检测口蹄疫血清抗体的方法

牛口蹄疫病原检测方法及防治解救口蹄疫反转录聚合酶链反应（RT-PCR），用于检测疑似感染动物水疱皮或水疱液中所有血清型口蹄疫病毒，适用于口蹄疫病毒的检测、诊断和流行病学调查。

口蹄疫反转录聚合酶链反应（RT-PCR），用于检测疑似感染动物水疱皮或水疱液中所有血清型口蹄疫病毒，适用于口蹄疫病毒的检测、诊断和流行病学调查。

原理：利用异硫氰酸胍方法提取RNA，在反转录酶的作用下，以RNA 为模板，以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。

利用西安天隆科技有限公司生产的DTC型基因扩增仪，在TaqDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异性DNA片段的基因拷贝数放大一倍。

经过35个循环，终使基因放大数百万倍。

将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见DNA片段的扩增带。

该方法可以检测所有亚型的口蹄疫病毒，检测结果为阳性，需进一步采用分型诊断试剂盒进行进一步检测。

防治(1)预防病畜疑似口蹄疫时，应立即报告兽医机关，病畜就地封锁，所用器具及污染地面用2%苛性钠消毒。

确认后，立即进行严格封锁、隔离、消毒及防治等一系列工作。

发病畜群扑杀后要无害化处理，工作人员外出要全面消毒，病畜吃剩的草料或饮水，要烧毁或深埋，畜舍及附近，用2%苛性钠、二氯异氰豚酸钠(含有效氯≥20%)、k%～2%福尔马林喷洒消毒，以免散毒。

接种。

对疫区周围牛羊，选用与当地流行的口蹄疫毒型相同的疫苗，进行紧急接种，用量、注射方法、及注意事项须严格按疫苗说明书执行。

(2)治疗病初，即口腔出现水泡前，用血清或耐过的病畜血液治疗。

对病畜要加强饲养管理及护理工作，每天要用盐水、硼酸溶液等洗涤口腔及蹄部。

要喂以软草、软料或麸皮粥等。

口腔有溃疡时，用碘甘油合剂(1：豆)每天涂搽3～4天，用大酱或10%食盐水也可。

蹄部病变，可用消毒液洗净，涂甲紫溶液(紫药水)或碘甘油，并用绷带包裹，不可接触湿地。

应急要点●发现牛、羊、猪等偶蹄动物的口腔、蹄部和乳房等处皮肤有水疱和溃烂，出现流涎和跛行，应立即报告所在地区的兽医部门。

ICS 11.220 B 41团体标准T/CVMA X25—2019口蹄疫病毒O 型、A 型抗体管式化学发光免疫分析检测方法Tubular Chemiluminescence Immunoassay For Detecting Antibodies OfFoot and Mouth Virus(FMDV) Tipe O 、A2019 - XX - XX 发布2019 - XX - XX 实施中国兽医协会C V M A前 言本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。

本标准由中国兽医协会提出并归口。

本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所，中国动物疫病预防控制中心本标准主要起草人：林密、包艳芳、孙雨、蒋韬、马军武、何继军、王传彬，陈夏辉、郭建宏、宋晓晖，刘湘涛、杨林、李峰松、李昕、孙燕燕、杨光、贺华丽中国兽医协会C V M A引 言口蹄疫（Food-and-Mouth Disease,FMD ）是一种由口蹄疫病毒（Food-and-Mouth Disease Virus,FMDV ）引起的偶蹄动物共患烈性传染病，被世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties,OIE ）列为法定报告病之一；《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》（国办发〔2012〕31号）中，将口蹄疫（A 型、亚洲I 型、O 型）列为优先防治的5种动物疫病之一；其易感动物种类多，传播迅速，可造成大量动物感染死亡，该病的流行严重危害我国养殖业发展，影响相关动物及动物产品的国际贸易，给我国相关产业造成了巨大损失。

口蹄疫病毒在分类上属于小RNA 病毒科（Picornaviridae ），口蹄疫病毒属，总共有7个血清型，在我国流行的主要有O 型、A 型和Asia1型，其中2009年后主要流行毒株为O 型 Mya-98 毒株、A 型 Sea-97 毒株，防控形势依然严峻。

猪场兽医VETERINARY猪O型口蹄疫抗体水平检测与分析刘 鸽，于会举，张培生，张 倩，宋 敏，杨慧敏，吴圆圆，屈勇刚*(石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003)口蹄疫（food and mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性和高度接触性的偶蹄动物传染病[1-5]，被国际兽医局（OIE)列为必须上报的动物疫病，被我国列为一类动物传染病[6-8]。

FMD属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，包括7个血清型（A、O、C、SATI、 SATⅡ、SATⅢ和亚洲I型，其中O型口蹄疫是世界上流行最广的一种血清型）和80多个血清亚型，并且各血清型之间无交叉免疫现象[9]。

1514年，FMD被首次报道，现已在全球蔓延，并严重威胁畜牧业的健康发展，给畜牧业造成巨大损失[10-13]。

在应对FMD方面，我国采取疫苗免疫接种和扑杀的综合防治措施，效果明显[14-16]。

近些年，我国强制免疫中广泛使用猪口蹄疫O型灭活疫苗和猪口蹄疫O型合成肽疫苗。

2015年下半年至今，猪肉价格较高，激发了养猪单位中畜牧工作者的工作积极性，极大地促进了养猪事业的发展。

为了解2014年1月—2016年9月北疆地区口蹄疫（FMD)的免疫抗体水平，本试验选择克拉玛依、沙湾、石河子、玛纳斯、奇台5个不同区域的19个规模化猪场进行猪O型口蹄疫ELISA抗体水平检测并做出初步分析，在一定程度上可为北疆地区口蹄疫防疫工作提供一定的参考。

1　材料与方法1.1　试验材料1.1.1　样品来源2014年1月至2016年9月采自新疆北疆地区的克拉玛依、沙湾、石河子、玛纳斯、奇台5个不同区域的19个规模化猪场不同类型猪群（0～10 d、11～ 20 d、21～30 d仔猪，后备母猪，经产母猪，种公猪），共采集血样980份。

1.1.2　材料和仪器猪O型口蹄疫病毒 ELISA 抗体检测试剂盒（武汉科前生物）、自动酶标仪（美国 Bio Tek 仪器有限公司）、一次性5 mL兽用采血器、微量移液器（Eppendorf公司）、若干个移液枪头（已高压灭菌）、恒温培养箱（光明医疗仪器厂）、平板震荡仪等。

检测口蹄疫病毒抗原的方法（一）口蹄疫反向被动红细胞凝集试验（反向被动血凝）红细胞膜具有吸附抗原或抗体的特性，将提纯的口蹄疫抗体（IgG）在pH4.0醋酸缓冲液中致敏绵羊红细胞，当这种被致敏的红细胞（即红细胞表面均带有口蹄疫抗体），遇到相应的口蹄疫病毒抗原时，便产生抗原抗体的特异性反应，从而使红细胞发生肉眼可见的凝集现象。

该法快速、简便、准确、可同步鉴定出口蹄疫毒型和鉴别口蹄疫、猪水泡病病原。

1．试验材料V型96孔130o血凝滴定板、玻璃吸管（1毫升、5毫升规格）、玻璃中试管（内径15毫米，长度100毫米）、试管架、微量振荡器、微量移液器、塑料咀、玻璃板（与血凝板大小一致）、口蹄疫O、A、C、Asia-I 型、SVD（猪水泡病）反向被动血凝诊断试剂及其配套用的口蹄疫各型、猪水泡病阳性抗原、阴性抗原、稀释液、待检抗原。

２．试验方法（１）稀释待检抗原取中试管8支，横列于试管架上，每管各加入稀释液1 毫升，取待检抗原1毫升加入第1管混匀后从中取出1毫升加入第2管，混匀后取1毫升加入第3管……直至第8管，此时待检抗原的稀释度依次为1：6、1：12、1：24、1：48、1：96、1：192、1：384、1：768。

（２）稀释阴性抗原取中试管1支用记号笔标明“阴抗”字样，加入稀释液390微升，加入阴性抗原10微升，充分混匀，此时阴性抗原的稀释度为1：40。

（３）稀释阳性抗原取中试管20支，横列于管架标明“阳抗”字样，每排4支，（O型4支、A型4支、C型4支、Asia-1型4支、SVD4支）。

每种阳抗第1管，加稀释液4.7毫升，第2~4管各加稀释液0.5毫升。

取O型阳性抗原0.1毫升(100微升)加入第1排的第1管中混匀后取出0.5毫升，加入第1排的第2管并充分混匀，取出0.5毫升加入第1排的第3管混匀后取出0.5毫升加入第1排的第4管并混匀。

其他阳性抗原均按上法稀释，注意每稀释一种阳抗必须更换1支吸管，切勿混杂以免影响反应的特异性。

猪亚洲l型口蹄疫免疫抗体检测与分析作者：邵胜勇来源：《畜牧兽医科学》 2018年第4期猪亚洲I型口蹄疫免疫抗体检测与分析邵胜勇（北京市顺义区动物疫病预防控制中心，北京 101300）摘要：口蹄疫是世界动物卫生组织(OIE)规定的A类烈性动物传染病，我国列为一类动物传染病。

口蹄疫共有7种血清型，亚洲I型是其中一种。

目前，国内还没有对猪亚洲I型口蹄疫进行强制免疫，我们通过2015-2017年对13958头猪进行亚洲I型口蹄疫免疫抗体的检测，旨在对本地区猪群通过免疫口蹄疫O型-亚I型疫苗产生的抗体进行监测，掌握群体免疫抗体水平，评价免疫疫苗的有效性，并对免疫效果进行总结，对生产中发现的问题进行分析，提出解决的对策。

方法为：猪群在免疫口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗28d至4个月之间，免疫次数从一免至五免，采集猪血清，以亚洲I型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，定量检测样品抗体水品。

通过分析检测数据，得出如下结论：猪亚洲I型口蹄疫免疫抗体阳性率和抗体水平总体不高，但具备较好的保护力；商品猪免疫抗体阳性率和抗体水平均高于种猪；免疫抗体阳性率随免疫次数增加呈逐渐上升趋势，但四免后阳性率下降，到五免时则再次上升。

通过检测免疫抗体，分析其变化特征及规律，为猪亚洲I型口蹄疫的防控、研究及免疫提供依据。

关键词：口蹄疫；亚洲I型；免疫抗体；检测中图分类号：S858.28 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.0021 方法1.1 疫苗疫苗均为口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗，中牧实业股份有限公司兰州生药厂生产。

1.2 疫苗免疫及样品采集由于实际生产中不对猪进行亚洲I型口蹄疫单独免疫，因此免疫程序均按照口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗的免疫程序进行免疫，即仔猪30日龄时首免，1个月后二免，之后每4个月免疫1次。

所检测血清样品均为免疫后28天至4个月以内的样品，免疫次数从一免至五免。

一、检测方法特异性抗体检测在疫病诊断、传染病流行病学调查及评价疫苗免疫效果评价具有重要的参考意义。

现阶段，抗体检测的方法较多，除传统的沉淀反应，凝集试验，补体结合试验外，标记免疫测定已成为主要的免疫抗体测定技术(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)，而酶联免疫测定是目前应用最为广泛的方法之一。

1.中和抗体中和抗体是当病原微生物侵入机体时产生的相应的抗体。

病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。

中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，中和抗体的作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的溶解。

病毒中和试验是世界动物卫生组织推荐的标准方法，抗体与口蹄疫病毒特异性中和作用使病毒失丧失感染力，需要培养病毒敏感细胞；所需的病毒必须为活病毒，具有感染性。

2、结构蛋白抗体在原则上来说，只要是异己蛋白质进入机体，就会被免疫系统识别，然后产生相应抗体。

灭活疫苗的本质是一种抗原，只不过它通过改造已经没有了病毒的毒性。

当疫苗注入到机体之后，由于病毒抗原含有多种不同的蛋白，因此机体会产生不同的抗体。

然而，并非所有的结构抗体都有抗病毒的作用。

中华人民共和国农业农村部规定的口蹄疫免疫抗体评价的方法分别为液相阻断E L I S A抗体检测试验、正向间接血凝试验、V P1结构蛋白抗体检测试验。

2.1液相阻断ELISA抗体检测试验（国际贸易指定法）我国目前采取以免疫为主的综合防控措施进行口蹄疫防控，免疫抗体检测是衡量疫苗免疫效果的重要指标。

目前,国际粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织推荐液相阻断ELISA来对口蹄疫免疫效果进行评价。

硏究表明口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性,与攻毒保护有很好的相关性,现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。

猪口蹄疫病毒(FMDV)Elisa试剂盒说明书本试剂盒仅供研究使用。

检测范围： 96T15ng/L – 480ng/L使用目的：本试剂盒用于测定猪血清、血浆及相关液体样本中口蹄疫病毒(FMDV)含量。

猪口蹄疫病毒(FMDV)Elisa试剂盒说明书实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中猪口蹄疫病毒(FMDV)水平。

用纯化的猪口蹄疫病毒(FMDV)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入口蹄疫病毒(FMDV)，再与HRP标记的口蹄疫病毒(FMDV)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的口蹄疫病毒(FMDV)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中猪口蹄疫病毒(FMDV)浓度。

试剂盒组成1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶 7 终止液6ml×1瓶2 酶标试剂6ml×1瓶 8 标准品(960ng/L) 0.5ml×1瓶3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液1.5ml×1瓶4 样品稀释液6ml×1瓶 10 说明书 1份5 显色剂A液6ml×1瓶 11 封板膜 2张6 显色剂B液6ml×1/瓶 12 密封袋 1个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

480 ng/L 5号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液240 ng/L 4号标准品 150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液120ng/L 3号标准品 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液60 ng/L 2号标准品 150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液30 ng/L 1号标准品 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2. 加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。

口蹄疫A型抗体检测试剂盒（酶联免疫法）使用说明书【产品名称】通用名：口蹄疫A型抗体检测试剂盒（酶联免疫法）英文名：Test Kit for Antibodies to Foot and Mouth Disease Virus A（ELISA）【包装规格】×2/盒96T×1/盒、96T、96T×5/盒【预期用途】口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，其特征为口腔黏膜、蹄部、乳房皮肤发生水泡和烂斑。

本试剂用于检测牛、羊、猪血清中口蹄疫A型抗体，可用于口蹄疫A型疫苗免疫效果评价。

【原理】本试剂盒由预包被口蹄疫A型抗体的酶标板、抗体工作液、抗原液、酶标记物及其他配套试剂组成，应用阻断酶联免疫法（ELISA）原理检测牛、羊、猪血清样本中口蹄疫A型抗体。

实验时将稀释的样本与抗原液同时加入酶标板中孵育，样本中的抗体与酶标板上的抗体竞争抗原，阻断抗原与板的结合；经洗涤后，再加抗体工作液孵育；经洗涤后加入酶标记物孵育；再经洗涤除去未结合的酶标记物，在孔中加底物液，与酶标结合物反应形成蓝色产物，显色深浅与样品中的特异性抗体含量成负相关；加入终止液终止反应后，产物变为黄色；用酶标仪在450nm波长测定各反应孔中的吸光值，即可知样品是否含有口蹄疫A型抗体。

【试剂盒组成】【储存及有效期】2～8℃保存，有效期12个月。

包被板开封后请于2～8℃避光保存，避免受潮。

使用期限为2个月。

【适用仪器】含450nm、630nm波长的酶标仪，37℃恒温设备，可调微量移液器。

【样品准备】1.取动物全血按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血、无污染。

样品1周内可于2～8℃保存，长期需置-20℃保存。

2.用工作洗涤液将待检牛、羊先按32倍稀释（如5μl 血清加入155μl 工作洗涤液中，混匀），待检猪血清按16倍稀释（如5μl 血清加入75μl 洗涤液中，混匀），阴、阳性对照不用稀释。

口蹄疫监测诊断作业指导书一、口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体检测酶联免疫吸附试验1.适用范围用于检测猪、牛、羊血清中的口蹄疫病毒VPI结构蛋白抗体，与猪、牛、羊口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒联合使用，可区分口蹄疫病毒感染动物及疫苗免疫动物。

检测猪血清应用猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒；检测牛、羊血清应用牛、羊口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒。

2.检测试剂口蹄疫病毒VP1抗原包被板、样品稀释液、酶结合物、阴性对照、VP1阳性对照、酶结合物稀释液、TMB底物A液、TMB底物B液、终止液（l.OMHZSO。

）、浓缩洗涤液、稀释板、一次性封板膜、微孔定位标签。

3.检测步骤3.1使用前将试剂盒恢复到室温，避免阳光直射或放置在30℃以上的环境中。

3.2取出试剂盒中的样品稀释液。

A1、B1两孔作为阴性对照，Cl、D1两孔作为阳性对照孔，其余孔作检测孔，每孔一个样品。

3.3在稀释板的各孔中加200样品稀释液。

在相应各孔中分别加入10此对照血清或被检血清样品。

用加样器重复吹吸数次。

稀释每个样品时必须使用不同的吸头。

3.4取出抗原包被板。

3.5分别从稀释板上取稀释后的对照血清和被检血清各100此，加至抗原包被板的相应孔中，加益或封膜后，置37士2℃下孵育60士5分钟。

3.6洗涤工作液配制：按需要量，用去产离子水或双蒸水将洗涤液作25倍稀释。

3.7用洗涤工作液洗涤抗原包被板，每孔300吨，洗涤6次，拍干。

3.8酶结合物工作液配制：用酶结合物稀释液将酶结合物作100倍稀释，现配现用。

3.9每孔加入100此酶结合物工作液，加盖或封膜后，置37±2℃下孵育30±2分钟。

3.10重复3.7。

3.11TMB底物工作液配制：将TMB底物B液和TMB底物A液等量混合，现配现用。

3.12每孔加入100此底物工作液，加盖或封膜后，置37±2℃下孵育15±1分钟。