key Laboratory of Animal Em-bryo Engineering and Molecular Breeding,Wuhan 430064,China;2Institute of Animal Husbandryand Veterinary Research,Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430064,China)Abstract:Animal transgenic technology is the technology to obtain transgenic animal which expresses exogenous genes through inte-grating exogenous genes into chromosome genome of animals.The technology has been widely applied in the transgenic animals breeding,gene function analysis,pharmaceutical protein production,organ transplantation,and so on.Animal transgenic technologies include retrovirus infection,microinjection,somatic cell nuclear transfer,sperm vector,et al.This review aimed to introduce these tech-nologies and compare their advantages and disadvantages.These technologies are the references for scientific researchers.Key words:transgenic;animal;technology图1显微注射制备转基因小鼠示意图年，Palmiter 等[1]将含有大鼠生长激素的结构基因与小鼠的金属硫-Ⅰ基因启动子相连，再利用显微注射技术将融合后的DNA 片段注射到小鼠卵的原核中，最后成功制备了著名的“超级小鼠”，加速了动物生长方式的研究，为人类研究遗传疾病和巨人症建立了动物模型。
Cre小鼠随着基因工程技术的发展以及基因编辑技术的成熟，越来越多的科研人员使用基因编辑的小鼠模型来研究基因表达、遗传疾病以及临床实验前的药效测试等。
然而，在一些研究中，科研人员只需要对某一时期针对某一特定基因进行研究，它需要满足可以在特定组织或特定生命周期中目的基因表达的条件，而这种条件性小鼠模型叫做Cre 工具鼠。
Cre 鼠的构建最有效的方法之一是通过 Cre-Loxp 重组酶系统实现的，特定的Cre 工具鼠可以在某组织特异性基因启动子调控下表达组织特异性 Cre 重组酶。
Cre-loxp 重组系统Cre-loxp 重组酶系统，由 Cre 重组酶和 loxp 位点两部分组成。
具体实现方式是通过对一段特定的DNA 序列进行定位并且利用Cre 重组酶对其剪接，运用该系统可针对特定细胞或组织进行「基因改造」。
Cre-loxp 重组酶系统的作用方式Cre 重组酶识别 loxP 位点两端的反向重复序列并结合形成二聚体，然后此二聚体与另一个loxP 位点上的二聚体结合形成一个四聚体。
LoxP 位点是有方向性的，四聚体连接的两个位点在方向上是平行的。
然后两个loxP 位点间的DNA 序列被Cre 重组酶切断。
接着，DNA 连接酶快速高效地将这些链连接起来。
重组的结果取决于 loxP 位点的位置和方向。
Cre 工具鼠的构建目前有四种常见Cre 鼠的构建策略，每种方法各有其优点和不足，选择哪种方法根据科研目的和实际情况而定，下面为大家简单介绍下这几种模型。
质粒表达载体Cre 鼠模型：通过受精卵原核注射的方法，获得Cre 随机插入基因组的转基因小鼠。
定点敲入 Cre 鼠模型：利用 CRISPR/Cas 技术将 Cre 基因定点敲入相关内源基因位点，依靠内源性基因调控序列确定 Cre 表达特征。
BAC 转基因 Cre 鼠模型：将 Cre 基因先敲入至 BAC 克隆的特定基因调控元件序列后，构建BAC 克隆载体，并将此BAC 载体进行受精卵原核注射法，构建 BAC 转基因 Cre 小鼠模型。
Hereditas (Beijing) 2021年4月, 43(4): 375―384 收稿日期: 2021-01-05; 修回日期: 2021-03-04基金项目:科技部重点研发计划项目(编号：2018YFA0801100)资助[Supported by the National Key R&D Program of the Ministry of Science andTechnology of China (No. 2018YFA0801100)]作者简介: 朱文静，硕士，实验技术员，研究方向：生物化学与分子生物学。
E-mail:*********************通讯作者:刘志玮，博士，研究方向：生物化学与分子生物学。
E-mail:********************DOI: 10.16288/j.yczz.21-005 网络出版时间: 2021/3/16 11:31:37URI: https:///kcms/detail/11.1913.R.20210315.0958.005.html资源与平台MDMPR ：小鼠发育代谢表型库朱文静，刘志玮苏州大学，剑桥–苏大基因组资源中心，苏州 215123摘要: 小鼠发育代谢表型库(Mouse Developmental and Metabolic Phenotype Repository, MDMPR)是一个致力于小鼠资源和表型数据实时共享的开放性平台，它依托于科技部重点研发计划“发育编程及其代谢调节”专项项目“建立小鼠发育代谢表型库”。
该项目预计在5年内完成500个发育代谢相关小鼠敲除模型的建立，并对其表型数据进行标准化的解析、建立表型数据库。
MDMPR 作为一个资源及数据集成的库，由多个子系统作为支撑，包括ES 细胞数据库、项目管理系统、繁育管理系统、精子库管理系统、表型分析系统，信息化管理深入到项目中每个环节，从基因突变ES 细胞制备、基因突变小鼠制备、小鼠繁育，精子冻存到最终的表型分析、数据处理及展示，保证了MDMPR 产生数据的真实性及实时性。
2020年12月第30卷㊀第12期中国比较医学杂志CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINEDecember,2020Vol.30㊀No.12光姣娜,左琴,魏杰,等.应用微卫星技术比较两个实验小鼠群体遗传结构的差异[J].中国比较医学杂志,2020,30(12):42-49.Guang JN,Zuo Q,Wei J,et al.Genetic structure differences in different laboratory mouse populations analyzed by microsatellites [J].Chin J Comp Med,2020,30(12):42-49.doi:10.3969/j.issn.1671-7856.2020.12.007[基金项目]国家科技重大专项(2017ZX10304402-002-006)㊂[作者简介]光姣娜(1995 ),女,硕士研究生㊂研究方向:分子遗传学㊂E-mail:guangjn2018@ [通信作者]王洪(1977 ),女,研究员,研究方向:实验动物遗传质量控制㊂E-mail:littstar@岳秉飞(1960 ),男,研究员,博士㊂研究方向:动物遗传学㊂E-mail:y6784@ ㊀∗共同通信作者应用微卫星技术比较两个实验小鼠群体遗传结构的差异光姣娜,左㊀琴,魏㊀杰,周佳琪,王㊀洪∗,岳秉飞∗(中国食品药品检定研究院,北京㊀102629)㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀应用微卫星标记比较两个实验小鼠群体的遗传结构组成㊂方法㊀应用36个微卫星标记分析两个实验小鼠群体的遗传结构组成㊂从两个群体中各提取38份基因组DNA,进行PCR 扩增和基因测序,应用统计分析软件PopGen1.32和Littleprogram0.6计算两个群体的遗传结构参数㊂结果㊀A 群的平均等位基因数为2.4839,平均杂合度为0.3376,平均多态性信息含量为0.2875㊂B 群的平均等位基因数为3.4839,平均杂合度为0.4806,平均多态性信息含量为0.4088㊂结论㊀两个实验小鼠群体的遗传结构组成存在差异,长期封闭繁育导致群体遗传结构发生改变㊂建议对封闭群实验动物种群进行定期的遗传结构监测,确保实验动物的遗传质量㊂ʌ关键词ɔ㊀实验小鼠;遗传结构监测;微卫星标记;ddYʌ中图分类号ɔR-33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1671-7856(2020)12-0042-08Genetic structure differences in different laboratory mouse populationsanalyzed by microsatellitesGUANG Jiaona,ZUO Qin,WEI Jie,ZHOU Jiaqi,WANG Hong ∗,YUE Bingfei ∗(National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 102629,China)㊀㊀ʌAbstract ɔ㊀Objective ㊀The genetic structure composition of the ddY mouse population,which was bred inisolation for a long time,was compared with that of the newly introduced ddY mouse population by microsatellite analysis.Methods ㊀Thirty-six microsatellite loci were analyzed.Thirty-eight DNA samples were randomly collected from each of the two groups.The DNA samples were then amplified by PCR and the PCR products were sequenced.PopGen1.32andLittleprogram0.6were used to process the data.Results ㊀The average allele number of group A was 2.4839,the average heterozygosity was 0.3376,and the average polymorphism information content was 0.2875.Group B had an average allele number of 3.4839,average heterozygosity of 0.4806,and an average polymorphism information content of 0.4088.Conclusions ㊀The genetic structure of the two laboratory mouse populations was different,and closed breeding result ed in genetic structure changes in the populations.It is necessary to monitor the genetic structure of closed laboratory animalpopulations regularly to ensure the genetic quality of populations.ʌKeywords ɔ㊀laboratory mice;genetic structure monitoring;microsatellites;ddY㊀㊀ddY 小鼠是一种可自发出现多种疾病,具有较高建模成功率的实验小鼠,多种疾病包括肺癌,恶性淋巴瘤,卵巢癌,乳腺癌,以及自发性肾小球肾炎等[1-3]㊂其中,ddY 小鼠自发性肾病的症状以及基因位点与肾小球肾炎患者的临床状况十分相似[3]㊂由于具备其他品系实验小鼠没有的独特优势,ddY 小鼠已经成为应用前景良好的实验小鼠㊂实验动物封闭群是指在不从外部引入新个体的条件下,至少连续繁殖4代以上的实验动物种群[4]㊂封闭群实验动物的繁育特点有可能导致实验小鼠群体发生遗传漂变,突变或选择,进一步引起群体遗传结构的改变㊂遗传结构组成的变化会直接影响实验动物的表现型,直接决定实验结果的准确性㊁科学性和可比性㊂因此,定期对长期封闭繁育的封闭群实验动物群体进行遗传质量监测是非常必要的㊂微卫星标记和SNP 标记是广泛应用于大鼠㊁小鼠㊁兔㊁猫㊁小型猪等多种实验动物的遗传质量检测方法[5-7]㊂相较于SNP 技术,微卫星检测技术具有更丰富多态性,并且具有较好的保守性,其可以检测同一群体不同个体之间的遗传差异,以定量的方式精确展现实验动物的遗传状况[8]㊂与SNP 相比,采用较少的微卫星位点即可实现对封闭群小鼠的遗传质量检测㊂本研究旨在应用微卫星技术监测两个ddY 实验小鼠群体的遗传结构,分析长期封闭繁育对实验动物群体遗传结构的影响,探讨对封闭群实验动物群体进行定期遗传结构监测的必要性㊂1㊀材料和方法1.1㊀实验动物A 群:本单位2013年从日本脏器制药有限责任公司引进的ddY 小鼠,已在本单位屏障系统繁育6年㊂B 群:本单位2019年从日本脏器制药有限责任公司引进的ddY 小鼠㊂从两个群体中各自随机选取38只,雌雄各半,SPF 级,28~30g,8周龄ddY 小鼠的鼠尾1~2cm㊂ddY 小鼠均于本单位屏障系统中繁育[SCXK (京)2017-0005]㊂小鼠取材操作于中国食品药品检定研究院动物实验设施内进行[SYXK(京)2017-0013]㊂所有实验操作均符合 3R 原则,经中国食品药品检定研究院动物福利伦理审查委员会审批(中检动(福)第2019(A)001号)㊂1.2㊀主要试剂与仪器100bp DNA marker(批号:A2601A)和PCR 反应试剂盒(批号:R007A)均购自TaKaRa 公司;50 TAE Buffer(批号:F521KA1898)购自生工生物工程股份有限公司㊂PCR 仪:Veriti 96well Thermal cycler(美国ABI 公司);电泳仪:Power Pac Basic (美国Bio-Rad 公司);凝胶成像分析仪:GL 212Pro(美国Kodak 公司)㊂1.3㊀实验方法1.3.1㊀DNA 提取酚氯仿抽提法提取基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计检测其完整性,纯度和浓度㊂所有DNA 样本的A260/280均为1.7~1.9,样品纯度合格;DNA 样本稀释到50ng /μL 作为DNA 工作液,-20ħ保存备用㊂1.3.2㊀引物的选择本实验采用的36个微卫星位点均来自本实验室前期研究成果[9],文献中未注明的6个微卫星位点引物序列信息详见表1㊂由北京擎科新业生物技术有限公司标记正向引物的5 端并合成引物㊂表1㊀6个微卫星位点引物序列信息Table 1㊀Primer sequence of six microsatellites loci位点Locus 引物序列(5 ң3 )Primer sequence染色体位置Chromosome荧光标记FluorescenceD1Mit7F:TGGTAGAGGAAGGTGCACGR:CAGGGGAGTAGTACCACCA1FAM /D2Nds3F:CCAAGCTTCCTTGTGCAAGTAR:AAGCCCAAAGTCCATCAGTGG 2TAMRA /D3Mit21F:AAGCTCTACAGCGGAAGCAC R:CTGGGGAGTTTCAGGTTCCT 3TAMRA /D9Mit24F:CCTTCTAAACACAGGCTTTTTGAG R:CTGATGATCACCTCATTTCCTGAG9HEX /D14Mit5F:CACATGAACAGAGGGGCAG R:GTCATGAAGTGCCCACCTTT 14HEX /D17Mit23F:TCGAGCTGGTTGAACGAAC R:CGGGAAAGCATGGAATTTAA17FAM/1.3.3㊀PCR扩增与优化20μL PCR反应体系:H2O13.8μL,10ˑBuffer 2μL,dNTP Mixture1μL,上下游引物各1μL,样品DNA1μL,Taq酶0.2μL㊂PCR扩增程序:94ħ,5 min;94ħ,30s,退火温度,30s,72ħ,30s,35个循环;72ħ,7min㊂其中不同引物的退火温度(annealing temperature,Tm)不同㊂扩增产物5μL 与6ˑloading Buffer1μL混匀上样,用2.5%琼脂糖凝胶以200V,30min进行电泳,紫外凝胶成像仪拍照记录㊂1.3.4㊀测序PCR扩增结果由北京擎科新业生物技术有限公司进行STR测序㊂1.4㊀统计学方法根据STR测序结果,将数据转换为AA,BB,AB 样格式,应用PopGen1.32软件分析两个群体的等位基因数㊁有效等位基因数㊁期望杂合度㊁观测杂合度㊁平均杂合度以及香隆指数㊂通过等位基因数和各个等位基因频率在统计软件Littleprogram0.6中计算多态性信息含量㊂用统计分析软件SPSS21作独立样本t检验比较两个群体之间遗传结构参数的差异,结果用平均数ʃ标准差( xʃs)表示㊂2㊀结果2.1㊀两个群体遗传结构信息中单态性的微卫星位点选取的36个微卫星位点均匀分布于小鼠所有染色体㊂其中有5个位点在A群和B群均为单态性位点,另5个位点在A群中为单态性位点而在B 群中为多态,具体位点名称详见表2㊂两个群体中均为单态的微卫星位点,多态性欠佳,在后续遗传结构的分析中不予采纳㊂表2㊀36个微卫星位点名称和相关信息Table2㊀36㊀microsatellite loci and their related information序号No.位点Locus退火温度(ħ)Temp等位基因范围Allele range荧光标记Fluorescence 1D1Mit36554100HEX 2D2Mit1554150~200FAM 3D3Mit2964150FAM 4D4Mit235һ55100FAM 5D5Mit48һ57200HEX 6D6Mit10254150~200FAM 7D7Mit28160100~150FAM 8D8Mit3360200HEX 9D9Mit2365200HEX 10D10Mit1254200~250HEX 11D11Mit459250~300TAMRA 12D12Mit7һ60100FAM 13D13Mit357200HEX 14D14Mit566200HEX 15D15Mit5һ54100FAM 16D16Mit955100~150HEX 17D17Mit1154150~200FAM 18D18Mit1955100~150HEX 19D19Mit1654100~150FAM 20DXMit1658100HEX 21D1Mit760100FAM 22D2Nds3һһ62250TAMRA 23D3Mit21һ60200~250TAMRA 24D6Mit862200TAMRA 25D6Mit15һһ60200~250TAMRA 26D7Mit12һһ58200TAMRA 27D8Mit1463150FAM 28D9Mit2159200TAMRA 29D9Mit2460150HEX 30D12Nds1154200TAMRA 31D14Mit354200~250TAMRA 32D15Mit1560150TAMRA 33D17Mit23һһ54150FAM 34D17Nds358100~150HEX 35D18Mit9һһ60150~200TAMRA 36D19Mit360200TAMRA 注:һһ:该位点在A群和B群均为单态;һ:该位点在A群中为单态而在B群为多态㊂Note.һһ,The site is monomorphic in groups A and B.һ,This site is monomorphic in group A,while polymorphic in group B.2.2㊀PCR 反应条件退火温度的优化以初选退火温度(annealing temperature,Tm)对样本进行PCR 扩增,30个位点得到特异性扩增,6个位点出现非特异扩增条带㊂后续优化这6个位点的退火温度:D5Mit48(52ħң57ħ),D11Mit4(52ħң59ħ),D13Mit3(52ħң57ħ),D6Mit8(52ħң62ħ),D15Mit15(52ħң60ħ),D19Mit3(52ħң57ħ),使之均扩增出理想条带㊂以D6Mit8为例,Tm 值为60ħ时凝胶图谱有非特异性扩增条带(图1)㊂将Tm 值分别做60ħ,61ħ,62ħ梯度,结果发现产物特异性逐渐变好㊂图2是优化后A 群38个样本在D6Mit8位点上的凝胶图㊂注:1~38:A 群体ddY 小鼠DNA 样本号;M:100bp DNA Marker,分子量从大至小依次为500㊁400㊁300㊁200㊁100bp㊂图2㊀退火温度为62ħ时A 群体38个样本在D6Mit8微卫星位点上的凝胶图谱Note.1~38,Numbers of ddY mice genomic DNA in group A.M,100bp DNA marker (500,400,300,200,and 100bp).Figure 2㊀Gel map of 38samples from group A at site D6Mit8at the annealing temperature of 62ħ2.3㊀STR 测序结果STR 测序通过检测DNA 的具体长度,精确区分相差1bp 的DNA 片段并以不同峰型显示结果[10]㊂图3为A 群1号样本扩增产物在D4Mit235和D7Mit281位点上的STR 测序结果㊂其中D4Mit235注:4:A 群体中4号样品在Tm 分别为60ħ,61ħ,62ħ时的凝胶图;14:A 群体中14号样品在Tm 分别为60ħ,61ħ,62ħ时的凝胶图;M:100bp DNA Marker㊂图1㊀不同退火温度条件下的D6Mit8微卫星位点PCR 结果电泳图Note.4,Results of No.4in group A when Tm was 60ħ,61ħand62ħ,respectively.14,Results of No.14in group A when Tm was 60ħ,61ħand 62ħ,respectively.M,100bp DNA Marker.Figure 1㊀Electrophoresis of PCR products at site D6Mit8atdifferent annealing temperatures位点上为单峰,属于纯合(图3A);而D7Mit281位点上则为双峰,属于杂合(图3B)㊂2.4㊀两个实验小鼠群体的遗传结构信息遗传结构参数可定量的体现实验动物群体的遗传结构组成㊂去除2.1表2中两个群体均为单态的5个位点后,利用31个微卫星位点分析两个群体的遗传结构参数㊂表3和表4分别是A 群和B 群的遗传结构参数分析结果㊂统计分析结果如表5所示,除有效等位基因数外,两组在其余遗传参数均有显著差异㊂3㊀讨论本实验应用31个多态性良好的微卫星位点进行扩增和测序后分析发现,ddY 小鼠两个群体的观测杂合度㊁期望杂合度㊁平均杂合度㊁等位基因数㊁多态性信息含量㊁香隆指数均有显著差异㊂平均杂合度是反映群体遗传多样性的重要遗传指标,若封闭群杂合度为0.5~0.7,则说明封闭群遗传质量良好[11]㊂A 群和B 群平均杂合度分别是0.338和0.481㊂统计结果显示两组在杂合度方面有显著差异(P <0.01),表明两个群体遗传杂合度均较低,但相较于A 群,B 群ddY 小鼠遗传多样性更丰富㊂等位基因数是指同一微卫星位点上不同等位基因的数量[12],等位基因与有效等位基因数越接近,则该群体内的等位基因分布越均匀,遗传一致性越高[12]㊂A 群平均等位基因数和平均有效等位基因数分别是2.484和1.743;B 群平均等位基因数和平均有效等位基因数为3.484和2.130㊂这种等位基因数和有效等位基因数出现偏差的现象在吴盈萍等[12]㊁万倩倩等[13]关于伊犁鹅的研究中也有出现,可能由封闭群动物的定向选育,群体规模缩小,遗传多样性降低导致㊂多态性信息含量(polymorphism information content,PIC)主要用于评估微卫星位点用于研究群体多态性的价值,是与等位基因数目和等位基因频率相关的直观表现遗传多态性的遗传参数[14],PIC >0.5表示高度多态,0.25<PIC<0.5表示中度多态,PIC<0.25表示低度多态[15]㊂A 群PIC 的平均数为0.287,B 群为0.4088㊂虽然两个封闭实验动物群体都处于中度多态,但多态性信息含量有显著差异(P <0.01)㊂由此可见,ddY 小鼠在繁育过程中未能完全实现随机交配,以致近交程度升高㊂微卫星标记,又称短串联重复序列,由2~6bp 重复碱基核心序列和侧翼序列组成,微卫星序列的重复碱基通常有数个到数十个拷贝,具有多态性丰富㊁保守性好㊁易操作和实用性强[16]等优点,是国际实验动物学会(ICLAS)[17]和实验动物国家标准GB 14923-2010推荐研究群体遗传结构组成和遗传多样性的重要工具[9,18]㊂近年来,美国杰克逊实验室和Charles River 实验室均采用微卫星方法对实验动物质量进行监测,国内也有很多研究者筛选出不同组微卫星位点监测不同品系小鼠,大鼠,兔,小型猪等实验动物以及伊犁鹅,坡鹿等畜牧动物的遗传质量[19-21]㊂为使一组微卫星位点尽可能完整体现特定实验动物群体的遗传多样性,我们需对微卫星位点进行筛选和优化㊂参考王洪等[9]和Barker (1994)提出的建议,初步筛选均匀分布于小鼠所有染色体的微卫星位点㊂多个群体内均为单态的微卫星位点不能体现群体的遗传多样性,可提供的遗传信息含量很少,属于群体间保守位点,常用于鉴别不同近交系实验动物[22-24]㊂本实验旨在分析ddY 小鼠A 群体和B 群体的遗传结构组成及遗传多样性是否有明显差异㊂因此,在后续的遗传结构分析中,剔除两个群体均为单态的5个微卫星位点,保证实验数据的可靠性㊂实验中的STR 测序是通过毛细管电泳检测DNA 片段通过激光扫描窗口的实际时间而计算出DNA 片段长度[25]㊂非特异性扩增条带会影响STR 测序结果甚至导致STR 测序结果出现错误㊂在进行STR 测序之前,确保PCR 扩增出特异性良好的条带对实验结果准确性至关重要,而退火温度是PCR 扩增结果最主要的影响因子㊂本实验通过优化退火条件使PCR 扩增出理想条带,为STR 测序实验结果准确性提供了先决条件㊂注:A:D4Mit235位点;B:D7Mit281位点;横坐标为DNA 片段长度;纵坐标为波峰高度㊂图3㊀D4Mit235和D7Mit281位点的STR 测序图谱Note.A,Locus D4Mit235,B,Locus D7Mit281,X-axis is DNA length,Y-axis is peak height.Figure 3㊀STR sequencing results of locus D4Mit235and D7Mit281序号No.位点Locus因数Na 基因数Ne 观测杂合度Obs_Het 期望杂合度Exp_Het 平均杂合度Ave_Het 香隆指数I 含量PIC 伯格平衡HWE 1D1Mit3652 1.8710.4740.4720.4650.6580.357P >0.052D2Mit153 1.5810.290.3720.3670.5980.309P >0.053D3Mit294 2.0970.4210.530.5230.9980.484P <0.014D4Mit2351100000单态性Monomor phism 5D5Mit481100000单态性Monomor phism6D6Mit1022 1.2320.2110.1910.1880.3370.171P >0.057D7Mit2812 1.7610.5260.4380.4320.6240.339P >0.058D8Mit335 3.8770.50.7520.742 1.410.696P <0.019D9Mit233 1.9290.4740.4880.4820.8410.433P >0.0510D10Mit122 1.8940.50.4780.4720.6650.361P >0.0511D11Mit44 1.5580.1580.3630.3580.6310.311P <0.0112D12Mit71100000单态性Monomor phism13D13Mit33 1.1750.1580.1510.1490.3310.143P >0.0514D14Mit52 1.8450.3420.4640.4580.6510.353P >0.0515D15Mit51100000单态性Monomor phism16D16Mit92 1.2320.2110.1910.1880.3370.171P >0.0517D17Mit112 1.0270.0260.0260.0260.070.026P >0.0518D18Mit192 1.8190.4740.4560.450.6420.349P >0.0519D19Mit163 2.3890.7370.5890.5810.9760.514P >0.0520DXMit164 2.270.3420.5670.56 1.0080.503P <0.0121D1Mit72 1.8450.3950.4640.4580.6510.353P >0.0522D3Mit211100000单态性Monomor phism 23D6Mit82 1.9950.3160.5050.4990.6920.3740.01<P <0.0524D8Mit143 1.9040.50.4810.4750.7150.374P >0.0525D9Mit213 1.6510.4210.40.3940.6290.326P >0.0526D9Mit242 1.3620.2110.270.2660.4360.231P >0.0527D12Nds113 1.66700.4060.40.6620.339P <0.0128D14Mit32 1.6670.2370.4050.40.5890.32P <0.0129D15Mit152 1.170.1580.1470.1450.2760.135P >0.0530D17Nds36 4.9710.9740.810.799 1.6750.769P <0.0131D19Mit32 1.2320.1580.1910.1880.3370.171P >0.05均值Mean / 2.484 1.7430.2970.3420.3380.5620.287/标准差St.Dev/ 1.180.8350.2360.2260.2230.4010.198/㊀㊀本研究中ddY 实验小鼠两个群体的遗传结构参数存在显著差异㊂研究结果表明,经过长期封闭繁育,实验小鼠A 群体的遗传结构已经发生改变㊂本单位2019年引进的ddY 实验小鼠B 群的群体遗传多样性更丰富,更符合封闭群实验动物群体的遗传结构特征㊂因此,长期封闭繁育的实验动物群体应定期进行遗传质量监测,保证群体遗传结构的稳定性,从而确保动物实验结果的准确性㊁重复性和科学性㊂序号No.位点Locus因数Na 基因数Ne 观测杂合度Obs_Het 期望杂合度Exp_Het 平均杂合度Ave_Het 香隆指数I 含量PIC 伯格平衡HWE 1D1Mit3653 2.0100.7110.5090.5020.7430.389P >0.052D2Mit153 1.2360.2110.1930.1910.3760.177P >0.053D3Mit295 1.9450.2900.4920.486 1.0010.458P <0.014D4Mit2352 1.3960.2900.2870.2840.4580.243P >0.055D5Mit484 2.4130.5260.5930.586 1.0710.5300.01<P <0.056D6Mit1025 1.3520.2110.2640.2600.5760.249P >0.057D7Mit2812 1.9780.4740.5010.4950.6880.372P >0.058D8Mit334 2.7190.6840.6410.632 1.0840.559P >0.059D9Mit235 2.4070.6840.5920.585 1.0290.497P <0.0110D10Mit122 1.9950.4210.5050.4990.6920.374P >0.0511D11Mit44 2.0310.4740.5140.5080.8480.423P >0.0512D12Mit72 1.0820.0790.0770.0760.1660.073P >0.0513D13Mit35 2.7140.4210.6400.632 1.1690.569P >0.0514D14Mit52 2.0000.9470.5070.5000.6930.375P <0.0115D15Mit54 1.9320.6050.4890.4820.9410.451P >0.0516D16Mit92 1.2640.1320.2120.2090.3640.1870.01<P <0.0517D17Mit112 1.4980.4210.3370.3320.5150.277P >0.0518D18Mit193 2.3070.7900.5740.5670.9110.472P <0.0119D19Mit163 2.6040.5530.6240.616 1.0260.546P >0.0520DXMit167 3.4060.5530.7160.706 1.4210.657P <0.0121D1Mit72 1.9780.5790.5010.4950.6880.372P >0.0522D3Mit212 1.9950.5260.5050.4990.6920.374P >0.0523D6Mit83 2.0350.8950.5150.5090.7500.392P <0.0124D8Mit142 1.9660.5530.4980.4910.6850.371P >0.0525D9Mit215 2.1550.6580.5430.5360.9840.473P <0.0126D9Mit243 1.3440.2370.2590.2560.4980.237P >0.0527D12Nds114 2.7900.6580.6500.642 1.1050.573P >0.0528D14Mit32 1.9990.6050.5060.5000.6930.375P >0.0529D15Mit155 2.4580.6580.6010.593 1.0340.508P >0.0530D17Nds39 5.2890.8160.8220.811 1.8190.785P >0.0531D19Mit321.7300.3950.4280.4220.6130.333P >0.05均值Mean / 3.484 2.1300.5180.4870.4810.8170.409/标准差St.Dev/ 1.6910.7850.2180.1640.1620.3320.150/表5㊀两个实验小鼠群体遗传结构参数的比较Table 5㊀Comparison of genetic structure parameters of group A and group B遗传结构参数Parameter群体GroupsAB等位基因数Na 2.48ʃ1.18a 3.48ʃ1.69a有效等位基因数Ne 1.74ʃ0.83 2.13ʃ0.78观测杂合度Obs_Het 0.30ʃ0.24a 0.52ʃ0.22a 期望杂合度Exp_Het 0.34ʃ0.23a 0.49ʃ0.16a 平均杂合度Ave_Het0.34ʃ0.22a 0.48ʃ0.16a 香隆指数I 0.56ʃ0.4a 0.82ʃ0.33a 多态信息含量PIC0.29ʃ0.2a0.41ʃ0.15a注:a:该项遗传结构参数在两个群体之间有显著差异,即P <0.01㊂Note.a,There is a significant difference in the genetic structure parameter between the two groups (P <0.01).参考文献:[1]㊀Chino F,Sato F,Sasaki S.Retrovirus particles in spontaneouslyoccurring and radiation-induced tumors in ddY mice[J].ActaPatholog Japon,1981,31(2):233-247.[2]㊀Suzuki H,Suzuki Y.Murine models of human IgA nephropathy[J].Seminars in Nephrol,2018,38(5):513-520. [3]㊀Suzuki H,Suzuki Y,Yamanaka T,et al.Genome-wide scan in anovel IgA nephropathy model identifies a susceptibility locus onmurine chromosome10,in a region syntenic to human IGAN1onchromosome6q22-23[J].J Am Soc Nephrol,2005,16(5):1289-1299.[4]㊀蔡磊,李建军,余露军,等.鱼类实验动物封闭群和近交系资源培育现状[J].中国实验动物学报,2020,28(1):108-114.[5]㊀Chang WH,Chu HP,Jiang YN,et al.Genetic variation andphylogenetics of Lanyu and exotic pig breeds in Taiwan analyzedby nineteen microsatellite markers[J].J Anim Sci,2009,87(1):1-8.[6]㊀Islam MR,Zhang Y,Li ZZ,et al.Genetic diversity,populationstructure,and historical gene flow of Nelumbo lutea in USA usingmicrosatellite markers[J].Aquatic Botany,2020,160(10):31-62.[7]㊀Charoensook R,Gatphayak K,Brenig B,et al.Genetic diversityanalysis of Thai indigenous pig population using microsatellitemarkers[J].Asian-Australas J Anim,2019,32(10):1491-1500.[8]㊀陈丙波,张聪,王根,等.DNA分子标记在实验动物遗传分析中的应用[J].中国比较医学杂志,2008,18(10):70-74.[9]㊀王洪,魏杰,冯育芳,等.实验小鼠㊁大鼠微卫星DNA检测法标准的编制[J].中国比较医学杂志,2019,29(9):97-102.[10]㊀王洪,杜小燕,徐平,等.上海KM小鼠种子群体遗传状况分析[J].中国比较医学杂志,2014,24(12):27-32. [11]㊀刘先菊,滕永康,丛日旭,等.雪貂微卫星DNA遗传多样性分析[J].中国比较医学杂志,2018,28(8):43-48.[12]㊀吴盈萍,高凤,彭箫,等.利用微卫星标记分析伊犁鹅的保种效果[J].中国畜牧兽医,2019,46(6):1746-1755. [13]㊀方倩倩,刘雅丽,李祥龙,等.利用微卫星标记技术分析太湖鹅保种效果[J].畜牧与兽医,2016,48(12):19-24. [14]㊀信超.基于COI和微卫星的中国沼泽山雀种群分化和遗传多样性研究[D].西安:陕西师范大学,2015. [15]㊀张烨华,王立民,王聪慧,等.6个绵羊品种微卫星多态性分析[J].石河子大学学报(自然科学版),2015,33(5):558-562.[16]㊀王洪,戴方伟,王静,等.实验动物遗传质量控制微卫星标记检测法重复性研究[J].中国比较医学杂志,2019,29(1):84-89,118.[17]㊀Fahey JR,Katoh H,Malcolm R,et al.The case for geneticmonitoring of mice and rats used in biomedical research[J].Mamm Genome,2013,24(3-4):89-94.[18]㊀贾松华.实验用猫SNP位点和微卫星标记遗传检测方法的建立及初步应用[D].中国食品药品检定研究院,2019. [19]㊀陈振文,欧阳兆和,王承利,等.用微卫星标记技术对国内BALB/c小鼠遗传质量的分析[C].中国实验动物学会第六届学术年会,杭州,2004.[20]㊀李慧明,陈兴永,陈金平,等.一种用于坡鹿亲子鉴定的SSR荧光标记引物和鉴定方法,CN111662989A[P].2020-09-15.[21]㊀孙瑞萍,魏立民,晁哲,等.一种封闭群五指山小型猪遗传质量检测的方法,CN106755417B[P].2020-08-25. [22]㊀黄建芳,李小楷,蒋钦杨,等.广西巴马小型猪近交群体的遗传结构分析[J].中国畜牧兽医,2015,42(2):426-431.[23]㊀李银银,吴绍亮,王洪,等.微卫星DNA分析国内24个近交系小鼠遗传状况[J].中国比较医学杂志,2017,27(8):43-49.[24]㊀孙芳园,王越甲,杨炜峰,等.大小鼠微卫星和SNP遗传检测的研究进展[J].实验动物科学,2014,31(3):60-65. [25]㊀赵丽丽,陆涛峰,张晓萍,等.无特定病原体金定鸭微卫星DNA遗传多样性分析[J].中国实验动物学报,2016,24(3):299-303.收稿日期 2020-04-14。
C56BL/6N与129S6/SvEvTac差异C56BL/6N及129S6/SvEvTac。
他们的区别在于： 129来源的ES培养相对容易，有较强的GLT潜力，即容易得到可遗传的F1代flox杂合子。
但是，129品系的亚系非常多，遗传背景差异大，因此表型差异也比较大，有研究证明129品系不适合做神经学、免疫学等方面的研究。
因此，用129背景做出来的敲除模型一般都需要回交到C57BL/6等清晰的近交系背景，这需要5-10代，也就是2年左右的时间。
C57BL/6是应用最为广泛的近交系，遗传背景也很清晰，因此，在实验中的反应和表型更一致，得到的结果重复性也会更好。
但是，相对于129品系，C57BL/6来源的ES培养要求更高，而且GLT的能力较弱，比129背景更难得到可遗传的F1代杂合子。
C57BL/6来源的敲除模型直接与C57BL/6回交就是纯的近交系，不需要像129那样回交5-10代，因此，会节省时间。
C56BL/6J与B6CBF1差异C56BL/6J及B6CBF1。
他们的区别在于：B6CBF1是杂合背景，有杂交优势，生殖能力比较好；B6是纯背景的近交系，繁育能力要弱一些，对于我们来说B6背景在制作转基因小鼠上技术难度会大一些，所以费用也相对贵一些。
我们认为杂合背景可能对某些基因的表达会有一定影响，而纯背景对基因表达的反应程度比较均一，也就是说不同背景对某些基因的表达的反应程度应该是不一样的，后期出现的表型可能也有区别。
B6背景是目前国际上运用的最广泛的小鼠，遗传背景非常清楚，公共数据库中的小鼠基因组全序列也是用 C57BL/6基因组为模板测出来的，您可以根据您的实验来选择品系背景。
常规敲除（Traditional KO或Conventional KO）常规敲除（Traditional KO或Conventional KO）是通过同源重组技术，将基因组上的目的片段替换成一个Antibiotic SelectionMarker，如PGK-Neomycin等。
