在活细胞线粒体内通过空间限制酶标记映射的蛋白质组学
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四川省部分中学2023高中生物第5章细胞的能量供应和利用考点题型与解题方法单选题1、图甲表示全光照和不同程度遮光对某种水稻(阳生植物)叶片中叶绿素含量的影响;图乙表示初夏某天在遮光50%条件下,温度、光照强度、该植物净光合速率和气孔导度(气孔张开的程度)的日变化趋势。
下列有关说法正确的是()A.分析图甲,可以推测在叶面积相同的情况下,阴生植物的叶绿素含量高于阳生植物的B.分析图甲,可知遮光90%条件下水稻的产量高于遮光50%条件下水稻的产量C.分析图乙,可知8:00到12:00净光合速率降低,主要原因是气孔导度降低D.分析图乙,可知8:00时水稻光合速率为零,18:00时有机物积累最多答案:A分析:分析图甲:表示全光照和不同程度遮光对该植物叶片中叶绿素含量的影响,遮光的百分比越大,叶绿素含量越多。
分析图乙:表示初夏某天在遮光50%条件下,温度、光照强度、该植物净光合速率和气孔导度(气孔张开的程度)的日变化趋势。
A、分析柱形图可知,遮光的百分比越大,叶绿素含量越多,可以推测在叶面积相同的情况下,阴生植物的叶绿素含量高于阳生植物,A正确;B、分析图甲,可知遮光90%条件下水稻的叶绿素含量高于遮光50%条件下的水稻,但遮光90%条件下的光照少遮光50%条件下,因此水稻的光合速率不一定高于遮光50%条件下的水稻,且产量的高低还要看呼吸作用的大小,B错误;C、净光合作用速率=实际光合作用速率-呼吸速率,8:00到12:00光照强度增强,但气孔导度相对稳定,CO2供应受限制,实际光合作用速率增加,但幅度不大,且由于该时间段内温度升高,呼吸作用速率也增加,实际光合作用增加的速率小于呼吸作用增加的速率,因此净光合作用速率下降,C错误;D、分析图乙,可知8点时水稻净光合速率最大,不为0,18点时净光合作用为0,积累有机物最多,D错误。
故选A。
2、F蛋白是线粒体内膜上的一种跨膜蛋白,它能将线粒体膜间隙的H+顺浓度运输至线粒体基质,与此同时催化 ADP 和Pi 合成 ATP。
东南大学农学院2021级《细胞生物学》课程试卷(含答案)__________学年第___学期考试类型:(闭卷)考试考试时间:90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题(35分,每题5分)1. 细胞外基质中的分泌蛋白主要是从高尔基体分泌小泡中分泌到细胞外的。
()答案:正确解析:主要就分泌蛋白主要在粗面内质网上合成,在进入高尔基体加工修饰,通过膜泡运输的方式分泌到细胞外基质中。
2. 乙酰胆碱对一个动物的不同细胞有不同的效应,而且它和不同细胞上的不同受体分子相结合。
()答案:正确解析:比如,乙酰胆碱通过结合一种G微管蛋白耦联受体而减弱心肌细胞的搏动;通过结合另一不同的乙酰胆碱受体而刺激骨骼肌细胞的收缩。
这种受体是一种配体门控离子通道。
3. 细胞对大分子物质的运输中,胞饮作用形成的内吞泡需要微丝的参与,而吞噬作用形成的内吞泡需要网格蛋白的参与。
()答案:错误解析:细胞对大分子物质的运输中,胞饮泡的催生形成可能需要网格蛋白的参与,而吞噬形成的内吞泡需要微丝及其结合蛋白的参与。
4. 一片枯萎的植物叶子可以比作放了气的自行车轮胎。
()答案:正确解析:植物萎蔫时,细胞内的膨压减小,结果其细胞壁有张力但不能抗压强度,如橡胶轮胎一样,不再提供刚性。
5. 亚显微结构即超微结构。
()答案:正确解析:亚显微结构又称超微结构。
指在普通光学显微镜下观察不能分辨清楚细胞内的各种微细结构。
6. N连接的糖基化通常比O连接的糖基化修饰所产生的糖链的最终长度要长。
()答案:正确解析:N连接的糖基化产生的糖链至少有5个糖残基,而O连接的糖基化产生的糖链一般为1~4个残基(AB0血型抗原的糖基侧链除外)。
7. 通常微管的负端埋在中心体中,而正端只能加长,不能缩短,所以能保证微管的稳定。
()答案:错误解析:微管的负端埋在培训中心体中,但正端是可以加长的。
2、名词解释(40分,每题5分)1. 细胞迁移[暨南大学2019研]答案:细胞迁移也称作细胞爬行、细胞移动或细胞运动,是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度脉冲后而产生的移动。
2013年全国中学生生物学联赛试卷注意事项:1.所有试题使用2B铅笔在机读卡上作答;2.试题按学科分类,单选和多选题混排,多选题答案完全正确才可得分;3.纸质试卷80题90分,电子试卷40题60分,共计120题,150分;4.答题时间120分钟。
一.细胞生物学、生物化学、微生物学20题21分1.线粒体是半自主的细胞器,下列有关其蛋白质来源的描述,错误的是:(单选1分)A.线粒体可以独立合成蛋白质B.线粒体蛋白质的大部分由核基因编码C.线粒体外膜的蛋白质为核基因编码,内膜的蛋白质由线粒体编码D.线粒体编码的蛋白质是细胞生命活动所必须的2.视网膜母细胞瘤主要是由于:(单选1分)A.原癌基因Rb基因突变引起的B.抑癌基因Rb基因突变引起的C.原癌基因P53基因突变引起的D.抑癌基因P53基因突变引起的3.现代生物学研究多从‘全局’出发,研究细胞中整体基因的表达规律即生物组学,按照研究层面可进一步分成不同的组学。
下列按照基因表达流程正确排列的组学为:(单选1分)A.基因组学-蛋白质组学-转录组学-代谢组学B.基因组学-转录组学-蛋白质组学-代谢组学C.代谢组学-蛋白质组学-转录组学-基因组学D.代谢组学-基因组学-蛋白质组学-转录组学4.下列哪个科学实践可以作为分子生物学诞生的标志?(单选1分)A.格里菲斯的肺炎双球菌转化B.沃森和克里克提出DNA双螺旋结构模型C.丹麦科学家Johannsen将“遗传颗粒”命名为基因D.Avery等发现遗传物质是DNAE.孟德尔发现遗传学规律5.内膜系统处于高度动态之中,在细胞生命活动中膜融合是必须的过程。
下列关于膜融合的描述,正确的是:(单选1分)A.膜融合是由热力学推动的自发过程B.膜融合没有选择性C.膜融合需要特定的蛋白参与D.膜融合需要指定的脂分子参与6.人的 ABO血型抗原位于红细胞质膜上,它们在胞内合成、修饰和转运的路线可能是:(单选1分)A.核糖体-内质网-高尔基体-质膜B.内质网-高尔基体-质膜C.核糖体-内质网-质膜D.细胞核-核糖体-内质网-高尔基体-质膜7.下列有关细胞凋亡的描述,错误的是:(单选1分)A.细胞凋亡途经都是依赖于Caspases来切割底物蛋白的B.细胞凋亡过程中细胞内容物不会外泄C.细胞凋亡是主动地细胞死亡过程D.细胞凋亡途径是细胞信号网络组成的部分8.指导分泌蛋白质在糙面内质网上合成的决定因素除了信号识别颗粒和停泊蛋白外,还有:(单选1分)A.蛋白质中的内在停止转移锚定序列B.蛋白质N端的信号肽C.蛋白质C端的信号肽D.蛋白质中的α螺旋9.生物样品经过固定后就会失去生物活性,我们可以借助相差显微镜观察活细胞显微结构的细节。
东南大学农学院2021级《细胞生物学》课程试卷(含答案)__________学年第___学期考试类型:(闭卷)考试考试时间:90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题(35分,每题5分)1. G蛋白偶联受体中,霍乱毒素使G蛋白α亚基不能活化,百日咳毒素使G蛋白α亚基持续活化。
()答案:错误解析:霍乱毒素,使α亚基丧失GTP酶的活性并处于持续活化状态;百日咳毒素抑制Gi的活性。
2. M6P受体蛋白是高尔基体反面网络上特有的受体蛋白,主要起到分拣溶酶体的酶的作用。
()答案:错误解析:M6P受体蛋白鞭叶不是高尔基体反面网络上特有的受体蛋白,质膜上也有M6P受体蛋白。
3. 叶绿体中,类囊体膜两侧也存在较高的电位差。
()答案:错误解析:叶绿体中,类囊体膜不能使质子自由通过,碳纳米管所以造成膜两侧的浓度差别较大。
4. 与胞内受体结合的信号分子多为亲脂性分子。
()答案:正确解析:亲脂性分子疏水性较强,可穿过细胞膜进入细胞。
5. 线粒体增殖是通过分裂进行的,且与细胞分裂同步。
()答案:错误解析:线粒体是由的线粒体分裂或出芽而来的,线粒体的生长是与细胞发育过程同步。
6. 癌细胞生长旺盛,因而糙面内质网特别发达。
()答案:错误解析:糙面内质网的典型功能是合成分泌性的蛋白质和多种膜蛋白,在分泌蛋白质血清和分泌抗体的浆细胞中,糙面内质网非常比较发达,而在旺盛一些未分化的细胞与肿瘤细胞中则尤为稀少。
7. N连接的糖基化通常比O连接的糖基化修饰所产生的糖链的最终长度要长。
()答案:正确解析:N连接的糖基化产生的糖链条至少有5个糖残基,而O连接的糖基化产生的糖链一般为1~4个残基(AB0血型抗原的糖基侧链除外)。
2、名词解释(40分,每题5分)1. 泛素蛋白酶体途径(ubiquitinproteasome pathway)答案:泛素蛋白酶体途径是细胞内降解短寿命蛋白质的重要途径,与细胞多种生理功能调节密切相关。
江苏省徐州市教育学院附属中学2022-2023学年高一生物联考试题含解析一、选择题(本题共40小题,每小题1.5分。
在每小题给出的四个选项中,只有一项是符合题目要求的。
)1. 下列关于种群密度调查的叙述,不合理的是A.不宜选择蔓生或丛生的单子叶植物作为调查对象B.不宜用样方法调查活动能力强的动物的种群密度C.不宜用标志重捕法调查活动能力强个体较大动物的种群密度D.取样的关键是要做到随机取样参考答案:C2. 下列关于组成细胞的化合物的叙述,正确的是 ( )A.核酸、脂肪含有C、H、O、N等元素 B.磷脂是动植物细胞必不可少的脂质C.植物细胞中主要的二糖是乳糖和麦芽糖 D.蔗糖水解只能得到葡萄糖参考答案:B3. 将一个被15N标记的DNA分子放入到未被标记的培养液中培养,让其连续复制2次,则子代DNA分子中含有15N标记的DNA分子数是 ( )A. 0B. 2C. 4D. 6参考答案:B试题分析:将一个被15N标记的DNA分子放入到未被标记的培养液中培养,连续复制2次后,共得到4个DNA分子,由于DNA分子复制方式是半保留复制,故有两个子代DNA分子含有母链,故B正确。
考点:本题考查DNA分子的复制,意在考查考生理解所学知识的要点,把握知识间的内在联系的能力。
4. 当植物由代谢旺盛的生长期转入休眠期时,体内结合水与自由水的比值通常会()A.升高 B.下降 C.无变化 D.产生波动参考答案:A5. 美国科学家日前在实验室里培育出一种类似于细菌的“人造细胞”。
这种简单的“细胞”并不是真正的生命体,不能分裂和进化,但能连续数日生成蛋白质。
蛋白质是构成人体所有细胞的基本物质,人体中最重要的活性物质如酶、激素、抗体等也都是由蛋白质组成。
下列关于蛋白质的叙述中,不正确的是()A.每种蛋白质都由20种氨基酸组成B.蛋白质是肽链以一定方式形成具有复杂空间结构的高分子化合物C.绝大多数的酶和一些激素是蛋白质D.有些蛋白质可以具有多种功能参考答案:A6. 已知A与a、B与b、C与c 3对等位基因自由组合,基因型分别为AaBbCc、AabbCc的两个体进行杂交。
细胞生物学考试复习1、放射自显影技术(autoradiography): 标本经放射性标记,感光材料原位暴光,可以确定放射性标记物在细胞内的定位。
用于凝胶或琼脂平板时,能鉴定出放射性的条带或菌落。
2、动粒(kinetochore): 是指在主缢痕处两条染色单体的外侧表层部位的特殊结构。
是纺锤丝微管的连接处,化学本质是蛋白质。
3、着丝粒(centromere): 是在主缢痕处两条染色单体相连处的中心部位,即主缢痕的内部结构,化学本质是一段DNA序列。
着丝粒的位置是鉴别染色体类型的一个重要标志。
4、核型(karyotype): 是指体细胞中在形态、结构和遗传功能彼此不同而互相协调的全套染色体数,也称染色体组型。
根据染色体的相对大小、着丝粒的位置、臂的长短、有无随体等特征,可把生物体细胞中全套染色体按一定顺序分组排列。
染色体组数,每组染色体的数目多少,均随生物种而异。
正常人的46条染色体可分为A~G等7个组,因此,正常人的核型可表示为46,XX(XY)。
5、多线染色体(polytene chromosome) :6、微管组织中心(microtubule organizing center,MTOC):7、周期蛋白(cyclin ): 在整个真核生物的细胞周期中,浓度随细胞周期的变化而时升时降的几个相关的蛋白质。
细胞周期蛋白与依赖于细胞周期蛋白的激酶之间形成复合物,从而激活并决定了这些酶的底物特异性。
8、限制点(restriction point): 限制点是哺乳动物细胞周期G1期控制进入S期的调节点,相当于酵母的START点。
监测细胞的大小及营养状态等,包括生长因子,满足条件则可通过细胞周期限制点,完成余下的细胞周期过程。
9、促后期复合物(anaphase-promoting complex, APC): APC即遍在蛋白连接酶(ubiquitin ligase,E3)复合物。
E3通常是一种复合体,由多亚基组成。
一、名词解释绪论1、细胞生物学:是研究细胞基本生命活动规律的科学,是在显微、亚显微和分子水平上,以研究细胞结构与功能,细胞增殖、分化、衰老与凋亡,细胞信号传递,真核细胞基因表达与调控,细胞起源与进化等为主要内容的一门学科。
第二章细胞的统一性与多样性1、病毒(virus):迄今发现的最小的、最简单的专性活细胞内寄生的非胞生物体,是仅由一种核酸(DNA或RNA)和蛋白质构成的核酸蛋白质复合体。
2、原核细胞:没有由膜围成的明确的细胞核、体积小、结构简单、进化地位原始的细胞。
3、真核细胞:细胞核具有核被膜,细胞质中含有一些膜性细胞器的细胞。
第三章细胞生物学研究方法1.免疫荧光技术;将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
,它包括直接和间接免疫荧光技术两种。
2.流式细胞技术;是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。
3.原代细胞;是指从机体取出后立即培养的细胞。
4.蛋白质组:指由一个基因组(genOME),或一个细胞、组织表达的所有蛋白质第四章细胞质膜1.细胞质膜:是指围绕在细胞最外层,由脂质、蛋白质、和糖类组成的生物膜。
2、脂质体:是根据磷脂分子可在水相中形成稳定的脂双层膜的而制备的人工膜。
3.膜骨架:细胞质膜下与膜蛋白相连的、由纤维蛋白组成的网架结构,它参与细胞质膜形状的维持,协助质膜完成多种生理功能。
第五章物质的跨膜运输1、主动运输:物质逆浓度梯度或电化学梯度,由低浓度向高浓度一侧进行跨膜转运的方式,需要细胞提供能量,需要载体蛋白的参与。
2、被动运输:物质通过自由扩散或促进扩散,顺浓度梯度从高浓度向低浓度运输,运输动力来自运输物质的浓度梯度,不需要细胞提供能量。
16、胞吞作用:细胞摄取大分子和颗粒性物质时,细胞膜向内凹陷形成囊泡,将物质裹进并输入细胞的过程。
17、胞吐作用:细胞排出大分子和颗粒性物质时,通过形成囊泡从细胞内部移至细胞表面,囊泡的膜与质膜融合,将物质排出细胞外的过程。
全国通用2023高中生物第1章走近细胞基础知识点归纳总结单选题1、新冠病毒主要由蛋白质和核酸组成(如图所示),它必须在宿主活细胞内才能完成增殖和代谢等生命活动。
人感染新冠病毒后会出现发热、咳嗽、气促和呼吸困难等症状,严重时可导致肺炎,甚至死亡。
下列有关该病毒的叙述,正确的是()A.新冠病毒中的蛋白质可在病毒内合成B.新冠病毒没有细胞结构,它的生命活动与细胞无关C.新冠病毒必须寄生在宿主活细胞中才能生存,这说明病毒的生命活动离不开细胞D.为研究新冠病毒的致病机理,可用含有各种营养物质的普通培养基大量培养该病毒答案:C分析:病毒不能独立生存,必须寄生于活细胞。
病毒只有一种核酸,DNA或RNA,新冠病毒属于RNA病毒。
A、新冠病毒不能独立表现生命特征,其蛋白质合成必须在宿主细胞内进行,A错误;BC、新冠病毒没有细胞结构,不能独立完成各项生命活动,必须寄生在宿主活细胞中,依靠宿主细胞提供的物质完成增殖和代谢等生命活动,B错误、C正确;D、培养新冠病毒不能用普通的培养基,应用含有宿主活细胞的培养基,D错误。
故选C。
2、下列关于细胞学说建立过程的叙述,错误的是()A.科学家维萨里和比夏分别揭示了人体在器官和组织水平的结构B.列文虎克用显微镜观察木栓组织,把显微镜下观察到的“小室”命名为细胞C.德国的植物学家施莱登和动物学家施旺共同创建了细胞学说D.魏尔肖提出细胞通过分裂产生新细胞,丰富和完善了细胞学说分析:细胞学说:细胞是一个有机体,一切动植物都是由细胞发育而来的,并由细胞和细胞产物所构成;细胞是一个性对独立的单位,既有它自己的生命,又对与其他细胞共同组成的整体的生命起作用;新细胞可以从老细胞中产生。
A、科学家维萨里和比夏,分别揭示了人体在器官和组织水平的结构,A正确;B、英国的罗伯特•虎克发现并命名细胞,B错误;C、施莱登提出细胞是构成植物体的基本单位,施旺提出细胞是构成动物体的基本单位,共同创建了细胞学说,C正确;D、魏尔肖提出细胞通过分裂产生新细胞,丰富和完善了细胞学说,D正确。
第3 章综合测试答案解析1.【答案】B【解析】原核细胞中没有核仁,但是有核糖体,A 错误;核糖体、细胞核、细胞质基质中都含有RNA,B 正确;线粒体、叶绿体中都含有DNA,而内质网中不含DNA,C 错误;植物细胞间通过胞间连丝交流信息,而植物细胞的细胞质与细胞核通过核孔实现信息交流,D 错误。
2.【答案】B【解析】细胞癌变后其膜上的成分会发生变化,甲胎蛋白即为癌变后形成的一种异常蛋白质,可作为临床检测癌症的一种标志物,故选B。
3.【答案】C【解析】叶绿体是进行光合作用的场所,能合成糖类等有机物,A 错误;在有丝分裂的前期,中心体发出星射线形成纺锤体,B 错误;绝大多数酶的化学本质是蛋白质,在核糖体中合成,在内质网初步加工,进入高尔基体进一步加工,整个过程需要线粒体提供能量,C 正确;溶酶体内含有多种水解酶,能够分解病毒、病菌以及衰老、损伤的细胞器,D 错误。
4.【答案】C【解析】观察线粒体应用健那绿染液;将其染成蓝绿色,再用显微镜观察,C 错误。
5.【答案】D【解析】细胞膜上受体的本质是糖蛋白,A 正确;图乙表示的信息交流方式是细胞直接接触,精子和卵细胞的识别就属于此种方式,B 正确;胰岛B 细胞产生的胰岛素通过血液循环到达肝脏和肌肉等处,靶细胞上的受体与胰岛素结合,从而实现信息交流,C 正确;细胞间的信息交流除图示的两种途径外,还可以通过细胞间的通道进行,如高等植物细胞通过胞间连丝交流信息,不需要受体,D 错误。
6.【答案】A【解析】细胞膜、核膜以及各种细胞器膜在组成成分和结构上很相似,在结构和功能上紧密联系,共同构成了细胞的生物膜系统,所以核膜属于生物膜系统,A 正确;染色体是遗传物质DNA 的载体,不是RNA 的载体,B 错误;核仁与某种RNA 的合成以及核糖体的形成有关,而蛋白质的合成场所是核糖体,C 错误;核孔有利于RNA 从细胞核进入细胞质,但DNA 不能运出细胞核,D 错误。
7.【答案】A【解析】肽链是在核糖体上合成、在内质网中进行加工的,高尔基体对其进行进一步加工形成功能蛋白,故A 正确。
在活细胞线粒体内经空间限制性酶标记的蛋白质组学图谱显微镜和质谱是两种互补的技术:前者在活细胞内提供时间与空间上的信息,但是这种技术在某一时间只能观察到极少数的重组蛋白。
然而,后者能探测到成千上万的内源性蛋白,不过这种技术仅仅用于被溶解的细胞样品中。
在这,我们将介绍一种技术。
这种技术结合了上述两种技术的优势,为活细胞内的内源性蛋白的蛋白质图谱提供了空间与时间上的解决方案。
我们的方法依赖于基因定位的过氧化物酶,这些酶与邻近的蛋白质进行生物素化,随后被纯化和质谱鉴定。
我们用这种方法识别了人类线粒体基质中495种蛋白,包括31种以前认为与线粒体无关的蛋白质。
这种标记方法很特殊,而且能够很好地辨别位于线粒体基质、线粒体膜间腔及线粒体内膜上的内膜蛋白。
一些蛋白以前被认为存在于线粒体膜间腔或者线粒体外膜上,包括原卟啉原氧化酶,经过我们的蛋白质组学数据分析,它被重新认定存在于线粒体基质中,并且得到了电子显微镜证实。
在活细胞中的过氧化物酶介导的蛋白质图谱的特异性,与它的容易使用性相互结合,为生物学家认识活细胞的分子组成提供了强有力的工具。
为了避免蛋白质组学在传统质谱技术中存在细胞器纯化相关的一系列材料损耗及一定限制的特殊性,我们寻求发展一种新方法。
我们的方法包括标记连接像生物素这样的化学手柄的蛋白质,同时细胞仍活着,全部的膜、复合体及其空间关系都未被破坏。
因此,在活细胞内,我们需要有一个基因定位的标记酶,这个酶能共价标记它的相邻物,且此酶与蛋白质距离不远。
一种候选酶是混杂的生物素连接酶,但这种酶的标记速度极其缓慢(需要24小时)。
通过一种半衰期只有几分钟的生物素-腺苷酸酯,可以使这种被提出的机制得以继续,但生物素-腺苷酸酯标记半径很大。
另一种可能的候选酶是催化氮烯产生的辣根过氧化物酶,但是我们无法检测到这种标记,而且在哺乳动物的胞质溶胶中,辣根过氧化物酶无活性。
最近,我们产生了一种工程抗坏血酸过氧化物酶,让它作为电子显微镜的一种遗传标记。
不像辣根过氧化物酶,工程抗坏血酸过氧化物酶在所有活细胞内都是有活性的。
另外,工程抗坏血酸过氧化物酶不仅能催化用于电子显微镜对照的显色底物二氨基联苯胺的过氧化氢-依赖性聚合物,而且能氧化众多苯酚衍生物,从而产生苯酚氧自由基。
这种自由基的寿命十分短暂(<1毫秒),它们的标记半径很小(<20纳米),而且它们能和酪氨酸、色氨酸、组氨酸及半胱氨酸等富电子氨基酸进行共价反应,这种化学反应构成了酪胺信号放大效应的基础,但它还并没在活细胞中得以应用。
为了检验工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX)能否用于蛋白质组学的标记中,我们把工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX)靶定于人类胚胎肾细胞(HEK)的线粒体基质中,在细胞培养基中通过加入生物素-苯酚和1毫摩尔的过氧化氢开始标记,最终通过细胞固定或裂解一分钟后结束标记。
通过共聚焦显微镜成像或者随机光学重组显微镜观察,我们发现生物素化的蛋白质与线粒体- APEX复合结构之间存在紧紧的重叠部分。
对细胞裂解物进行链霉素亲和酶印迹分析,表明许多内源性蛋白以APEX-和过氧化氢-依赖性的方式进行生物素化结合。
为了测试这种方法的一般性,我们也分析了在不同细胞区域内进行靶定工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX)的其他构建复合体结构。
在链霉素亲和酶印迹分析中,面向细胞质的7种不同的工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX)融合体存在独特的“指纹”,这表明工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX)仅仅和一小部分胞质蛋白进行了生物素化,可能这些工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX)就在那些胞质蛋白附近。
为了对工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX)的这种小分子特性进行特征性分析,我们进行了另外的苯酚氧自由基的膜透性实验,以及这些共价结合物与氨基酸在体外形成反应实验(请参照补充材料和方法)图一:在活细胞内标记线粒体基质蛋白质组。
A:标记计划。
将工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX)通过融合作用,连接到一个24-氨基酸的目标肽上,从而靶定于线粒体基质中。
在活细胞内,通过加入生物素化的苯酚和过氧化氢的,开始标记一分钟。
随后进行细胞裂解。
生物素化的蛋白质通过与被链霉亲和素包裹的珠子回收,洗脱,在凝胶上分离,并由质谱鉴定。
过氧化物酶生成的苯酚氧自由基的寿命很短,而且不能透过膜。
因此,它只能与相邻物质进行共价结合,而不能与有一定距离的内源性蛋白结合。
B,生物素。
B:(B)按照(A)过程,在标记人类胚胎肾细胞表达线粒体-工程抗坏血酸过氧化物酶(mito-APEX)后,生物素化的蛋白(进行中性亲和素染色)进行共焦荧光成像。
我们通过有目的的性地去除生物素-苯酚或过氧化氢对实验进行控制。
DIC,微分干涉对比。
C:(C)按照(B)过程,超分辨率(STORM)成像系统显示:链霉亲和素和工程抗坏血酸过氧化物酶(AF405/AF647)被定位在U2OS细胞的22纳米分辨率的位置上。
样品在(B)中被反应出来。
D:生物素化标记线粒体基质蛋白的凝胶电泳分析的前(泳道1-3)和后(泳道4-6)链霉素亲和珠的富集。
样品在(B)中被标记。
生物素-苯酚和过氧化氢是酶作用物。
哺乳动物细胞有4个内源性生物素化的蛋白,其中通过链霉亲和素电泳后,3个蛋白在阴性泳道(2和3)中被观察到。
E:电子显微镜下的人类胚胎肾细胞表达线粒体-工程抗坏血酸过氧化物酶(mito-APEX)。
过氧化氢和二氨基联苯胺的固定细胞作为电子显微镜的对照组。
工程抗坏血酸过氧化物酶(APEX)能催化二氨基联苯胺的聚合物变成一个特定的产物,随后用电子致密的OsO4进行染色。
在线粒体基质中,明暗对比明显,此物质并非存在于线粒体膜间隙。
•生物素连接酶:能活化生物素形成生物素酰-5’-腺苷酸,将生物素特异地转移到生物素受体蛋白(如AviTag融合蛋白)上,使蛋白生物素化。
•二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物,反应产物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被广泛地用于蛋白印迹(Western Blot,WB)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 、免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)、斑点印迹(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等的染色和显色反应。
•酪胺信号放大技术(tyramide signal amplification,TSA)是上世纪90年代在传统酶促放大理论基础上发展起来一种新的信号放大技术。
其基本原理如下:在过氧化氢存在时,一些酶如辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶等可以催化一种酪胺的底物为一种非常活跃的短寿命中间体;在短时间内,中间体可以共价结合到周围蛋白的富电子表面形成酪胺化复合物,大量富集成以酶为中心的类似“岛”或者“树”状的聚集团(如图);可以在酪胺上标记荧光或者其它标记物如生物素用于检测。
•酪胺信号放大技术不是检测技术,只是放大系统,它可以提高ELISA、IHC和ISH等的灵敏度10-100倍。
另外,TSA作为扩大信号其理论本身不会增加非特异性信号,而不是像原位PCR那样扩增检测目标,所以不会造成检测偏差和假阳性。
•但是,若靶标本底生物素水平较高或者抗体交叉反应比较高,同样实验背景会成倍地放大。
TSA导致新问题需要采用产生更低背景的实验材料或方法,来降低检测技术的非特异性背景,为TSA放大系统提供足够的空间。
如在分子杂交中使用DNP标记的TSA Plus,由于DNP是生物体内罕见的分子,检测背景很低,性噪比就高。
•TSA应用范围广泛,ELISA, 免疫组化(IHC),原位杂交(ISH),芯片检测和其它任何使用HRP或AP的检测方法中都可以应用,它的放大效应可以使ELISA双抗体夹心法检测样品浓度从皮克级(10-12)别提高到飞克级别(10-15)。
•TSA应用在传统ELISA上开发出超敏ELISA,这使检测人体内飞克级别的细胞因子成为可能,有利地促进科学深入研究人体内微量蛋白的作用。
超敏ELISA还可以间接节省客户研究所用的宝贵样品,客户在有限的样本中检测更多蛋白指标。
•辣根过氧化物酶链酶亲和素结合物可以用于生物素标记的抗体、核酸、蛋白或其它生物素标记分子的检测。
具体用途包括Western blot、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学、斑点杂交、化学发光检测等。
HRP StreptavidinConjugate用高纯度的链酶亲和素和超纯的辣根过氧化物酶交联而成,确保产生最低的本底和最高的灵敏度。
链酶亲和素Streptavidin的分子量为60kD,可以高度特异性地和生物素结合。
链酶亲和素是一个4聚体蛋白,可以同时结合4个生物素分子。
链霉亲和素,从Streptomyces adidinii 中纯化获得,和鸡蛋清来源的Avidin(亲和素)在空间结构以及与生物素的亲和力方面具有高度的相似性。
和Avidin不同的是,Streptavidin是一种非糖基化蛋白,并且基本不带电荷。
Avidin的pI=~10.5,在中性PH条件下呈碱性。
由于Streptavidin和Avidin相比在中性条件下不带电荷,因此Streptavidin的非特异性结合比Avidin低很多,这样检测时的非特异性背景就低很多。
因此目前在生物素检测时通常使用Streptavidin替代Avidin。
辣根过氧化物酶即horseradish peroxidase(HRP),可以在Western、EMSA、Southern或Northern等检测时催化ECL类试剂(如ECL、BeyoECL等)产生化学发光,可以在ELISA时催化TMB产生蓝色,也可以在免疫组化、免疫细胞化学或Western blot检测时催化DAB产生棕色沉淀。