结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测

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谢芝勋谢志勤雷剑明刘加波庞耀珊邓显文谢丽基温娟。，，，，，，，
摘要：目的建立一种鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重ＰＲ快速检测方法。方法根据已发表的结核分枝杆Ｃ
中图分类号：３８文献标识码：Ｒ７Ａ
本方法
ＤｅｅｏｖｌｐｍｅｔｏａｄａｅｓｔｖｅｈｄｏｐｌｘＰＣＲｏｄｔｃｎｆａｒｐｉｎｄｓｎｉｉｅｍｔｏｆｄｕｅｔｅｅｔ
２００８，２（２４１）
ＣｈｉｅｅＪｕｒ１ｏｏｎｅｎｓｎａｆＺｏｏｓｓｏ
中国人兽共患病学报
１１４１
文章编号：０２６４２０）２１４ —０１０ —２９（０８１ — １１４
结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重ＰＲ快速检测＊Ｃ
了检测。结果该方法对牛分枝杆菌能扩增出８８ｐ和６１ｐ的特异性基因片段．３ｂ３ｂ结核分枝杆菌只扩增出８８ｂ３ｐ基因片段
而扩增不出６１ｐ的特异性基因片段，参试的其它牛菌株的Ｄ３ｂ对ＮＡ扩增结果均为阴性。敏感度检测可达到５ｇ的Ｄ０ＰＮＡ含量。临床样品检测结核分枝杆菌阳性有２１份。牛分枝杆菌阳性有１份，它临床样品扩增结果全部为阴性。结论其可作为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。关键词：测；核分枝杆菌；分枝杆菌；二重ＰＲ检结牛Ｃ
２ＳａｉｎｏｎｍｌｅｒｎｒｆＮａｎｎＮａｎｎ，３０１Ｃｉａ．ｔｔｆａｉａｔｉａｙｏｎｉｏｖｅｇ，ｎｉｇ５００。ｈｎ）
ＡＢＴＳＲＡＣＴ；ｒｐｄａｄｓｎｉｉｅｍｅｈｄｏｕｌｘＰｓｄｖｌｐｄｆｒｔｅｄｔｃｉｎｏｙｏａｔｒｕｔｂｒｕｏｉＡａｉｎｅｓｔｔｏｆｄｐｅＣＲｗａｅｅｏｅｏｈｅｅｔｆＭｃｂｃｅｉｍｕｅｃｌｓｓｖｏｃｍｐｅｎｙｏａｔｒｕｂｒｓｉａｒＯｏｌｘａｄＭｃｂｃｅｉｍｏｉｎｄｉｙＣＷ。ｉｉｈｔａｒｆｐｉｒｒｅｉｎｄａｄｓｎｈｓｚｃｏｄｎＯｔｅｎｗｈｃＷＯｐｉｏｒｍｅｓｗｅｅｄｓｇｅｎｙｔｅｉｓ＆ｔａｃｒｉｇｔｈｓｅｉｉｇｎｆＭｏｉａｄｔｅ２Ｓｒｐｃｆｅｅｏｂｒｓｎｈ３ＲＮＡｆＭｙｏａｔｒｕｔｂｒｕｏｉｏｐｅ・ａｄｔｅｅｙａｄｐｅＣＲａｌｉａｉｎｃｏｃｂｃｅｉｍｕｅｃｌｓｓｃｍｌｘｎｈｒｂｕｌｘＰｍｐｉｃｔｆｏａｄｄｔｃｉｎｐａｆｒｔｉｇｏｅＭ．ｏｉａｄＭ．ｕｅｃｌｓｓｃｍｐｅｎｅｔｎｓｍｕｔｎｏｓｙｉＯｍｉｎａａｅｒ — ｎｅｅｔｏｌｔｏｍＯｄａｎｓｂｒｓｎｔｂｒｕｏｉｏｌｘｉｆｃｉｉｌｅｕｌｎＣＷｌａｄｎｓｌｓｃｅｏａｋｔｎｓｄｖｌｐｄｉｓｗａｅｅｏｅ．ＷｉｈｓｍｅｈｄｏｕｌｘＰＣＲ，ｓｅｉｃｇｎｒｇｎｆＭ．ｕｅｃｌｓｓｃｍｐｅｎｌｎｔｆ８８ｂｓｏｔｔｉｔｏｆｄｐｅｈｐｃｆｅｅｆａｍｅｔｔｂｒｕｏｉｏｌｘｉｅｇｈｏ３ｐｉｏａｄｔａｆＭｏｉｉｎｔｆ６１ｂｓｃｕｄｂｍｐｉｉｄｒｓｅｔｖｌ．Ｔｈｎｈｔｂｒｓｎｌｇｈｏ３ｐｏｌｅａｌｅｅｐｃｉｅｙｏｅｆｅＤＮＡｓｅｔａｔｄｆｏ２８ｃｉｉａａｌｓｏｌｘｒｃｅｒｍ３ｌｃｌｍｐｅｆｍｉｎｓｋａｄｒｆｒｎｅｓｒｉｓｓｏｄｐｓｔｅｒｓｌｓｉｎｅｅｅｃｔａｎｈｗｅｏｉｉｅｕｔｎＤＮＡｍｐｉｃｔｎ。ｂｔｏｈｒｂｃｅｉｌｓｒｉｓｆｏＣＷｌｈｗｅｅａｉｅｖａｌｉａｉｆｏｕｔｅａｔｒａｔａｎｒｍＯｍｉｓｏｄｎｇｔｖｋｒｓｌｓｅｕｔ．Ｔｈｅｅｔｎｌｔｏｈｓａｓｙｗａ０Ｐｅｄｔｃｉｉｆｔｉｓａｓ５ｇＤＮＡｘｒｃｅｎ２８ｃｉｉａａｌｓｅａｉｅｏｍｉｅｔａｔｄｉ３ｌｃｌｍｐｅｘｍｎｄ，２ａｌｓｗｅｅｐｓｔｖｎｓ１ｓｍｐｅｒｏｉｅｉｆｒＭ．ｕｅｃｌｓｓｃｍｐｅｎｎｐｃｍｅｏｉｉｅｆｒＭ．ｏｉ．ＩｉｅｉｅｔｈｔｔｉｍｅｈｄｏｓａａｅｕｅｓａｒｐｄｏｔｂｒｕｏｉｏｌｘａｄｏｅｓｅｉｎｐｓｔｏｂｒｓｔｓｖｄｎａｈｓｖｔｔｏｆａｓｙｃｎｂｓｄａａｉｍｅｈｄｏｅｅｔｎｆｒＭ．ｏｉｉｆｃｉｎａｌａｍｐｏｅｓａｍｅｎｏｐｄｍｉｌｇｃｌｉｖｓｉａｉｎｔｏｆｄｔｃｉｏｂｒｓｎｅｔｏｓｗｅｌｓｅｌｙｄａａｓｆｒｅｉｅｏｏｉａｎｅｔｔ．ｏｇｏＫＥＹＷＯＲＤＳ：Ｍｙｏａｔｒｕｔｂｒｕｏｉｃｍｐｅｃｂｃｅｉｍｕｅｃｌｓｓｏｌｘ；ＭｙｏａｔｒｕｂｒｓｕｌｘＰＣＲｃｂｃｅｉｍｏｉ；ｄｐｅ
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菌２ＳｒＮＡ和牛分枝杆菌特殊基因序列，设计并合成了两对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物，３Ｒ建立二重ＰＲ快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法，定其特异性和敏感性，对２８份牛临床样品的ＤＣ测并３ＮＡ分别进行

结核分枝杆菌核酸扩增荧光定量检测标准操作规程

结核分枝杆菌核酸扩增荧光定量检测标准操作规程采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对TB核酸的自动化检测；检测灵敏度为10个TB菌/毫升，反应管在PCR循环结束后无需开盖；采用了dUTP-UNG酶防污染采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对TB核酸的自动化检测；检测灵敏度为10个TB菌/毫升，反应管在PCR循环结束后无需开盖；采用了dUTP-UNG酶防污染系统。

可用于可疑结核病患者经处理的痰液标本结核分支杆菌核酸的定性检测，可用于结核病的辅助诊断。

1、储存条件及有效期本试剂盒贮存于-20℃的条件下有效期为12个月（请于有效期内使用）2、自备试剂 4% NaOH、灭菌生理盐水3、样本采集3.1 以清晨第一口痰为宜。

3.2 先用清水漱口，嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管，密封送检。

4、样本存放 4.1 待测样本在2-8℃保存不应超过24小时。

4.2 -20℃保存不超过三个月；。

4.3 -70℃以下长期保存。

4.4 应避免反复冻融。

5、样本运输采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

6、扩增试剂准备（PCR前准备区） 6.1 从试剂盒中取出TB PCR反应液、Taq 酶及UNG，室温融化并振荡混匀后，2,000rpm离心10sec。

6.2 设所需要的PCR反应管管数为n（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表： 6.21 Roche LightCycler ,Roter-Gene2000/3000仪器，准备相应数量的毛细管试剂TB PCR反应液Taq酶UNG 用量17.8 ul 0.2 ul 0.03 ul 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，2000rpm离心10sec，向设定的n个Roche毛细管(LightCycler)中或普通PCR反应管(Roter-Gene2000/3000)中分别加入18ul，转移至样本处理区。

结核分枝杆菌的检验及鉴别

结核分枝杆菌的检验及鉴别【摘要】分枝杆菌属是一类细长略弯曲的细菌，有分枝生长趋势，可呈丝状或菌丝样生长。

无鞭毛，无芽孢。

本属细菌的主要特点是细胞壁脂质含量高，其主要成分是分枝菌酸。

本菌需氧，营养要求特殊，大多数生长缓慢，个别菌种目前尚不能人工培养。

结核分枝杆菌复合群是人类结核病的主要病原体，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。

【关键词】分枝杆菌；检验1生物学特性1.1形态染色结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，单个、成堆或呈束状排列，大小（0．3～0．6）μm×（1～4）μm，形态如球状、串珠状或丝状，革兰染色不易着色，抗酸染色阳性，一般分枝杆莴采用齐-尼（Ziehl-Neelsen，E-N）抗酸染色后，结核分枝杆菌呈红色，非抗酸菌染色呈蓝色。

1.2培养特性本菌为专性需氧菌。

最适生长温度为37℃，低于30℃不能生长。

pH 6．5～6．8。

营养要求较高，但生长缓慢。

必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基上才能良好生长。

本菌在培养基上缓慢生长，一般2～4周才能生长出菌落。

菌落表面干燥、粗糙、隆起、呈颗粒状、结节状或菜花状、乳A色或淡黄色，不透明。

结核分枝杆菌在5％～l0％的C02条件下对其生长有促进作用。

其对营养要求高，对一些营养成分有特殊的要求。

例如，结核分枝杆菌专嗜甘油为碳源，而牛分枝杆菌则以丙硐酸盐为碳源。

天冬酰胺是结核分枝杆菌生长最好的氮源，钾、镁、铁、磷等无机离子对其生长有促进作用。

1.3生化反应结核分枝杆菌的生化反应不活泼。

不发酵糖类。

多数菌株触酶试验阳性，但68℃加热后酶活性消失即热触酶阴性，借此可与非结核分枝杆菌区别，后者热触酶试验大多阳性。

结核分枝杆菌硝酸盐还原试验、烟酸试验和烟酰胺酶试验阳性，而牛分枝杆菌则为阴性，可有助于两菌的鉴别。

2细菌学检验结核病的症状和体征往往都不典型，虽可借助x线摄片诊断，但确诊仍依赖于细菌学检验。

牛分枝杆菌系统进化及鉴定-欧喜超

性肝肾损伤，随后异烟肼被吡嗪酰胺和乙胺丁醇替代治疗，3周后出院，两个月后病人去世。
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病案分析
2002年，在患者居住的农场，一只屠宰的病牛肺组织上发现结核分枝杆菌，流行病学调查发现上述患者也在同一时间因结核病离世。基因分型结果显示两株分枝杆菌具有相同的基因型。
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牛分枝杆菌传统鉴定方法
1、生化鉴定
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➢ 枝杆菌感染患者1例，占全部患者的0.32%（1/313）。
牛分枝杆菌在复合群菌株进化中的位置
M. bovis M. tuberculosis
人型结核分枝杆菌起源于牛型结核分枝杆菌？？？
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全基因组序列图
1998年,首次完成了人结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列图，牛结核杆菌的全基因组序列于2003年完成，牛分枝杆菌全基因组序列较结核分枝杆菌小得多。
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牛结核分枝杆菌
➢ 1882年，德国科学家Koch发现结核病的病原菌结核分枝杆菌， 1898年， Smith 通过 ➢ 培养特征的差异将结核分枝杆菌和牛分枝杆菌区分开来。 ➢ 结核分枝杆菌为细长略带弯曲，牛分枝杆菌较粗短。 ➢ 牛分枝杆菌生长缓慢，专性需氧，初次分离培养时， ➢ 需36-37℃培养5-8周可出现菌落（推荐观察10-12 周）。 ➢ 结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的培养温度均为37℃～ ➢ 38℃。培养时最适pH值，结核分枝杆菌为7.4～8.0， ➢ 牛分枝杆菌为5.9～7.4。 ➢ 从标本内分离牛分枝杆菌或作为本菌的传种及保存 ➢ 需使用丙酮酸钠培养基（丙酮酸钠替代丙三醇）。 ➢
MTB和牛分枝杆菌均存在16s rRNA、Rv0577和ISl561 DNA片段，而牛分枝杆菌缺失Rvl510、Rvl970和Rv3120基因。
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