实验七细菌接合(conjugation)
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致病特性： 致病：鼠疫（自然疫源性、甲类法定烈性传染病），包括腺鼠疫（腹股 沟和腋下淋巴结炎）、肺鼠疫（黑死病）、败血症型鼠疫 毒力因子：F1抗原（荚膜抗原)、V/W抗原（抗吞噬，可胞内寄生）、外 膜蛋白、鼠毒素（细菌自溶释放、作用心血管系统）、内毒素等 流行：鼠蚤叮咬或剥食感染动物
免疫、预防和治疗： 免疫性：抗体为主，感染可获牢固免疫力 预防：灭鼠（储存宿主）、灭蚤（传播媒介）。无毒株EV活疫苗，皮上 划痕、皮下或皮内注射 治疗：及早用抗生素、如链霉素联合磺胺或四环素等合用
1ml肉汤
含氯霉素麦 康凯平板
1ml肉汤 37℃温箱1-2小时培养
1ml肉汤
含氯霉素麦 康凯平板
含氯霉素麦 康凯平板
不含氯霉素 麦康凯平板
麦康凯平板上的两种菌落
沙门氏菌
大肠杆菌
经37℃24h培养后
含氯霉素麦康凯平板
不含氯霉素 麦康凯平板
无色透明菌落 无色透明菌落和粉 无菌落生长 无色透明菌落和粉
检查： 标本：专用实验室操作取材（穿刺淋巴液、血液、痰、分泌物等） 镜检：涂片染色（见特性） 血清学、核酸检测等辅助。
布鲁氏菌
主要生物特性： 形态：G-, 有微荚膜 培养：需氧、分离需含5-10% CO2；不溶血，可分解尿素和产生H2S 抵抗力：巴氏消毒法可灭菌（鲜奶）
致病特性： 致病：布鲁氏菌病（多次菌血症、波浪热），引起家畜流产，睾丸炎、 乳腺炎等，易转为慢性 毒力因子：内毒素为主、微荚膜、侵袭性酶等 流行：接触病畜、或畜产品，多途径感染
铜绿假单胞菌
主要生物特性： 形态：G-, 有荚膜和单极鞭毛 培养：专性需氧、产青脓素和绿脓素
致病特性： 致病：为肠道正常菌群，可致局部化脓，如中耳、角膜、尿道、脓胸等 毒力因子：内毒素（LPS和OEP)为主、密度感知系统（QS系统）；荚膜、 酶和外毒素等 流行：院内感染常见
免疫、预防和治疗： 免疫性：中性粒细胞吞噬为主、抗体、粘膜免疫参与 预防：OEP疫苗等，防院内感染 治疗：庆大霉素，多粘菌素等，注意多种耐药性。
免疫、预防和治疗： 免疫性：细胞免疫为主（布鲁菌可在中性粒、巨噬细胞内寄生） 预防：避免接触病畜；接种家畜，疫区人群接种减毒活疫苗 治疗：利福平联合多西环素、四环素，神经受累者四环素合用链霉素
检查： 标本：血液、骨髓，动物患病脏器等 分离培养：4-7天可形成菌落、结合H2S、血清学（检测A和M菌体抗 原）确定型别 皮试（皮下注射布鲁菌素）：阳性者为慢性或曾经患过布鲁氏菌病
放线菌属
主要生物特性： 形态：G+, 有放射状菌丝和孢子，似真菌 培养：厌氧或微需氧（加5%CO2)、难培养，葡萄糖肉汤培养可见灰白 色球形颗粒
致病特性： 致病：为口腔等开放通道的正常菌群，致软组织化脓性炎症，伴慢性 肉芽肿、多发性瘘管等，面颈部感染最为常见，可引起脑膜炎、 脓肿，肺部感染、腹部、盆腔感染、龋齿和牙周炎等。
实验七 细菌接合（conjugation)
• 实验内容： 学生操作：接合试验
讨论课：
炭疽芽胞杆菌、铜绿假单胞菌 鼠疫耶氏菌、放线菌属/布鲁菌
细菌接合实验原理
• 通过性菌毛使供菌与受菌接触，将供菌的遗 传物质转移到受菌内，使受菌获得供菌某些遗传 性状的基因转移方式称 接合(conjugation)。 只有带有接合性质粒的细菌才能通过接合转 移遗传物质。接合性质粒包括F质粒、R质粒、 Col质粒等。 接合配对是由致育因子(F质粒)的存在所决定 的 ，因为F质粒基因编码性菌毛。
红色不透明菌落
红色不透明菌落
Q2: 如何证明大肠杆菌获得氯霉素耐药性是由于细菌接合，而 不是由其它遗传物质传递方式而导致的变异呢？
讨论课专题
白喉棒状杆菌
流感嗜血杆菌 军团菌
（实验六）
鲍特菌
炭疽芽胞杆菌
铜绿假单胞菌 鼠疫耶氏菌
（实验七）
放线菌属/布鲁菌
讨论课注意事项：
1.时间：20min 2.内容：前期选定 3.形式：不限 4.评分：同学间自评为主
• 其它器材: 100μl 加样器 无菌加样器枪头
操作步骤
1. 分别吸取0.1ml供体菌和受体菌于2支1ml 肉汤管中，另各吸取0.1ml供体菌和受体 菌于1ml肉汤管中混合，置37℃温箱1-2 小时培养。
2. 上述培养物分别接种麦康凯平板，培养 24h，观察结果
•
供体菌
0.1ml
受体菌
0.1ml
免疫、预防和治疗： 免疫性：抗毒素、吞噬细胞，感染获持久免疫力 预防：炭疽减毒疫苗、皮上划痕接种 治疗：首选青霉素G，过敏者用环丙沙星、红霉素等
检查： 标本：患者病灶取材（水泡、血液、痰、粪便等）、动物割耳、舌尖 （禁室外解剖、注意防护和扩散） 镜检：涂片G+, 粗大杆菌、或荧光抗体染色 分离培养：青霉素串珠试验
炭疽芽胞杆菌
主要生物特性： 形态：G+, 粗大截平、竹节样链状排列，可形成芽胞（对氧化剂敏感） 培养：多需氧、肉汤培养基，絮状沉淀生长；穿刺明胶培养基：倒松树状
致病特性： 致病：炭疽（anthrax), 包括皮肤（黑色焦痂）、肠、肺炭疽 毒力因子：炭疽毒素（保护性抗原结合致死因子和水肿因子构成复合物） 流行：摄食或接触感染动物、畜产品
免疫、预防和治疗： 免疫性：细胞免疫为主、抗体无保护作用 预防：注意口腔卫生、及时治疗口腔疾病 治疗：首选青霉素，亦可克林霉素、红霉素、林可霉素等
检查： 标本：病灶取材（脓液、痰液、组织切片等） 镜检：找硫磺样颗粒（黄色小颗粒），压片染色见放射状排列菌丝、 菊花状
检查： 标本：病灶取材（脓液、血液、脑脊液等） 分离培养：血琼脂平板见绿色水溶性色素
鼠疫耶尔森菌
主要生物特性： 形态：属肠杆菌科，两端钝圆、两极浓染卵圆形G-, 培养：27-30℃最适，肉汤培养48h可形成菌膜，摇动呈“钟乳石”状下沉 变异：野生株呈R型菌落，人工培养成S型，毒力减弱（与其它菌相反）
细菌性菌毛与接合过程
• 实验材料：（3人一组）Q1: 如何确定鼠伤寒沙门菌含
• 菌 株:
氯霉素耐药质粒（R质粒）？
供菌 （A） 鼠伤寒沙门氯霉素耐药株
受菌 （B） 大肠杆菌氯霉素敏感株
• 培养基: 1ml 肉汤试管3支、含氯霉素麦康凯
(MacCokey)平板3块、不含Байду номын сангаас霉素麦康 凯 (MacCokey)平板1块（贴纸标签）
免疫、预防和治疗： 免疫性：抗体为主，感染可获牢固免疫力 预防：灭鼠（储存宿主）、灭蚤（传播媒介）。无毒株EV活疫苗，皮上 划痕、皮下或皮内注射 治疗：及早用抗生素、如链霉素联合磺胺或四环素等合用
1ml肉汤
含氯霉素麦 康凯平板
1ml肉汤 37℃温箱1-2小时培养
1ml肉汤
含氯霉素麦 康凯平板
含氯霉素麦 康凯平板
不含氯霉素 麦康凯平板
麦康凯平板上的两种菌落
沙门氏菌
大肠杆菌
经37℃24h培养后
含氯霉素麦康凯平板
不含氯霉素 麦康凯平板
无色透明菌落 无色透明菌落和粉 无菌落生长 无色透明菌落和粉
检查： 标本：专用实验室操作取材（穿刺淋巴液、血液、痰、分泌物等） 镜检：涂片染色（见特性） 血清学、核酸检测等辅助。
布鲁氏菌
主要生物特性： 形态：G-, 有微荚膜 培养：需氧、分离需含5-10% CO2；不溶血，可分解尿素和产生H2S 抵抗力：巴氏消毒法可灭菌（鲜奶）
致病特性： 致病：布鲁氏菌病（多次菌血症、波浪热），引起家畜流产，睾丸炎、 乳腺炎等，易转为慢性 毒力因子：内毒素为主、微荚膜、侵袭性酶等 流行：接触病畜、或畜产品，多途径感染
铜绿假单胞菌
主要生物特性： 形态：G-, 有荚膜和单极鞭毛 培养：专性需氧、产青脓素和绿脓素
致病特性： 致病：为肠道正常菌群，可致局部化脓，如中耳、角膜、尿道、脓胸等 毒力因子：内毒素（LPS和OEP)为主、密度感知系统（QS系统）；荚膜、 酶和外毒素等 流行：院内感染常见
免疫、预防和治疗： 免疫性：中性粒细胞吞噬为主、抗体、粘膜免疫参与 预防：OEP疫苗等，防院内感染 治疗：庆大霉素，多粘菌素等，注意多种耐药性。
免疫、预防和治疗： 免疫性：细胞免疫为主（布鲁菌可在中性粒、巨噬细胞内寄生） 预防：避免接触病畜；接种家畜，疫区人群接种减毒活疫苗 治疗：利福平联合多西环素、四环素，神经受累者四环素合用链霉素
检查： 标本：血液、骨髓，动物患病脏器等 分离培养：4-7天可形成菌落、结合H2S、血清学（检测A和M菌体抗 原）确定型别 皮试（皮下注射布鲁菌素）：阳性者为慢性或曾经患过布鲁氏菌病
放线菌属
主要生物特性： 形态：G+, 有放射状菌丝和孢子，似真菌 培养：厌氧或微需氧（加5%CO2)、难培养，葡萄糖肉汤培养可见灰白 色球形颗粒
致病特性： 致病：为口腔等开放通道的正常菌群，致软组织化脓性炎症，伴慢性 肉芽肿、多发性瘘管等，面颈部感染最为常见，可引起脑膜炎、 脓肿，肺部感染、腹部、盆腔感染、龋齿和牙周炎等。
实验七 细菌接合（conjugation)
• 实验内容： 学生操作：接合试验
讨论课：
炭疽芽胞杆菌、铜绿假单胞菌 鼠疫耶氏菌、放线菌属/布鲁菌
细菌接合实验原理
• 通过性菌毛使供菌与受菌接触，将供菌的遗 传物质转移到受菌内，使受菌获得供菌某些遗传 性状的基因转移方式称 接合(conjugation)。 只有带有接合性质粒的细菌才能通过接合转 移遗传物质。接合性质粒包括F质粒、R质粒、 Col质粒等。 接合配对是由致育因子(F质粒)的存在所决定 的 ，因为F质粒基因编码性菌毛。
红色不透明菌落
红色不透明菌落
Q2: 如何证明大肠杆菌获得氯霉素耐药性是由于细菌接合，而 不是由其它遗传物质传递方式而导致的变异呢？
讨论课专题
白喉棒状杆菌
流感嗜血杆菌 军团菌
（实验六）
鲍特菌
炭疽芽胞杆菌
铜绿假单胞菌 鼠疫耶氏菌
（实验七）
放线菌属/布鲁菌
讨论课注意事项：
1.时间：20min 2.内容：前期选定 3.形式：不限 4.评分：同学间自评为主
• 其它器材: 100μl 加样器 无菌加样器枪头
操作步骤
1. 分别吸取0.1ml供体菌和受体菌于2支1ml 肉汤管中，另各吸取0.1ml供体菌和受体 菌于1ml肉汤管中混合，置37℃温箱1-2 小时培养。
2. 上述培养物分别接种麦康凯平板，培养 24h，观察结果
•
供体菌
0.1ml
受体菌
0.1ml
免疫、预防和治疗： 免疫性：抗毒素、吞噬细胞，感染获持久免疫力 预防：炭疽减毒疫苗、皮上划痕接种 治疗：首选青霉素G，过敏者用环丙沙星、红霉素等
检查： 标本：患者病灶取材（水泡、血液、痰、粪便等）、动物割耳、舌尖 （禁室外解剖、注意防护和扩散） 镜检：涂片G+, 粗大杆菌、或荧光抗体染色 分离培养：青霉素串珠试验
炭疽芽胞杆菌
主要生物特性： 形态：G+, 粗大截平、竹节样链状排列，可形成芽胞（对氧化剂敏感） 培养：多需氧、肉汤培养基，絮状沉淀生长；穿刺明胶培养基：倒松树状
致病特性： 致病：炭疽（anthrax), 包括皮肤（黑色焦痂）、肠、肺炭疽 毒力因子：炭疽毒素（保护性抗原结合致死因子和水肿因子构成复合物） 流行：摄食或接触感染动物、畜产品
免疫、预防和治疗： 免疫性：细胞免疫为主、抗体无保护作用 预防：注意口腔卫生、及时治疗口腔疾病 治疗：首选青霉素，亦可克林霉素、红霉素、林可霉素等
检查： 标本：病灶取材（脓液、痰液、组织切片等） 镜检：找硫磺样颗粒（黄色小颗粒），压片染色见放射状排列菌丝、 菊花状
检查： 标本：病灶取材（脓液、血液、脑脊液等） 分离培养：血琼脂平板见绿色水溶性色素
鼠疫耶尔森菌
主要生物特性： 形态：属肠杆菌科，两端钝圆、两极浓染卵圆形G-, 培养：27-30℃最适，肉汤培养48h可形成菌膜，摇动呈“钟乳石”状下沉 变异：野生株呈R型菌落，人工培养成S型，毒力减弱（与其它菌相反）
细菌性菌毛与接合过程
• 实验材料：（3人一组）Q1: 如何确定鼠伤寒沙门菌含
• 菌 株:
氯霉素耐药质粒（R质粒）？
供菌 （A） 鼠伤寒沙门氯霉素耐药株
受菌 （B） 大肠杆菌氯霉素敏感株
• 培养基: 1ml 肉汤试管3支、含氯霉素麦康凯
(MacCokey)平板3块、不含Байду номын сангаас霉素麦康 凯 (MacCokey)平板1块（贴纸标签）
