支原体污染-细胞培养技术

支原体污染及其检测支原体污染在细胞培养中最为常见，培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞蔓延和传扬，据报道目前约有11％的二倍体细胞和传代细胞存在支原体污染；支原体污染的另一重要来源是培养液中加入了被支原体污染的血清。

支原体是一种介于细菌和病毒之间的能自立生活的微生物，它无细胞壁，形态呈多形性。

最小的支原体直径约200nm，可通过滤菌器。

支原体污染后培养基普通不发生混浊，细胞形态无显然变幻，但事实上细胞已受到各方面的潜在影响，如影响DNA合成，代谢减慢，生长被抑制等。

这种污染造成的危害较大，但支原体污染不易被发觉，因此对支原体的污染必需引起足够的重视，应严加防范。

支原体污染常用的检查办法如下。

1．形态学检查常用相差显微镜检测取洁净载玻片，滴加少许待检的细胞悬液，压上盖片，用相差显微镜油镜观看。

如有支原体污染，镜下可见暗色极小颗粒，类似布朗运动，可位于细胞表面或细胞之间。

要注重支原体与细胞破裂后溢出的内容物如线粒体等相区分。

电镜检测：用普通染色办法难以确定时，可用电镜检查。

详见电子显微镜技术一节。

2．支原体染色镜检支原体经低张处理后用地衣红染色观看，本法简便易行，不仅适用于检测支原体，亦可用于检查真菌和细菌。

【材料】 (1)待检疑有支原体污染的培养物； (2）检测用试剂：低张处理液（0.45%），Carnoy固定液（配方：60ml纯加30ml和10m1）,2％的地衣红染液（配方：2g地衣红，60ml加蒸馏水至100m1 )。

【办法】 (1)取材：吸取待检培养液1 ml, 500～800r/min，离心5分钟后去上清液，余留0.2m1备用。

(2）低张处理：用新奇配制的0.45％溶液0.2m1，加入上述待检标本中，静止低张处理10分钟，然后离心去上清液，留取沉淀物0. 2m1，涂片2～3张，晾干。

(3）固定：用新配制的Carnoy液固定2次，共10分钟。

(4）染色：将晾干的涂片用2％的地衣红染5分钟。

细胞培养中的支原体污染的预防及处理Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。

支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。

自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。

与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。

支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。

一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。

细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。

国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（idlawii），为牛源性。

国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。

支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染，等等。

体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。

对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。

对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。

由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中的抗生素抗污染能力有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。

支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞手到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等。

支原体清除实验支原体污染是细胞培养过程中的常见现象。

细胞被支原体污染之后，在显微镜下无法直接观察到，生长状态可能发生或不发生改变，因此一般不易被察觉。

但是支原体会改变细胞的很多生长参数，因而极易对后续实验造成影响，所以对支原体污染的检测和清除非常重要。

以下为一次支原体检测和清除的实例。

材料：细胞系：SH-SY5Y支原体PCR检测试剂盒：Myco-P-20 (上海炎熙生物 )支原体清除剂：Myco-E-1 (上海炎熙生物 )方法与结果：1，将已检测出有支原体污染的SH-SY5Y细胞以正常传代密度铺到6孔板中，一个孔加清除剂，作为测试孔，另一孔不加清除剂，作为阴性对照孔。

两孔之间间隔一个孔，以免互相污染。

2，在清除支原体的过程中细胞以常规方法传代培养，并使细胞在培养过程中一直处于清除剂的作用下。

在加清除剂后第4、8、9、11天各取1毫升培养上清。

每份上清与细胞已共培养48小时，除第9天的上清只共培养了24小时。

3，将这些培养上清在16000g离心5分钟，小心去除离心上清，将沉淀用无菌PBS洗三次，每次以16000g离心5分钟。

最后获得的沉淀用100微升纯水重悬，在100℃水浴中孵育5分钟，然后用于PCR反应。

4，按照支原体检测试剂盒Myco-P-20的说明书进行PCR检测操作，结果如下：4.1，与对照样品共同反应，用这种方式可以判断是否出现了假阴性结果。

在加清除剂后第4天的样品中仍可见到支原体阳性条带（约440bp），在第8、9、11天的样品中，已看不到支原体阳性条带。

4.2，不加对照样品，检测样品单独反应，用这种方式可以提高测试灵敏度。

可见在第8天和第9天的样品中，支原体阳性条带仍然出现，但是弱于第4天的样品。

在第11天的样品中，有明显的200bp以下的非特异的条带，且亮度高于阳性条带，所以判断此时的PCR产物是非特异反应的产物，样品中已没有支原体DNA。

注释：由于PCR是一种非常灵敏的检测方法，所以很容易出现假阳性条带。

甲：细胞里突然出现小黑点，问君能有几多愁?乙：珍贵的细胞萎靡不振，扔了重买?相顾无言，惟有泪千行。

丙：细胞转染效率极低，实验结果遥遥无期，我的课题前功尽弃!但见泪恨湿，不知心恨谁!细胞培养中，最怕的就是生物污染，支原体污染就是其中的一种。

支原体这种微小的微生物，是细胞培养中令人头疼的大问题。

支原体结构也比较简单，多数呈球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。

支原体污染可能来自培养基、血清或实验操作者，会影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。

支原体感染不易察觉，因此对培养细胞定期进行支原体检测就非常重要。

污染实验室培养细胞的支原体主要有八种，但还没有哪种检测方法能够单枪匹马把这八种支原体都检测出来。

支原体非常顽强，通常用于细胞培养的绝大多数抗生素都对其无效。

例如青霉素主要作用于细菌细胞壁，但支原体没有细胞壁因此就不受影响。

无懈可击的细胞培养技术始终是预防支原体感染的最佳方式，另外及时找出受到支原体感染的培养物也很重要，这样才能在感染扩散前快速采取有效措施。

支原体污染在细胞培养中实际上是比较常见的，可达30%甚至更高。

支原体污染时细胞表现为长得不好，也不死亡，同时，培养基又是清亮的，时间长达一周也没有什么变化，这时基本上可以判断出是支原体污染了。

定期检测支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。

一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。

将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。

预防支原体污染的建议：细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染;严格实验操作;细胞培养基和器材要保证无菌;在细胞培养基中加入适量的抗生素。

支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有：抗生素处理抗血清处理抗生素加抗血清和补体联合处理支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等完全不敏感;对多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺药物普遍耐药。

支原体培养及药敏报告
支原体是一种革兰氏阴性细菌，是引起人类和动物呼吸道感染的主要病原体之一。

支原体感染可引起多种临床症状，包括咳嗽、咽痛、发热、头痛等，严重者可引起肺炎、支气管炎等疾病。

因此，对支原体的培养及药敏报告具有重要的临床意义。

支原体的培养是诊断支原体感染的重要手段之一。

通常采用细胞培养法或鸡胚培养法进行培养。

细胞培养法是将患者样本接种到细胞培养物中，通过观察细胞内外的支原体形态和数量来判断是否感染支原体。

鸡胚培养法则是将患者样本接种到鸡胚腔内，观察鸡胚的发育情况和病变表现，从而判断是否感染支原体。

培养的结果可以为临床医生提供重要的诊断依据，有助于制定合理的治疗方案。

除了培养外，药敏报告也是支原体感染诊断的重要内容之一。

药敏报告可以帮助临床医生选择最合适的抗生素治疗方案，提高治疗效果，减少药物滥用和耐药菌株的产生。

药敏报告通常包括对多种抗生素的敏感性测试结果，根据测试结果可以确定哪种抗生素对支原体的杀菌作用更好，从而指导临床治疗。

在进行支原体培养及药敏报告时，需要严格遵守操作规程，保证实验操作的准确性和可靠性。

同时，还需要注意对培养基、试剂和仪器的选择和使用，以确保培养和药敏测试的准确性和可靠性。

此外，对于培养和药敏测试结果的解读也需要具备专业的知识和经验，以避免误诊和漏诊的情况发生。

总之，支原体培养及药敏报告在支原体感染的诊断和治疗中具有重要的作用。

通过准确的培养和药敏测试，可以为临床医生提供重要的诊断和治疗依据，帮助患者尽快恢复健康。

因此，对支原体培养及药敏报告的研究和应用具有重要的临床意义，值得进一步深入研究和推广应用。

常见细胞污染及其处理方法麦~粒（2012级生物化学与分子生物学专业）摘要：细胞培养是生命科学实验及生物医药产业化中的一项关键技术，细胞污染问题一直是细胞培养中的大敌。

本文综述了细胞培养中污染的类型、处理方法和预防措施等，以期为实验室细胞培养中遇到的细胞污染的解决提供参考。

关键词：细胞培养，细胞污染，支原体污染细胞培养技术是现代生命科学研究中不可缺少的一项基本实验技术，同时也是细胞工程中的核心技术之一。

细胞培养的质量好坏直接关系到实验结果的可靠性与否以及产品质量的合格与否。

在细胞培养中，最基本的原则就是无菌操作，污染是细胞培养最致命的大敌，预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。

特别是对于一些珍贵的细胞株，一旦污染对实验可能就是毁灭性的。

1 污染的类型细胞污染的类型可分为物理、化学、生物三类。

其中化学、生物因素最为常见，物理因素最易被忽视。

1.1物理污染物理性污染通过影响细胞培养体系中的组分，从而影响了细胞的代谢。

最为常见的是温度和辐射（紫外线照射）。

过冷或过热的温度对细胞可引起细胞生理状态的改变，如从冰箱中取出的培养液直接加至37℃培养的细胞中可能会造成细胞应激，影响某些实验现象的观察。

在生物安全柜紫外灭菌时，应当遮蔽对紫外线敏感的试剂，同时普通操作中也要注意对见光易分解的物质进行避光处理。

对于需要使用同位素标记的某些实验，应当注意细胞、试剂周围不能放同位素。

除此之外，有时操作过程中偶尔有异物落入，极易造成污染。

一些小的颗粒状异物作为是微生物污染的载体进入培养液中造成细胞污染。

另外，实验过程中酒精棉球的棉絮、移液器枪头上的某些塑料碎屑等都有可能增加染菌的概率。

1.2化学污染细胞培养中的化学污染大多是由于实验准备或实验过程中造作不当造成的。

在实验准备阶段，细胞培养室中的器皿应做到专用，避免与常用器皿混用。

此外，细胞用器皿洗刷过程中要注意洗刷彻底，不可有洗涤剂等残留。

高压灭菌时应灭菌彻底，并在灭菌后的生物安全柜中打开使用。

支原体肺炎的病原体分离和培养方法支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae）是一种常见的致病原。

为了深入研究该病原体，科学家们开发了多种分离和培养方法。

本文将介绍一些常见的支原体肺炎病原体分离和培养方法，以供相关领域的科研人员参考。

一、支原体肺炎病原体分离方法1.直接培养法支原体肺炎病原体可以通过直接培养法从患者样本中分离出来。

一种常用的方法是通过鼻咽拭子或咳嗽痰液采集样本。

收集到的样本可以直接接种到预先准备好的培养基上，经过一段时间的培养，支原体肺炎病原体会逐渐生长并形成典型的菌落。

2.纤毛刷法纤毛刷法是一种常用的快速分离方法，适用于大规模筛查。

在该方法中，将纤毛刷插入患者的鼻腔收集样本，然后将纤毛刷放入含有蛋白消化酶的液体培养基中。

酶能够消化掉样本中的非细胞组织，并释放出被包裹在细胞内的支原体肺炎病原体。

然后，将液体培养基进行离心，离心过程中支原体肺炎病原体会沉积在离心管底部。

最后，从沉积物中取出支原体肺炎病原体进行后续培养和分析。

3.细胞培养法细胞培养法是一种通过培养细胞来分离支原体肺炎病原体的方法。

在该方法中，将患者样本接种到培养皿中的细胞培养基上，培养一段时间后，支原体肺炎病原体会侵入并感染细胞。

通过观察细胞的形态和特征，可以初步判断支原体肺炎病原体是否存在。

然后，可将感染的细胞进行收集和后续培养，以纯化和进一步研究病原体。

二、支原体肺炎病原体培养方法1.培养基的选择在进行支原体肺炎病原体的培养时，选择适宜的培养基十分重要。

通常，支原体肺炎病原体对一些特定的培养基非常敏感，如Hayflick培养基、PPLO（pleuropneumonia-like organisms）培养基等。

这些培养基中含有支原体肺炎病原体所需的营养物质和生长因子，能够提供良好的生长环境。

2.培养条件的控制支原体肺炎病原体的培养需要严格控制培养条件。

一般来说，适宜的温度是37°C，适宜的气氛是5%二氧化碳和95%空气的混合气体。

PCR检测支原体方法如下：
1、吸取待检细胞的培养液100ul，转移入无菌的1.5ml 离心管中。

请注意：待检
细胞必须换液24小时以上，否则会有假阴性结果。

2、将盛有100ul待检培养液的 1.5ml 离心管用金属浴或空气浴在95℃加热
5min。

请注意：加热过程中，要保持离心管的盖子是盖紧的。

（因为在加热时，盖子会自己崩开，可以在离心管上放置书本之类的物品压住盖子）
3、高速离心，13200rpm，1min。

4、配制PCR反应体系：
1）待检样品数量+1个阳性对照+1个阴性对照=总的样品数量。

2）阳性对照是以往确定被支原体污染的样品，阴性对照是灭菌超纯水。

3）PCR反应体系：
H2O（灭菌超纯水）13 ul
Buffer 10×（必须含Mg2+） 2 ul
dNTP 0.8 ul
Primer(+) (10uM) 0.5 ul
Primer(-)(10uM) 0.5 ul
Polymerase 0.2 ul
Sample 3 ul
4) PCR反应程序：
94℃2min
94℃30sec
55℃30sec
72℃20sec
GOTO step 2 , 36 times
72℃7min
5、配制2%的琼脂糖胶，上样量5-10ul。

6、20-30min后观察结果，阳性条带在200-300bp。

引物序列：
Primer(+)：5’GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT3’ Primer(-)：5’TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC3’。

细胞支原体污染常用支原体检测方法和试剂盒介绍（2016年10月16日）哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。

支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。

从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。

相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。

目前，细胞支原体污染常用的支原体检测方法主要有：一、培养法●原理：将待检测样品先接种到支原体液体培养基中大量繁殖，然后再转接种到支原体固体培养基中，培养一段时间后（大约一个月），如果固体培养中，出现典型的支原体菌落，则说明待测样品有支原体污染。

●优点：支原体培养法是相对可靠的支原体检测技术，也是我国药典认可的方法之一。

●缺点：（1）培养法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测；（2）通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。

这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。

而猪鼻支原体约占所有细胞支原体污染的20-50%。

●《培养法支原体检测试剂盒》》主要厂家：读者可以根据《中国药典》中收录的培养法支原体检测方法进行操作。

二、荧光染色法●原理：将待检测样品接种到专门的指示细胞（如：Vero细胞）中，培养一段时间后，用DNA荧光染料（如：Hoechst 33258，DAPI）进行染色，如果除了细胞核被染色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被荧光染料染色，那么这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。

●优点：荧光染色法也是我国药典认可的方法之一。

●缺点：（1）该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染；（2）需要用到专门的指示细胞（如：Vero细胞），如果不用指示细胞而直接对目标细胞进行荧光染色，由于每种细胞繁殖和吸附支原体的能力差异极大，检测的准确性将比用Vero等指示细胞进行检测要低得多；（3）该方法严重依赖实验人员的经验，可重复性较差。

细说细胞培养中的的支原体污染以及生长曲线测定-麒盟生物1、问：测定细胞生长曲线的意义是什么？答：细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。

因为细胞太小，无法测单个细胞的生长状态，所以测细胞群体的生长曲线。

2、问：如何选择细胞接种数？答：可根据细胞传代培养过程中接种数及细胞生长周期进行计算，细胞接种数因细胞的不同而不同。

3、细胞计数时为什么要用台盼蓝染色？答：加入台盼蓝后，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。

4、细胞生长曲线测定时为什么要做重复孔？答：测定细胞生长曲线细胞计数时选择 3 个复孔，每孔分别计三次，取其平均值，目的是减小操作误差。

5、细胞生长曲线测定周期是几天? 答：一般是一个星期。

6、为什么绘制的细胞生长曲线没有达到平台期？答：可能有以下原因：一是细胞接种密度过低；二是细胞培养时间过短；三是细胞生长状态不好，使其不能正常增殖。

更多专业知识，登陆麒盟生物网站查询。

7、为什么细胞计数第一天，细胞数没有增加反而减少?答：一般细胞传代后，会有一个生长缓慢的潜伏期，细胞不增殖，而细胞会有正常的死亡，故细胞数不增加反而减少。

8、细胞生长曲线还有其他方法绘制吗？答：当然有。

我们提到最多的是直接计数的方法，除此以外还有相对计数的方法，该类方法首先要绘制标准曲线，标定细胞数和某个变量的函数关系，然后我们只需要测定每天这个变量的值便可以计算出细胞数。

常用的是MTT、CCK8等比色的方法。

细胞培养中的的支原体污染支原体是一种大小仅为0.2~0.3卩m，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22~0.45 卩m）的原核生物。

支原体是让每个细胞培养者崩溃的家伙。

因为它极小，可以很轻松的通过滤膜，混入培养系统中，而且没有细胞壁，可以轻而易举的躲过抗生素，就这样悄无声息的杀死细胞，与细菌和真菌相比，支原体造成的污染不论在检测、预防还是去除上都更为困难。

支原体检测(DNA荧光染色法-贴壁细胞爬片法)实验原理：利用荧光试剂二苯甲酰胺(Hoechst33258),结合到细胞和支原体DNA,A-T富含区域的特点，在紫外激发束（波长为330～380nm）激发下产生黄绿色荧光的原理，利用荧光显微镜检测细胞中是否存在支原体污染。

实验基本材料准备：（1）实验仪器：荧光显微镜（莱卡激发波长330～380nm紫外光UV-2A滤光片）；（2）实验耗材：盖玻片（12×12mm）；载玻片（76×26mm）；甲醇；冰乙酸；荧光染料Hoechst33258；封片液；吸管；六孔板；细胞培养液（MEM完全培养基和五抗生素MEM培养基）；1xPBS；细胞消化液（0.25%胰蛋白酶液）（3）待检细胞：将待检细胞传1～2代，每次培养3～5d，作为待检样品（4）盖玻片准备：盖玻片处理同载玻片，擦净后干燥用无菌去离子水2～8℃保存待用。

（5）载玻片准备：玻片置于自来水中加洗涤剂煮20min，然后用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗3次，放入去离子水中2～8℃待用实验试剂试液配制：(1)固定液配制:甲醇:冰乙酸（3:1）混匀，现配现用；(2)二苯甲酰胺荧光染料(3)封片液；(4)1×PBS细胞样品制备及实验步骤（1）待检细胞处理：①将长成致密单层的细胞用0.25%的胰蛋白酶+0.05%EDTA消化，800～1000r/min离心5min，弃上清胰蛋白酶混合液，所沉淀的细胞用1×PBS洗1次，离心条件相同；用细胞生长液按实验要求稀释至 1×105/ml，加入3ml/孔至6孔板中（6孔板中事先加入盖玻片），在5%CO2，37℃孵箱中培养3～5天；（2）固定：用枪头吸出六孔板中的培养液，用1×PBS清洗六孔板5ml，吸出，加入新配制的固定液5ml，放置5min，吸出；再加新固定液到六孔板中放置10min，用枪头吸出；（3）清洗细胞：加入5ml蒸馏水至六孔板，3min，清洗三次；（4）染色：每孔加入33258荧光染料工作液2ml，室温避光放置30min。

常用的细胞培养方法、污染及污染处理一、本文概述细胞培养是生物学和医学领域中一种重要的实验技术，广泛应用于基础研究和实际应用。

通过模拟细胞在体内生长的环境，细胞在体外得以繁殖、分化并维持其特定功能。

本文旨在概述常用的细胞培养方法，包括培养基的选择、细胞传代、细胞冻存与复苏等，同时探讨细胞培养过程中可能出现的污染问题，包括细菌、真菌和支原体等微生物污染，以及污染的检测和处理方法。

通过本文的阐述，读者可以对细胞培养的基本流程和污染防控有更为全面的了解，为实验操作提供指导和参考。

二、常用的细胞培养方法细胞培养是生物学和医学研究中的核心技术，用于模拟体内环境，研究细胞生长、分化和功能。

以下是几种常用的细胞培养方法：贴壁培养法：这是最常见的细胞培养方法。

细胞在培养瓶或培养板的表面上贴壁生长，形成单层细胞。

这种方法适用于大多数哺乳动物细胞系。

悬浮培养法：某些细胞，如血液细胞、肿瘤细胞和某些干细胞，可以在液体培养基中悬浮生长。

这种方法不需要细胞贴壁，可以方便地扩大细胞数量。

微载体培养法：微载体是一种微小的、可以悬浮在培养基中的颗粒，通常用于大规模细胞培养。

细胞可以在微载体的表面上贴壁生长，从而增加细胞与培养基的接触面积，提高细胞生长效率。

三维培养法：这种方法模拟体内组织的三维结构，使用支架或凝胶等基质支持细胞生长。

它有助于研究细胞间的相互作用和组织的形成。

共培养法：将不同类型的细胞放在同一个培养环境中进行培养，以模拟体内细胞间的相互作用。

例如，将内皮细胞和肿瘤细胞共培养，可以研究肿瘤血管生成的过程。

在进行细胞培养时，需要选择适合细胞类型和实验目的的培养方法，同时严格控制培养条件，包括温度、湿度、pH值、营养成分等，以确保细胞的正常生长和繁殖。

三、细胞培养污染及其影响在细胞培养过程中，污染是一个常见且严重的问题，可能对细胞生长、实验结果和细胞治疗产生负面影响。

污染主要来源于微生物，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。

组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。

当细胞被支原体污染后若由于材料的特殊性必须保留可以采用一定的抗生素进行处理，对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等。

目前，市场上已有了新一代支原体抗生素M-Plasmocin，能有效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。

另外，配合支原体检测试剂盒可以帮助尽快发现支原体的污染。

去医院买一瓶静脉滴注用的”环丙沙星注射液“，国产的很便宜，在超净台内打开，可直接往培养瓶里加，混匀，终浓度为10ug/ml，细胞连续用药两周，即OK。

也可试20，10，5，高中低三个浓度，慎重些。

本实验室多人试过，效果很好，且一瓶静脉滴注用的”环丙沙星注射液“，稀释量很大，能用于大量大量的细胞，经济实惠，最穷的人也用的起。

《细胞培养的微生物污染排除》一、抗生素除菌法：用BM－1（截耳素衍生物）和BM－2（四环素衍生物）抑制支原体1．抗生素制备：均可用PBS配成250×浓缩液－20℃备用，使用浓度参考《组织培养和分子细胞学技术》117页表6－2。

2．处理：取受支原体污染的细胞，吸除培养液，加入含BM-1的1640培养液培养3天后，吸除培养液，再加入含BM-2的1640培养液培养4天，如此连续三个轮回。

3．检测：用33258荧光染色镜检（每个轮回末应检测一次）。

4．培养：清除支原体后的细胞，在不加上述抗生素的培养液中，再传代培养3～4次。

5．镜检：如清除不彻底可再进行处理至纯净为止（一般3个轮回即能被完全消除）。

BM-1和BM-2与CIP（4-氟，2-羟基喹啉）联合应用亦可，即先用含BIP培养液培养12天后，再按上述方法处理。

二、加温除菌法：把受污染的细胞置41℃中作用5～10小时。

三、动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

细胞培养时遇到支原体污染怎么办前言：细胞培养物被支原体污染是极普遍的问题，面对支原体污染给细胞培养带来的巨大难题，世界各国开始重视，并相继建立了细胞库，对细胞质量进展控制，效果显著，支原体污染的问题得以限制。

目前已知能污染细胞的支原体有20多种以上，其中95％以上的支原体污染是口腔支原体。

目前已知的主要污染源是动物血清、胰酶和已污染培养物的气溶胶，例如，猪鼻支原体通过胰酶，在消化细胞时进入细胞培养物，并造成污染。

在原代细胞与传代细胞的检测中，原代细胞与传代细胞分离出支原体的频率是有明显差异的，传代次数越多的细胞，污染支原体的可能性就越大，这也是多次与动物血清、胰酶和已污染培养物的气溶胶接触后造成的，在原代细胞中，污染率低于4%，而传代细胞的污染率则高达57%~92%。

支原体的介绍支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞微生物，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。

革兰染色为阴性，但不易着色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。

支原体在自然界分布广泛，无细胞壁，直径为0.1-0.3μm，且形态易变，极易通过除菌过滤器。

大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，适合于偏碱条件下生存（pH7.6—8.0），对酸耐受性差，对75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。

对热比较敏感在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多，需要频繁换液才能维持传代培养的时候，即应怀疑支原体污染。

细胞培养过程中遇到的支原体95%都来自于以下四种支原体：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体，其中莱氏无胆甾支原体为牛源性。

细胞受支原体污染严重（1）据统计世界范围内大约有15%-35%的细胞培养物遭受了支原体污染。

（2）从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。

（3）欧洲药典规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。

支原体肺炎的病原菌分离与鉴定方法支原体肺炎是一种由支原体感染引起的呼吸道疾病，其主要病原菌为支原体肺炎衣原体。

及时准确地进行病原菌分离与鉴定对于临床诊断和治疗至关重要。

本文将介绍支原体肺炎病原菌的分离与鉴定方法。

一、支原体肺炎病原菌的分离方法1. 咳嗽标本采集：首先要采集患者的咳嗽标本，可以使用喉拭子或痰液进行采集。

采集时要避免污染，保证标本的纯净性。

2. 细胞培养：将采集到的咳嗽标本转移到细胞培养基中，经过一定的培养时间，支原体肺炎病原菌会在细胞上生长形成典型的细胞包涵体。

细胞培养可以通过显微镜观察，并可以进行进一步的鉴定。

3. PCR方法：PCR（聚合酶链式反应）是一种高效准确的分子生物学方法，可以快速检测到支原体肺炎病原菌的存在。

通过PCR扩增特定的基因片段，可以进行病原菌的定性和定量分析。

二、支原体肺炎病原菌的鉴定方法1. 免疫荧光法：免疫荧光法是一种常用的支原体肺炎病原菌鉴定方法。

通过使用特异性的免疫标记物，如抗原、抗体或核酸探针，与病原菌的抗原或核酸结合，然后通过荧光显微镜观察，可以确定支原体肺炎病原菌的存在。

2. 免疫固定法：免疫固定法是一种通过免疫沉淀形成凝胶状的方法。

该方法可以使用特异性的抗原或抗体与病原菌的抗原进行反应，形成免疫固定凝胶。

通过观察凝胶的形态和凝胶内的颗粒，可以鉴定支原体肺炎病原菌。

3. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA是一种使用酶的催化作用来检测抗原或抗体的方法。

通过将待测标本与特异性的抗原或抗体结合，并添加特异性酶标记的抗原或抗体，在适当条件下观察酶催化的显色反应，可以确定支原体肺炎病原菌的存在。

4. 基因测序：基因测序是一种通过对病原菌的基因进行测序，进而鉴定该病原菌种属和亚种的方法。

通过比对已知的基因序列数据库，可以确定支原体肺炎病原菌的种属和亚种。

总结：支原体肺炎的病原菌分离与鉴定方法包括咳嗽标本的采集、细胞培养、PCR方法、免疫荧光法、免疫固定法、ELISA和基因测序等多种技术手段。