分子克隆常用工具酶

代完全相同的子代群体。
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第一节 基因工程技术路线
载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。
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第一节 基因工程技术路线
基因重组技术的两个基本目的：
1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。
2）可移动质粒（mobiliableplasmid）可以被传递，但不能使细菌接合。 3)自传递质粒（selftran missible plasmid）兼具1）2）两种功能因而可以自
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第三节 分子克隆常用的载体
质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看 是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要 基石。
2）实践意义 是基因工程的重要载体（vector），能把外源基因（目的基 因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
医学分子生物学基础
分 子 克 隆
南京农业大学 动物医学院基础兽医系动物生化教研室
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第五章 分子克隆
重组DNA技术（recombinant DNA technology）
是按照人的意愿、在体外对DNA分进行重组，再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖， 以获得该DNA分子的大量拷贝。
克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲
切平由核酸内切酶产的的3`粘性末端 DNA片段的同位素末端标记
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第二节 分子克隆常用的工具酶
反转录酶 reverse transcriptase
1. 以RNA为模板，聚合形成cDNA链。 2. 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链

1970年 美国约翰· 霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现
流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 无细胞提取液可降解E.coli DNA
但不能降解自身DNA
即HindII酶
5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’
2006-02-21
Other Kinds of Enzymes: Homing Endonucleases Nicking Enzymes Control Proteins Specificity Subunits 74 33 36 78
Distinct Specificities: prototypes Type I REs 34 Type II REs 259 Type III REs 5 Homing Endos 58 Type II Methylases 189 Orphan Methylases 23 Type IV 0 total 68 3692 10 74 625 109 3
Restriction Enzymes
Type I Type II Type III Methyl-Directed 49 3470 10 4
3529
/
2003
Enzymes:
Restriction Enzymes 3601 Type I 51 Type II 3540 Type III 10 Methyl-Directed 4 Weirdo REs 1 Putative REs 631
Methylases 696 Type I 45 Type II 550 Type III 12 Orphan Methylases 89 Weirdo Methylases 0 Putative Methylases 900

酶反应条件的影响
一般酶的反应条件： 温度：37℃ PH：7.2 DNA酶切反应
（控制反应时间）
时间：2小时
完全消化
部分消化
1/14/2019
苏州科技学院生物系
叶亚新
影响限制酶消化DNA的若干因素
双酶消化
反应条件相同：同时加到反应管，同时反应 对温度要求不同：先低温消化，再高温消化 对盐浓度要求不同：先低盐酶消化，再高盐酶 消化
1/14/2019 苏州科技学院生物系 叶亚新
四．限制酶的特点
３）对称性—双对称 EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’ ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 ５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ 2. 末端种类 １）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’ 3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’ ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-GOH PAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAAP HOG-5’
1/14/2019
苏州科技学院生物系
叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的特 异性可能发生变化，结果一种限制酶酶 切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC----AATT
1/14/2019 苏州科技学院生物系 叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGG N’ N’N’N’N’ CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起 ２）富含ＧＣ

W=A or T S=C or G
6：EcoRI HindIII
G AATTC A AGCTT
>6 Not I
GC GGCCGC 8
BbvCI CC TCAGC
7
PpuMI RG GWCCY 7
2.结构 ① 回文对称（旋转镜像对称） DNA两条链的对称位置。
切割位点在
EcoRI
GAATTC CTTAAG
化酶
酶
分子不在一起
4-6bp, 大多数 5-7bp 非对称 为回文对称结 构
在识别位点中 在识别位点下 或靠近识别位 游 24-26bp 点
分开的反应 同时竞争
限制作用是否 Yes
No
Yes
需用 ATP
类型II(type II)占93%
识别回文序列(palindromic sequence),
在回文序列内部或附近切割,产生带3’-OH和
•全部辅音按字母读,如pstⅠ
限制性酶和修饰酶的数量
早前上是限制性酶加R，是修饰酶加M,且菌株 号和序号小写 1968年 下半年 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌
3000种酶 200多特异性 到2006年2月为止,共发现3773种限制酶,810种 甲基化酶
到2011年？（查）
三、限制性核酸内切酶的类型
5’-P基团的DNA产物 需Mg2+,相应的修饰酶只
需SAM。
• EcoRI
GAATTC CTTAAG
识别序列(recongnition sequence)主 要为4-6bp,或更长且呈二重对称的特殊序 列。
但有少数酶识别更长的序列或简并序 列(degenerate sequence),切割位置因酶 而异,有些是隔开的。