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流感病毒实验室检测PPT课件

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《流感病毒全基因组测序技术》医学课件

《流感病毒全基因组测序技术》医学课件

可变性
流感病毒的可变性使得疫 苗研发和流行病学调查面 临挑战。
流感病毒全基因组测序的步骤和方法
1
样本采集
从患者样本或动物标本中采集流感病毒RNA。
2
RNA提取
从样本中提取流感序技术进行流感病毒全基因组测序。
4
数据分析
对测序数据进行生物信息学分析，包括序列比对和变异分析。
结论和总结
《流感病毒全基因组测序技术》是一项强大的医学工具，可以帮助我们更好地了解流感病毒的演化、传 播和变异。随着技术的进步，全基因组测序将在流感研究和公共卫生领域发挥更重要的作用。
《流感病毒全基因组测序技术》 医学课件
欢迎来到《流感病毒全基因组测序技术》医学课件。在本课程中，我们将探 索流感病毒全基因组测序的介绍、步骤、医学意义和未来发展方向。
流感病毒的分类和特点
分类
流感病毒被分为A、B和C 三种类型，每种都具有不 同的亚型和毒株。
特点
流感病毒具有高突变率、 易传播和致病性强的特点， 使其成为全球关注的疾病。
应用流感病毒全基因组测序的 医学意义
1 追踪病毒演化
2 疫苗开发
通过全基因组测序，可追踪 流感病毒的演化路径和变异。
全基因组测序为疫苗研发提 供信息，帮助识别病毒株和 选择适当的疫苗组分。
3 流行病学研究
基因组数据可用于流感传播模式研究和流行病学调查。
流感病毒全基因组测序的挑战和限制
高成本
全基因组测序技术相对昂贵， 限制了其在临床和流行病学 实践中的应用。
技术复杂性
全基因组测序需要高度专业 化的实验室设备和熟练的操 作技术。
分析难度
处理和分析大规模的测序数 据是一项具有挑战性的任务。
未来发展方向

〖医学〗流感病毒的分离鉴定

〖医学〗流感病毒的分离鉴定
取出鸡胚,消毒气室端卵壳,用小镊子在无大血管处 撕破卵膜,以无菌毛细管吸取尿囊液,放入无菌试管 中。
(2)取尿囊液0．1mL,作1：10稀释。
(3)取10支小试管，按给各管参加生理盐水。
(4)取1：10稀释的尿囊液0．2mL，加人第1个试管 中，混匀后，再吸出0．2mL参加第2个试管中； 混匀后，从第2个试管吸出0．2mL参加第3个试 管……依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9 个试管中取出0．2mL弃掉。这样各管液体量均 为0．2mL，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为 1:20，1:40，…，1:5120，第10个试管为生理 盐水对照管。
+－
－
－
→→ → → → → → →→
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ ㈤㈥ ㈦ ㈧ ㈨㈩
试管号 10
12 3 4 5
67
8
9
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
弃0.2
病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对照
不 管 是 中 医学 还是西 医学， 从二者 现有的 思维方 式的开 展趋势 来看， 均是走 向现代 系统论 思维， 中医药 学理论 与现代 科学体 系之间 具有系 统同型 性，属 于本质 相同而 描述表 达方式 不同的 两种科 学形式 。可望 在现代 系统论 思维上 实现交 融或统 一，成 为中西 医在新 的开展 水平上 实现交 融或统 一的支 撑点， 希冀籍 此能给 中医学 以至生 命科学 带来良 好的开 展机遇 ，进而 对医学 理论带 来新的 革命。 编 辑 本 段 现 代中医 史

微生物实验十 流感病毒的分离培养 PPT课件

微生物实验十 流感病毒的分离培养 PPT课件

• （二）、接种样本 • 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。 • （2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室 端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。 • (3)用注射器吸800µl标本。 • (4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚， 让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯 下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺 入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿， 当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而 动，即可注射200µl标本。将针头退出至½ 寸，将 另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床 采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。 • 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
二、流感病毒分离之鸡胚培养法
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 • 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚 • 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发 育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
• • • • •
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液 7、临床样品0.5mL 8、1mL无菌移液管 9、10mL无菌移液管 10、15mL无菌离心管
• • • • •
（三）实验步骤 1、准备病毒生长液 （1）细胞维持液准备 500mL D-MEM液中加入 ①青、链霉素母液 5mL（终浓度达： 100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度： 0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度： 25mM）

流感病毒实验室pcr检测技术

流感病毒实验室pcr检测技术
▪ 即使在PCR 方法中检测流感基因高度保守 片段和确诊A 型流感引物可能还能够使用， 但当前PCR 诊疗试验中用于A 型流感病毒 分型引物可能不能检测非人类病毒。
流感病毒实验室pcr检测技术
第21页
Real-Time PCR
▪ 基础原理:指在RT-PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程,最 终经过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析 方法.荧光基团主要有TaqMan荧光探针和SYBR 荧光染料
标本采集（一）
▪ 主要采集上呼吸道标本 ▪ 鼻咽拭子：将棉签平行于上颚插入鼻孔，保持几
秒吸收分泌物。 ▪ 口咽拭子：拭抹咽后壁和扁桃体部位，防止触及
舌部；快速将棉签放入无菌、内装3-5ml样本运 输液及带垫圈螺口塑料管中，在靠近顶端处折断， 旋紧管盖并密封。 ▪ 气管分泌液：搜集气管吸收液或支气管浇灌液510ml放入无菌、带垫圈50ml螺口塑料管中，马上 密封。
区、旅游区）人群健康，快速诊疗将提供有效信息以 供控制方案制订，提供有效公共健康提议。
流感病毒实验室pcr检测技术
第18页
快诊应用价值
➢ 监测：为社会公众提供流感活动情况“早期预警”系 统。在一些国家快速检测已经被应用流感监测形成制 度，被用于病毒分离前标本筛选。不过WHO要求对 流感进行抗原分析，不推荐把快速检测作为监测单一 伎俩。
▪ TaqMan荧光探针工作原理:PCR扩增时,在加入一 对引物同时加入一个特异性荧光探针,探针两端分 别标识一个汇报荧光基团和淬灭荧光基团.探针完 整时,汇报基团发射荧光信号被淬灭基团吸 收;PCR扩增时 ,探针被酶切降解,汇报基团和淬灭 基团分离,从而荧光监测系统接到荧光信号,每扩 增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧 光信号累积与PCR产物形成完全同时

流行性感冒ppt课件 (6)全

流行性感冒ppt课件 (6)全
29
第五节 人感染高致病性禽流感
二、流行概况
全球概况 1997年5月 香港3个农场发生家禽H5N1流感，该 月在当地从3岁男孩体内分离到H5N1病毒 2003年2月 H5N1病毒开始在部分东南亚国家禽 类中广泛循环，数月内迅速波及8个国家 截至2006年8月23日 全球共报道241例确诊人 禽流感病例，死亡141例
第 二 十 二 章
流行性感冒是一个古老的、第一个实行全球 性监测的、病毒性急性呼吸道传染病。
今后相当长一段时期仍然无法完全控制它的 传播和流行。
随着近年来禽流感疫情的爆发和蔓延，流行 性感冒已越来越成为人们关注的焦点。
2
第一节 病原学 第二节 流行特征 第三节 流行过程 第四节 预防策略与措施 第五节 人感染高致病性禽流感
3
第一节 病原学
流感病毒的基本结构 抗原变异 分类 致病力 免疫力
4
第一节 病原学
一、流感病毒的基本结构
流感病毒属正粘病毒
科，是多形性有包膜病
毒，多为球形，直径80 ～120nm
核糖包膜 : 核糖蛋白 (NP) -RNA (7 or 8 片 断 ) 基质蛋白 (M)
脂质双分子层 血凝素 (HA) 神经氨酸酶 (NA)
21
第四节 预防策略与措施
一、流感的流行病学调查
调查原则 注意研究样本
对从不同地区不同研究样本得来的资料进行综合分析时应特 别注意，差异较大时应分别描述，研究单位宜小不宜大。
临床病例的确诊
无论在平时对流感的监测，还是对流感流行的诊断均须注意 要有明确的诊断依据。
减少错误分类
22
第四节 预防策略与措施
病原上表现出乙型病毒株活动增强，而甲型病 毒株活力相对减弱的趋势

流行性感冒课件PPT(共51张PPT)

流行性感冒课件PPT(共51张PPT)
Myalgia, conjunctival injection Sore throat Substernal pain Productive cough (sputum)
% <10 < 20 < 30 <40 <50 <60 <70 <80 <90 100
From Kilbourne ED. Influenza. 1987:159, with permission.
可引起流行和大流行 变异快，可感染人类和动物
Type B（乙型）较A型严重性低 引起流行 较为稳定，感染人类
Type C（丙型）经常引起轻微的症状或无症状
引起散发病例 -----各型显示不同的临床和流行病学特点
分型与致病性
• 甲、乙、丙分型不仅反映了病毒被发现的年代 及前后顺序，更主要的是反映了对人类危害程 度。
• 对pH的稳定性 流感病毒最适pH为7~8。在pH值3以下或 10以上感染力很快被破坏。
• 对紫外线的稳定性 流感病毒能被紫外线所灭活。 • 对化学试剂的作用 流感病毒为一种带囊膜的病毒，故对
乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂均敏感。对氯化剂、卤素 化合物、重金属、去污剂、乙醇和甲醇也均敏感。
样本的采集与处理
常见呼吸道病毒引起的疾病
病毒
常见
不常见
少见
鼻病毒
cold
慢支哮喘加重
肺炎（儿童）
冠状病毒
cold
慢支哮喘加重
肺炎、支气管炎
呼吸道合胞病毒 幼儿：肺炎支气管炎 成人：Cold
老人免疫力 ：肺炎
副流感病毒
儿童：下呼吸道感染 咽炎、cold
免疫力 ：下呼吸道感染
腺病毒
儿童： Cold 、咽炎 军队等的呼吸道疾病 儿童：肺炎，免疫力 ：下

流感ppt课件

流感ppt课件
17
流感的易感人群
• 流感病毒极易变异，感
染后免疫保护维持的时间
不长；
而且，流感病毒的三个
型别之间、以及同型病毒
的亚型之间均无交叉免疫；
所以，人群对流感病毒
普遍易感。
18
发病机制与病理解剖
流感病毒致病的主要机 理是病毒复制引起的细胞 损伤及死亡。
此外，甲、乙型流感病 毒还可以诱导受感染的细 胞发生凋亡。
19
流感病毒可感染呼吸道的所 有各类细胞，并能在内复制。 呼吸道分泌物中的病毒量与疾 病严重程度有关。
外周血白细胞亦可感染流感 病毒，导致趋化性、吞噬作用、 及增殖能力的缺陷，使流感患 者继发细菌感染；继发感染的 细菌又进一步增强病毒的复制。
20
单纯型急性流感病人的喉、 气管、支气管存在广泛的炎症 病变、粘膜损伤和水肿、纤毛 细胞脱落。甚至支气管粘膜上 皮广泛脱落，深及基底层细胞。 病变累及气道越远端，组织的 病理反应就越显著。
流行性感冒
Influenza
1
流行性感冒（influenza）简 称流感，是一种由流感有高度传染 性，几乎每年都会在世界某个 地区爆发流行。
临床特点为起病急，病程短， 有高热、头痛、乏力等显著的 全身中毒症状，但呼吸道症状 相对较轻。
2
流感是一种 古老的呼吸道 传染病。早在 公元前412年， 希波克拉底就 在医学典籍中 记述了与流感 临床特点颇为 类似的呼吸道 疫病流行。 3
10
流感病毒的变异
流感病毒很容易变异，基因组自 发的点突变聚集到一定程度时，即 引起HA和NA抗原漂移（Antigenic drift）。这种在较小程度上发生的 基因变异，每年或每几年频繁发生。
若两种不同亚型毒株感染细胞， 使其基因组发生重组，则可引起抗 原位移（Antigenic shift），导致新 血清型的出现。

流感病毒及实验室检测

流感病毒及实验室检测
流感病毒及实验室检测
汇报人： 日期:
目录
• 流感病毒概述 • 流感病毒的实验室检测方法 • 实验室检测流程与规范 • 流感病毒的变异与进化 • 流感病毒的防治与未来展望 • 相关案例分析
01
流感病毒概述
Chapter
病毒类型与特点
流感病毒属于正粘病毒科，具有包膜、分节段和基因组 等特点。
根据病毒核蛋白和基质蛋白的不同，流感病毒可分为甲 、乙、丙三型，每型又根据病毒的抗原性不同分为若干 亚型。 流感病毒的遗传物质为RNA，具有高变异性，易引起病 毒株的变异和流行。
03
对于流感患者，应 及时隔离和治疗， 以减少病毒的传播 。
04
针对易感人群和高 危人群，可采取抗 病毒药物预防和治 疗。
02
流感病毒的实验室检测方法
Chapter
抗原检测
01
02
03
直接免疫荧光法
利用特异性抗体标记荧光 素，直接检测样本中的流 感病毒抗原。
间接免疫荧光法
将样本与特异性抗体结合 ，再与荧光素标记的抗抗 体结合，检测流感病毒抗 原。
规范操作
实验操作应严格按照实验室规范进行 ，防止因操作不当导致的病毒感染或 实验室事故。
04
流感病毒的变异与进化
Chapter
病毒变异类型与特点
抗原性变异
导致病毒的表面抗原结构发生变 化，从而产生新的病毒株。这种 变异是随机的、不定向的，并可 能导致病毒逃逸免疫系统的识别
和攻击。
宿主适应性变异
使病毒能够在不同的宿主环境中 生存和传播。这种变异通常涉及 到病毒的基因组中的多个位点， 并可能导致病毒对特定宿主产生
更强的致病性。
耐药性变异
使病毒对特定的抗病毒药物产生 抵抗力。这种变异通常是由于病 毒基因组中的突变积累所致，并 可能导致病毒对多种药物产生耐

2024版年度流行性感冒ppt医学课件

2024版年度流行性感冒ppt医学课件
预案内容
包括应急组织体系、应急响应机制、现场处置措施、医疗 救治方案等多个方面。
预案演练与评估
定期组织预案演练，对演练效果进行评估总结，不断完善 和优化预案内容。
2024/2/3
27
06 流行性感冒科普 知识宣传与教育
2024/2/3
28
科普知识内容选择
01
02
03
04
流行性感冒定义、病原 学特点
抗体水平。
分子生物学检测
采用RT-PCR、实时荧光定量 PCR等方法检测病毒核酸，具 有快速、灵敏和特异的优点。
快速抗原检测
采用免疫层析法等方法检测呼 吸道标本中的病毒抗原，操作 简便快速，适用于现场筛查。
12
03 流行性感冒预防 与控制策略
2024/2/3
13
疫苗接种政策及实施效果评估
疫苗接种政策
并发症预防与处理
肺炎
密切观察病情变化，及时使用抗 生素控制感染。
2024/2/3
心肌炎
注意休息、避免过度劳累，使用 营养心肌药物治疗。
脑炎
降低颅内压、控制惊厥、保护脑 细胞功能等治疗措施。
其他并发症
根据不同并发症采取相应预防和 处理措施。
22
05 流行性感冒疫情 监测与报告制度
2024/2/3
23
复制过程
病毒进入细胞后，利用细 胞资源进行复制，产生大 量子代病毒。
2024/2/3
传播途径
主要通过飞沫传播，也可 通过接触被病毒污染的物 品间接传播。
易感人群
人群普遍易感，尤其是儿 童、老年人和慢性病患者。
10
病毒变异与耐药性
病毒变异
流感病毒易发生抗原性变异和温度敏 感性变异，导致病毒毒力、传播力和 致病性的改变。

流感病毒细胞分离培养ppt课件

流感病毒细胞分离培养ppt课件
• （5）倒掉消化液，瓶内留少许流体，再放37℃ 2’–3’， 取出手上轻轻拍打几下，这时可加已配好的生长液， 稍加吹打即可。一般情况下，1瓶细胞传3瓶 ，每2-3 天需传一代。
2024/1/25
14
3、MDCK细胞保存及复苏
MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加 而下降，故各实验室应液氮冻存代数较低的细胞 作为种子。一般保存液为含10%二甲基亚砜和90% 小牛血清。
• （ 2 ） 已 成 片 的 MDCK 细 胞 ， 将 其 生 长 液 倒 掉 。 用 Versene洗2遍。
• （3）把Versene与0.25%胰酶按7∶1比例配成消化液。
• （4）置37℃恒温箱5—10min，当细胞变圆，细胞与 细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成 片，表明消化时间未到。
4、MDCK细胞对流感病毒敏感性测试
MDCK细胞对病毒的敏感性随其代数增
加而下降。故MDCK细胞在实验室传20代以
上时，一般需测试一下其对流感病毒的敏
感性。其具体测试法：选一株对MDCK细胞
较敏感的流感病毒株。在同一条件下，用
早代与要测试的MDCK细胞对其进行TCLD50
测定。如果测试的TCLD50比早代的低2个或
2024/1/25
4
2、单细胞的制备（略）
2024/1/25
5
3．细胞培养的基本条件：
• （1）细胞接种数：细胞量越大繁殖的速度越快，
接种传代细胞一般为10—30万/ml。
• （ 2 ） 合 成 培 养 液 ： 如 Eagle 氏 液 ， RPMI1640 ，
Eagle’s MEM。 不同培养液各有其特点，但往往也 适用于各种细胞培养，其主要成分为氨基酸、碳水

流感病毒 PPT课件

流感病毒 PPT课件
24
生物学性状
2、抗原性转变antigen shift ：变异幅
度大，质变，大流行。每10-40年出现一 次。
变异机理：基因重组(交换核酸片断）
26
人流感病毒
人 肺细胞
鸡流感病毒
新病毒株 27
where do “new” HA and NA come from?
• 13 types HA • 9 types NA
达非是由瑞士罗氏制药研制的抗病毒药。它主 要通过抑制流感病毒的基本表层结构-----神经氨酸酶 来治疗流感。
达非不仅适用于各型流感的治疗，如果能在出 现流感症状前及早服用，还可以预防流感，由于达 菲的副作用少，耐受性良好，与其他药物相互作用 的可能性也很小，所以非常安全。
45
罗氏揭秘达菲配方：八角+炸药
hana分亚型subtype依据易变异生物学性状18流感病毒的变异病毒类别特性比较a型b型c型变异性流行性变异较快变异较慢未见变异世界性流行局部流行散发流行19流感病毒的表示方法abangkok179h3n2最先分离的地区最先分离的日期抗原201997年5月9日香港一名3岁男童体内分离出一株a型流感病毒同年8月确诊为全球首例由a型h5n1禽流感病毒引起的人类病例至当年底香港共发生18例确诊病例其中死亡6例
– all circulate in birds
and pigs
28
生物学性状
甲型流感病毒抗原转变与流行年代
亚型
HA
NA
流行年代
H1N1
H1
N1
1918-1957
H2N2
H2
N2
1957-1968
H3N2
H3
N2
1968-
H1N1
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– 分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶 和DNA酶) – 正反向引物 (40μM) – 双重标记探针(10μM)
标本的处理
• 标本送至实验室后，立即进行处理，未加 抗菌素的加入适量的抗菌素。 • 将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于 MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接 种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测
程序实时调整）
实验室检测
◆核酸检测
◆病毒分离和鉴定：鸡胚分离和细胞培养
◆胶体金快速检测
荧光定量PCR
• 引物和探针
– 稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避 光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）； – 涡旋振荡引物和探针； – 瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。
• real-time RT-PCR的试剂
– QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443
荧光定量PCR
• 第一次使用前引物稀释
• 1．引物工作浓度（40μM） • 配制方法：
– （1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 – （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引 物浓度为100μM，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若2OD的 量为9.1 nmol ，加水量为10×9.1＝91μl） – （3）将100μM的引物2.5倍稀释，此时浓度为40μM，可作为工作浓度。
• 采集时间：病人发病的头3天内采集 • 采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院 • 采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家 哨点医院每周至少采集5～15份流感样病例的 标本(根据流行季节、流行强度、防控工作需要实时 调整）
暴发疫情标本采集
• （1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体 单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例 及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留 观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联 的死亡病例； • （2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内 出现流感样病例异常增多。
实验室生物安全要求
季节性流感病毒分离鉴定在生物安全Ⅱ级 实验室进行。
流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有 能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物 安全Ⅱ级实验室的生物安全柜里操作。 用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生 物安全Ⅰ级实验室进行
பைடு நூலகம்
标本的接收
• 接收标本时必须核对送检表 • 流感监测网络实验室的工作人员接到标本 后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例 标本原始登记送检表”（表2）录入到“监 测信息系统”
• 注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保 持低温。
荧光定量PCR
• 反应体系和条件
• 试剂：Invitrogen SuperScript® III Platinum® One-Step Quantitative Kit （公司： Invitrogen， 货号：11732-020或11745-100）
检测流程
临床标本采集 流感病毒核酸检测阳性 接种MDCK细胞 接种鸡胚
红细胞凝集试验
红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒 寄送国家流感中心
核酸检测
• 核酸提取- QIAamp® Viral RNA Mini Kit • 1）在1.5ml 离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。 • 2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚 尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10 ％悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。 • 3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。 • 4）将Viral RNA Mini spin柱子取出，将步骤3的混合液吸取 630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。 • 5）重复步骤4。 • 6）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm离心1min。弃套管及其离心液。 • 7）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液， 13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。 • 8）将吸附柱放入一新的1.5ml 离心管中，于柱中加入60ul的 AVE液，室温静置1－3分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即 为提取的病毒RNA，立即实验或－20℃以下保存。
• 每一起暴发疫情一般应当采集10份左右咽、鼻 拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当 尽量全部采样）。
采集标本类型
常规
咽拭子 鼻拭子 痰液
特殊
鼻咽/呼吸道吸取物 鼻洗液 呼吸道灌洗液 肺组织活检标本 尸检标本
采样液
• 常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hank’s液或 MEM； • 标本采集后应立即放入适当的采样液中低 温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250μg/mL ）
• 2．探针工作浓度（10/20μM/） • 配制方法：
– （1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。 – （2）用RNase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引 物浓度为100μM，可作为储存液。 – （3）将100μM的探针10/5倍稀释，此时浓度为10/20μM，可作为工作浓度。
流感病毒实验室检测
流感监测目的
• （一）监测流感活动水平和流行动态；
• （二）及时发现流感病毒变异并作出预警； • （三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测 和推荐提供依据。
流感监测内容
• （一）流感样病例监测
• （二）流感样病例暴发疫情监测
流感样病例监测标本采集
• 采集对象： 流感样病例
发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者
咽拭子采集
• 咽拭子 • 用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料 杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉 签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部弃 去，旋紧管盖。
标本的保存与运送
• 标本采集后应在4℃条件下，尽快（哨点监 测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网 络实验室
• 未能送至实验室的，应臵-70℃或以下保存， 一周内送实验室 • 冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷 藏条件下送到实验室