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【CN110095607A】用于检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒血清抗体的通用型间接ELISA试剂盒及其

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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910304998.7
(22)申请日 2019.04.16
(71)申请人 东北农业大学
地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木
材街59号
(72)发明人 马波　戚海惠　刘悦　张琪　
陈浩田　常蕊　张雪莲　张文龙　
高明春　王君伟　
(74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理
有限责任公司 11139
代理人 孙皓晨　马鑫
(51)Int.Cl.
G01N 33/576(2006.01)
G01N 33/531(2006.01)
(54)发明名称用于检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒血清抗体的通用型间接ELISA试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开了一种用于检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒血清抗体的通用型间接ELISA试剂盒及其应用。

本发明建立了一种基于VP0重组蛋白检测1型和3型DHAV血清抗体的通用型间接ELISA 检测方法，该方法是以原核表达的1型DHAV VP0重组蛋白为检测抗原，经Western blotting和间接ELSIA方法证实该VP0重组蛋白即可以与1型DHAV血清抗体发生特异性反应，也能与3型DHAV 血清抗体发生特异性反应，因此以1型DHAV VP0重组蛋白为检测抗原进行间接ELISA检测可判断被检鸭血清是否含有1型和3型鸭甲型肝炎病毒的抗体及其抗体水平，本发明的提出为有效防治
鸭甲型肝炎提供了新的快速检测手段。

权利要求书2页 说明书13页序列表2页 附图7页CN 110095607 A 2019.08.06
C N 110095607
A
权　利　要　求　书1/2页CN 110095607 A
1.1型鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus1,DHAV-1)VP0重组蛋白在制备检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒血清抗体通用型检测试剂中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的1型鸭甲型肝炎病毒VP0重组蛋白由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码。

3.用于检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus,DHAV)血清抗体的通用型间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括1型DHAV VP0重组蛋白包被的ELISA板。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的1型DHAV VP0重组蛋白按照以下方法制备得到：
1)以携带1型DHAV VP0基因的阳性质粒作为模板，通过RT-PCR方法对其VP0基因进行扩增、克隆至pMD18-T得到重组质粒pMD18T-DHAV-1-VP0，扩增1型DHAV VP0基因的上下游引物分别是：
DHAV-1-VP0上游引物：5’-CCGGAATTCATGGATACTCTCACCAAAAA-3’
DHAV-1-VP0下游引物：5’-CCGCTCGAGTAACTGATTGTCAAATGGTCG-3
2)以EcoR I和Xho I限制性内切酶同时对重组质粒pMD18T-DHAV-1-VP0和pET-30a(+)载体进行酶切，回收目的片段，16℃金属浴连接过夜，将连接产物转化到TG1感受态细胞，提取质粒，质粒经EcoR I和Xho I双酶切鉴定正确后获得阳性重组表达质粒pET30a-DHAV-1-VP0；
3)将阳性重组表达质粒pET30a-DHAV-1-VP0转化到RosettaTM(DE3)PlysS感受态细胞，获得的阳性质粒菌于37℃培养，待A600值达到0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L 进行诱导表达，收集诱导表达后5h的菌体，超声波破碎，离心后取沉淀进行SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定，而后沉淀用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱纯化，透析，得到1型DHAV VP0重组蛋白。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，步骤1)中扩增得到的1型DHAV VP0基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的1型DHAV VP0重组蛋白包被的ELISA 板是按照以下方法制备得到：
用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液作为抗原包被缓冲液，将DHAV-1-VP0重组蛋白稀释为0.25ug/mL，按100uL/孔加入ELISA反应板中，37℃作用2h，4℃包被过夜，洗涤液洗板，拍干，用5％w/v脱脂乳37℃封闭2小时，以含0.05％v/v吐温-20pH7.4的PBS洗涤，拍干。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括样品稀释液、10×浓缩洗涤液、酶结合物工作液、显色液A、显色液B、终止液、阳性血清和阴性血清。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含0.05％v/v吐温-20的0.05M pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述10×浓缩洗涤液为含0.05％v/v吐温-20的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述酶结合物工作液为HRP-山羊抗鸭IgG；所述显色液A为0.2mg/mL的四甲基联苯胺溶液，所述显色液B为含0.5‰w/v过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；所述终止液为0.01M硫酸溶液；所述阳性血清为经鸭甲型肝炎病毒1型疫苗和3型病毒尿囊液免疫成年鸭获得的阳性血清；所述阴性血清为未免疫鸭的血清。

9.如权利要求3-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，用于检测1型和3型鸭甲型肝炎病
2。

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鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立

鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立

Chinese Journal of Veterina/Medicine中国兽医杂志2020年(第56卷)第3期53鸭甲肝病毒的间接ELISA方法的建立,张，闫艳新，任慧英，刘文华(青岛农业大学动物医学院，山东青岛266109)摘要:为建立一种切实可行的鸭甲肝病毒抗体的检测方法，将1株临床分离的3型鸭甲肝病毒的VP3基因进行原核表达的纯化蛋白作为包被抗原，初步建立了检测鸭肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。

通过条件优化，得到VP3蛋白最佳包被浓度为0.1595"g/mL,血清最佳稀释倍数为1：200。

结果显示,建立的ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，与商品化的双ELISA的符合率为92.5%，且该方法1型和3型鸭甲肝病毒抗体，因而可用于临床免疫鸭毒的种鸭水平的和卵黄的效价测定。

关键词：3型鸭甲肝病毒；VP3蛋白；间接ELISA中图分类号：S855.3文献标志码：A文章编号：0529—6005(2020)03—0053—04Establishment of Isdirect ELISA for Detection of DuckHepatitis A Virrs(DHAV)AntibodyYIN Yin，ZHANG Yan-jia，YAN Yan-xin，REN Hui-ying，LIU Wen-hua(Co e geoeVeeeainaayMedicine，QingdaoAgaicueeuaaeUniveasiey，Qingdao266109，China)Abstract:In order to establish a method to detect the antibodies against duck hepa/Os A virus(DHAV)，an indirect ELISA meehod eoadeeeceion oeDHAVaneibodywaseseabeished byusingehepuaieied paoeein ascoaeinganeigen，which waspaokaayoeicei-pressed VP3gene from a clinically isolated DHAV-3.Optimized conditions were as following，the optiGai concentration of coating VP3paoeein was0.1595"gLmL，and eheopeimaedieueion aaeiooeseaum was1：200.Resueesshowed eheELISA meehod had good specieiciey，sensieivieyand aepeaeabieiey，and ehecoincidenceaaeewieh commeaciaedoubeeaneigen sandwich ELISAwas92.5%.Fua-eheamoae，eheindiaeceELISAcoued deeeceaneibodiesboeh againseDHAV-1and DHAV-3.Theaeeoae，iecan beused eodeeeceseaum aneibodyeeveesoeceinicaebaeed ducksimmunized wieh DHAVvaccineand eheeieeaoeyoek aneibody.Key wordt:DHAV-3；VP3Paoeein；indiaeceELISACorressonding author:LII Wen-hua，E-mail:wenhua/u2688@鸭肝炎病毒！Duck hepatitis virus，DHV)可引起鸭急性高度性感染，尤其是3周龄内最易感，亡率高达80%，给养鸭业造成大经济损失[1]o DHV可分为I、)、皿三个血清型，其中I型DHV属于小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭毒(Duck hepatitis A virus，DHAV),)型DHV和III型收稿日期：2019—03—29基金项目：山东省现代农业产业技术体系家禽产业创新团队项目(SDAITC11C3)作者简介:殷茵(1993-)，女,硕士生，主要从事兽医微生物与免疫学研究，E-mail：2313354988@张琰杰(1995-)，男，硕士生，主要从事兽医微生物与免疫学，E-mai e:745261031@:张琰杰与殷茵对本文具有同等贡献通讯作者:刘文华,E-mail：wenhua/u2668@126-com DHV属于星状病毒状病毒属鸭星状病毒(Duck astro v irus，DAstO)*2+o其中DHAV又根据基因性差异分为3个基因型,分别为1型DHAV、2型DHAV和3型DHAV[3]%前临床鸭肝炎主要是由1型和3型DHAV引起⑷％我国临床对DHAV商品化的生物制品主要是1型DHAV弱毒苗，3型DHAV疫苗到审批％由于3型DHAV的广在，大分种鸭场也会利用3型DHAV临床分离株活苗与1型DHAV疫苗免疫％商品鸭场为防鸭，通常在3~5日龄进行卵黄 射，目前临床应用的是1型+3型的双联抗体，对DHAV建立一种、、特异的法是非的％虽对鸭毒的商品化ELISA，但昂贵％由于DHAV颗粒太小，不易得到纯化病毒，而54中国兽医杂志2020年（第56卷）第3期Chinese Journal of Veterinai/Medicine以全病毒作为包被抗原对病毒的纯化要求又较高，本试验达蛋白作为包被,建立一匚测DHAV抗体的间接ELISA方法,为临床种鸭免疫效果的判定及DHAV卵黄抗体效价测定%1材料表达载体pCold TF,为TaKaRa公司产品；弗氏完和弗氏不完，为Sigma公司产品；山鸭IgG酶标二抗,为国KPL产品；鼠抗His标签单克隆,为Top Science公司产品;3型DHAV双ELISA ,为海岚派生物产品;其他,为Sola/io公司产品;试验用各类病毒阳性，为山东省农业科学院黄兵员％2间接ELISA方法的建立2-1包被抗原和抗体最佳工作浓度确定将实验室前期表达鉴定的DHAV的VP3蛋白通过切胶回法进行纯化*5+%纯化蛋白用包被液分别进行1：10、1：100、1：1000、1：2000、1：4000的倍比稀释,加入酶中4l包被过夜。

鸭甲型肝炎病毒1型3C 基因的原核表达与多抗的制备

鸭甲型肝炎病毒1型3C 基因的原核表达与多抗的制备

鸭甲型肝炎病毒1型3C 基因的原核表达与多抗的制备王安平;朱善元;王永娟【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2015(000)008【摘要】以血清1型鸭甲型肝炎病毒（DHAV －1）SH 株3C 基因为序列设计1对特异性引物，RT －PCR 方法进行扩增，克隆入原核表达载体 pET －32a，转化大肠杆菌 BL21（DE3），在 IPTG 诱导下重组蛋白并获得成功表达，该重组蛋白分子量约为38 ku，能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。

将目的蛋白切胶免疫 ICR 小鼠，制备重组蛋白的多抗血清，经 Western －blot 分析证明，制备的抗血清能够与 DHAV －1感染的 SPF 鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。

3C基因在大肠杆菌中可获得成功表达，制备的多抗血清可用于3C 蛋白的检测。

【总页数】3页(P205-206,207)【作者】王安平;朱善元;王永娟【作者单位】江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州 225300;江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州 225300;江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州 225300【正文语种】中文【中图分类】S858.32【相关文献】1.Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因的原核表达与多抗的制备 [J], 王安平;朱善元;王永娟;吴双;左伟勇;洪伟鸣2.鸭新城疫病毒 NP 基因的原核表达与多抗的制备 [J], 王安平;朱善元;吴双;王永娟;左伟勇;洪伟鸣3.鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备 [J], 王安平;朱善元;吴双;王永娟;左伟勇;洪伟鸣4.Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒3C基因在昆虫细胞的表达与检测 [J], 吴植;顾玲玲;朱善元;王安平5.Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备 [J], 顾玲玲;朱善元;成大荣;左伟勇;洪伟鸣;蔡树东;王安平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

国家三类新兽药鸭甲型肝炎病毒二价蛋黄抗体（1型＋3型）

国家三类新兽药鸭甲型肝炎病毒二价蛋黄抗体（1型＋3型）

国家三类新兽药鸭甲型肝炎病毒二价蛋黄抗体（1型＋3型）吕淑荣;侯艳霞
【期刊名称】《兽药市场指南》
【年(卷),期】2017(0)5
【摘要】一、研发背景鸭病毒性肝炎（Duck hepatitis virus，DHV）简称鸭肝炎，是一种传播迅速、高度致死性的传染病，一年四季均可发生，自然爆发时主要为3周龄以内的雏鸭，以4-8日龄最为易感，雏鸭的发病率可高达100％，死亡率高达50％-90％。

鸭甲型肝炎病毒可分为1，2,3三个血清型，三型之间交叉保护微弱。

【总页数】3页(P11-13)
【关键词】鸭病毒性肝炎;甲型肝炎病毒;三类新兽药;蛋黄抗体;二价;virus;一年四季;交叉保护
【作者】吕淑荣;侯艳霞
【作者单位】烟台绿叶动物保健品有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】S858.32
【相关文献】
1.国家三类新兽药鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗 [J], 徐兆强;尤永君
2.国家三类新兽药鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗 [J], 徐兆强;尤永君;
3.国家三类新兽药鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗（1型ZJ01株＋2型HN01株＋
7型YC03株） [J], 李富金
4.农业部批准鸭甲型肝炎病毒二价蛋黄抗体(1型+3型)为新兽药 [J],
5.国家三类新兽药鸭传染性浆膜炎二价灭活苗 [J], 史振坤
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一种快速鉴别1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量方法[发明专利]

一种快速鉴别1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量方法[发明专利]

专利名称：一种快速鉴别1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量方法
专利类型：发明专利
发明人：姜世金,林少莉,张瑞华
申请号：CN201410317515.4
申请日：20140704
公开号：CN104046704A
公开日：
20140917
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种检测1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量RT-PCR特异性引物，是对GenBank上已发表的DHAV-1、DHAV-3的序列进行比对，在两种病毒基因序列的保守但相互之间差异又较大的区域，分别设计一对针对DHAV-1的特异性检测引物SEQ1、SEQ2，一条Taqman探针Probe1；一对针对DHAV-3的特异性检测引物SEQ3、SEQ4，一条Taqman探针Probe2；确定了针对DHAV-1和DHAV-3的双重荧光定量RT-PCR的特异性引物及Taqman探针浓度；利用该组引物建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法，特异性好、灵敏度高，可以用于1型和3型鸭甲肝病毒的快速血清型鉴定和实时定量分析。

申请人：山东农业大学
地址：271018 山东省泰安市岱宗大街61号
国籍：CN
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