生物制品生产中支原体污染的检测和预防

２０１２年第１期（总第１８０　卫生　
生物制品生产中支原体污染的检测和预防　
李小静练炳洲　邓月嫦王凤国　梁榕丽　
（广东大华农动物保健品股份有限公司　广东新兴５２７４００）　

中图分类号：￥８５９．８４　文献标识码：Ｃ　文章编号：１００７．１７３３（２０１２）０１—００５５—０２　
支原体是生物制品中常见的一种污染微生物，工作环　
境、操作者本身、培养基、污染支原体的细胞、试验器　材和用来制备细胞的原始组织或器官都可能给生产带来　支原体的污染。生物制品一旦污染支原体，会引起质量　下降，免疫效果得不到保证，严重时可造成人力、物　力、财力上的巨大损失，因此在生物制品生产中，需严　格保持无菌操作，建立快速有效的检测方法，有效防止　支原体的污染。　１支原体的特点　支原体是最小能够自我复制的原核生物，其大小介　于细菌和病毒之间，结构简单，无细胞壁，形态多样，　可通过细菌滤器。多数支原体适合在偏碱环境中生存，　对酸性环境承受力差，对热敏感，对一般抗生素不敏　感。多数支原体污染比较隐蔽，一般肉眼很难辨识，显　微镜下观察，可见单个荷包样菌落。　２支原体检测的方法　目前，支原体的检测方法很多，常用主要有分离培　养法、ＤＮＡ荧光染色法、电镜法、血清学方法以及核酸　探针法，但在实际生产中受到诸多条件的限制，不可能　全部应用于生产。培养法和ＰＣＲ扩增法２种支原体的检测　方法，基本适用于所有的生物制品企业，且都比较容易　操作。（１）培养法是目前国内外最常用的支原体检测方　法，也是Ｅｔ前最直接的检测方法，通过将样品接种到支原　体培养基上观察液体培养基的颜色变化和固体培养基上是　否长有支原体菌落来判断试验结果，准确率高，一般支原　体都能检出，但此种方法培养时间长，需２９ｄ才能出最终结　果。一般用于对种毒和成品的检测。（２）ＰＣＲ方法是一种　模拟体ＤＮＡ复制的体外扩增方法。由于支原体菌体小，　对营养要求高，生长缓慢，用培养法检测一些原辅材料有　一定的局限性，而ＰＣＲ方法刚好弥补了这些不足，相对于　培养法它快速、敏感、方便。主要用于对原辅材料（牛奶、　蔗糖、细胞、培养基）和半成品的支原体检验。　２．１培养法　１．１．１　试验材料支原体检验培养基（根据样品选择不同　的培养基），１００ｍｌ玻璃瓶，培养皿，小试管（１．０×１０ｃｍ）　
１．１．２试验方法　（１）培养基的制备：①固体培养基的　
制各：固体平皿培养基是由固体培养基和辅液两部分组　
成。使用前将固体培养基加热至完全溶解，液体培养基　
置３７￣Ｃ水浴溶解，待固体培养基温度降到６０℃左右时将　
辅液（６０ｍｌ固体培养基＋１３ｍｌ辅液）沿瓶壁加入，边加边摇　
动，动作要轻，避免产生气泡，待二者混合均匀后按平　
皿规格加入适量培养基制成固体平皿培养基。②液体培　
养基的制备：将液体培养基无菌分装到１００ｍｌ玻璃瓶，　
２０ｍｌ／瓶，分装到小试管，１．８ｍｌ／管。（２）培养基灵敏度　
试验：所有用于支原体检测的培养基必须进行灵敏度试　
验，无论是外购培养基或是自制培养基。改￣Ｆｒｅｙ氏培养　
基以滑液支原体ＣＶＣＣ２９６０株为质控菌株，非禽源支原体　
培养基以猪鼻支原体ＣＶＣＣ３６１株为质控菌株。将质控菌　
作１０倍系列稀释至ｌ０００，接种到液体和固体培养基，置　
３７＂Ｃ培养９６ｈ，液体培养基灵敏度达到１０９ｃｃｕ／ｍｌ以上为合　
格，固体培养基灵敏度达到１０ｂｃｃｕ／讪以上为合格。　
１．１．３试验步骤　（１）样品检验：病毒性活疫苗取样　
３—５瓶，如冻干制品则用液体培养基恢复到原量，混合后　
取５ｍｌ接种到小瓶培养基，再从小瓶中取混悬液０．６ｍ１分　
别移植到２支小管、２个固体平皿培养基。小瓶、小管培　
养物放置３７＂Ｃ培养，平皿培养物放含５％ＣＯ２、３７￣Ｃ培养　
箱培养。每日观察培养物颜色有无变黄或变红的变化。　
５、１０、１５ｄ分别从小瓶中取０．６ｍｌ培养物分别移植到２支小　
管、２个平板培养基。每次移植的小管和平皿需培养观察　
１４ｄ，在观察期内发现小瓶或任何１支小管颜色有变化，　
立即移植到小管和固体培养基，观察液体培养基是否出　
现恒定的ｐＨ变化及固体培养基上有无菌落出现。（２）对　
照：每次移植培养的同时设阴阳性对照。　
１，１．４试验结果　阴性对照无支原体生长，阳性对照液　
体培养基变黄，固体培养基有支原体菌落生长，则检验　
结果有效。固体培养基无菌落生长，则判定样品无支原　

５５　
山东畜牧兽医　２０１２年第３３卷　
体污染。　
２．２　ＰＣＲ方法　
２．２．１　试验材料ＲＮＡ／ＤＮＡ抽提试剂盒，支原体ＰＣＲ试　
剂盒　
２．２．２试验方法　（１）病毒模板ＲＮＡ／ＤＮＡ抽提：取样　
品２００ｇｌ按抽提试剂盒说明书进行操作，同时设立阴阳性　对照，注意防止样品之间的交叉污染和样品与阳性对照　的污染。　（２）ＰＣＲ扩增：每份总体积２ＯｕＩ，取１６ｇｌ　ＰＣＲ　反应液（用前混匀），２ｇｌ　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，２ｇｌ模板ＤＮＡ，　在ＰＣＲ仪上按以下程序进行扩增：９４￣Ｃ３ｍｉｎ，９４￣Ｃ３０ｓ，　５０　Ｃ３０ｓ，７２。Ｃ４５ｓ，３５循环，７２￣Ｃ延伸１０ｒａｉｎ。（３）电　泳：称１ｇ琼脂糖于１００ｍ１５０倍稀释的ＴＡＥ电泳液中，微波　炉中完全溶解后，加入８ｇｌ染色液混匀，在电泳槽内倒入　琼脂糖凝胶，待凝固后取５ｇｌ的ＰＣＲ扩增产物与ｌｐｌ上样缓　冲液混合点样于琼脂糖凝胶孔中，并以ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２　０００作为参照，以１００Ｖ电压电泳２０ｍｉｎ后紫外凝胶成像仪　拍照。　（４）试验结果：阳性对照出现２６７ｂｐ的目的条　带，阴性对照出现１９１ｂｐ的内控条带。被检样品也出现　１９１ｂｐ的内控条带，则表明样品无支原体污染。　３支原体污染的预防　支原体污染源可能存在于生产的各个细节：工作环　境、操作者、培养基甚至细胞的交叉污染。这就要求生　产及检验过程中严格遵循生物制品生产及检验规范，从　自身做起，养成良好的工作习惯。　３．１原材料控制　鸡胚、细胞以及生产用血清等是生物制品的重要生　产原材料，自从Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｌ　Ｂ等首次报道细胞培养中的支　原体污染以来，国内外关于支原体污染细胞和疫苗等生　物制品的报道屡见不鲜。有研究表明约２０多种支原体容　易污染鸡胚、细胞或血清，有的甚至出现多种支原体同　时污染同一样品的现象。因此生产前保持细胞或鸡胚的　纯净以及对鸡胚或细胞生产前的检验，在整个疫苗生产　过程中尤为重要。　首先，保持细胞或鸡胚的纯净性。建立无支原体污　染的ＳＰＦ鸡群是杜绝鸡胚污染支原体最直接有效的方法。　从ＳＰＦ种鸡群入手，建立完善的种鸡、鸡胚支原体检验体　系，有效保证生产用鸡胚的纯净性；在细胞培养方面，　良好的个人卫生及操作规范是避免支原体污染的基础条　件，在保证基础的同时从制度上建立完善的检验体系，　从原代细胞开始，对每个代次的细胞都进行严格的支原　５６　体检验，保证任何代次的细胞都无支原体污染的潜在威　胁，保证细胞系的纯净。其次，血清及培养液等是病毒　培养过程中重要的营养液，同时也是支原体赖以生存的　营养物质；血清和培养液本身的成分及来源都非常复　杂，从源头控制支原体对血清和培养液的污染难度非常　大。这就要求要针对血清及各种培养液的特性进行严格　
的灭菌处理，在保证无菌的同时，使用前加强对血清及　
培养液的检验就成为阻止支原体污染的唯一屏障。　
３．２生产及检验环节控制　
ＧＭＰ和ＩＳＯ是一种制度，一种规范。要实现对环境的　
控制，有效杜绝支原体的污染仅靠规范是远远不够的，　
还需要工作人员的自律性及责任心。养成良好的工作习　
惯，严格执行各种规章制度，是避免生产及检验过程中　
支原体污染根基。一旦没有自律性和责任心，任何规章　
制度都无法实现其价值。　
首先，整体生产环境消毒：车间内部进行定期的清　
洁，使用３％新洁尔灭定期整体环境消毒，严格保证生产　
环境的无菌。同时细化生产流程中原材料、半成品以及　
成品的运送及传输路线，严格杜绝原材料、半成品和成　
品之间可能出现的交叉污染；同时严格区分人员和物品　
的流通通道，做到人、物的分开流通，杜绝交叉污染。　
其次，生产设备和器械的消毒。所有的生产设备和器械　
必须保证无菌。在每次生产前要对所有的操作平台和生　
产设备进行彻底的灭菌消毒。其中操作平台要照射紫外　
线０．５ｈ以上。所有的生产用具要根据其特性进行相应的高　
压灭菌或消毒水浸泡消毒，以确保消毒的彻底。　
３．３严格生产操作　
强化个人卫生，进入洁净区域必须进行冲凉和更换　
无菌工作服，做到洁净区的生产人员无裸露皮肤暴露在　
生产环境中。同时在生物制品生产过程中，所有的操作　
必需规范，杜绝任何小的操作细节，例如操作过程中手　
离开操作台、进入操作台的器械或器皿没有进行消毒、　
用手擦汗或接触到裸露的皮肤可能导致的支原体污染。　
４总结　
支原体是一类重要的病原微生物，对人类、猪、　
牛、禽以及实验动物等都有致病性。生物制品一旦被支　
原体污染，就会导致品质下降。由于支原体的污染具有　
隐蔽性，所以加强生产环节控制和原材料的检验，是保　
证疫苗质量的基础。　
（收稿日期：２０１１－０９－４）９）