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大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

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中国组织工程研究与临床康复 第15卷 第10期 2011–03–05出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research March 5, 2011 Vol.15, No.10

ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 1721Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Li Xiao-feng★, Master, Attending physician, Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China xiaofengli74@ 163.com

Correspondence to: Zhao Jin-m in, Doctor, Professor, Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China zhaojinmin@126.com

Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30860078*; Key Science and Technology Program by Health Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 200636*

Received: 2010-12-27 Accepted: 2011-01-26

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定**★ 李晓峰，赵劲民，苏 伟，崔向荣，罗世兴，马爱国 Culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells Li Xiao-feng, Zhao Jin-min, Su Wei, Cui Xiang-rong, Luo Shi-xing, Ma Ai-guo Abstract BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are not rich in bone marrow, and are difficult to culture in vitro. It is crucial to tissue engineering and to the cell experiments in vivo or in vitro that isolating and culturing in vitro BMSCs with high purity, strong vitality and homogeneous biological characteristics. OBJECTIVE: To establish a method of isolation, cultivation and purification of rat BMSCs in vitro, to observe cell morphology, and to assess surface markers and multi-directional differentiation capacity. METHODS: BMSCs from rats were isolated, cultured and purified by the whole bone marrow adherence method, for morphology observations, the growth curve was drawn, cell cycle was analyzed, cell surface markers were assessed by flow cytometry, and BMSCs were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes. RESULTS AND CONCLUSION: BMSCs from rats were spindle cell-based, showing radial colony arrangement. Cells kept strong growth and could passage in continuous and stable manner over 10 passages. The growth curve and cell cycle demonstrated that BMSCs were consistent with the growth characteristics and good activity of normal cells. At the third passage, BMSCs were negative for CD34 and CD45, but positive for CD44, CD90 and CD105. Following induction, oil red O staining, alkaline phosphatase staining, von Kossa staining and alizarin red staining produced a strong reaction in cells. Whole bone marrow adherence method is simple and can isolate, purify and amplify BMSCs in vitro. The obtained cells have general biological characteristics of mesenchymal stem cells, and also have potentiality of multi-directional differentiation. This experimental method has important practical significance to provide adequate source of seed cells for tissue engineering.

Li XF, Zhao JM, Su Wei, Cui XR, Luo SX, Ma AG. Culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(10): 1721-1725. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]

摘要 背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低，体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞，对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法，并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞，进行形态学观察，绘制生长曲线，细胞周期分析，流式细胞仪检测细胞表面标记物，分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主，呈放射状排列的细胞集落，细胞生长旺盛，可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44，CD90，CD105均呈阳性表达，而CD34，CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后，油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单，可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞，所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性，经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。 关键词：骨髓间充质干细胞；原代培养；形态学；分化；鉴定 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.10.003

李晓峰，赵劲民，苏伟，崔向荣，罗世兴，马爱国. 大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(10):1721-1725. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]

0 引言 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潜能，能促进间充质组织的再生，如：骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质等组织[1]。在骨髓中，BMSCs占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.1%，含量极低。而同时，由于组织工程需要大量的种子细胞，从啮齿类动物骨髓分离BMSCs的技

术上的难度限制了许多实验的开展。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的BMSCs对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 本实验通过BMSCs的黏附特性，应用全骨髓贴壁培养法，建立了一个简便、有效的原代培养、增殖和纯化BMSCs的方法，观察大鼠BMSCs的生物学特性及其成骨、成脂分化潜能，为组织工程寻找良好的种子细胞提供实践基础。

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大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定作者：李兰兰陈玲肖马炬明来源：《中国现代医生》2014年第01期[摘要] 目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）体外分离培养方法。

方法采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs，进行形态学观察，绘制生长曲线，流式细胞仪分析细胞周期、检测细胞表面抗原标志物，并进行成脂、成骨分化诱导。

结果获取的BMSCs形态呈均一成纤维细胞样，并呈集落样生长。

生长曲线呈S形，细胞周期显示86.02% P3代细胞为G0/G1期，保持活跃的扩增能力。

BMSCs 高表达CD44、CD90、低表达CD34、CD45。

成脂诱导21 d后，可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。

成骨诱导21 d后，可见大量橘红色矿化结节形成。

结论全骨髓贴壁培养法可成功有效地分离培养BMSCs。

[关键词] 骨髓间充质干细胞；全骨髓贴壁法；鉴定[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）01-0007-04BMSCs具有高度增殖的能力、体外基因转移效率高以及多向分化潜能等优点[1-2]，使其成为组织工程、细胞替代治疗等领域的首选种子细胞。

但是骨髓中的间充质干细胞含量极低[3]，且其含量随年龄增长而逐渐减少[4]，需经体外分离、纯化、扩增为纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞才能满足组织工程需求。

实验旨在建立一套简便有效的BMSCs原代培养方法，为后续实验做好准备。

1 材料与方法1.1 实验动物清洁级雄性SD大鼠6只，4周龄，体质量100 g，由浙江省实验动物中心提供。

实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 时间及地点于2013年1～6月在中国人民解放军第一一七医院干细胞治疗中心完成。

1.3 实验主要试剂低糖DMEM培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青/链霉素（吉诺生物），优质胎牛血清（Gibco），anti-CD45、anti-CD90（BD），anti-CD34（Santa Cruz），anti-CD44（Abcam），细胞周期即时检测试剂盒（凯基生物），成骨及成脂诱导分化培养液、茜素红、油红O （Cyagen公司）。

干细胞提取实验报告(3篇)

干细胞提取实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的本实验旨在从骨髓中提取间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs），并对其进行初步鉴定，为进一步的实验研究提供细胞来源。

二、实验材料1. 大鼠骨髓：购自动物实验中心，新鲜取材。

2. DMEM/F12培养基：购自Gibco公司。

3. 胎牛血清（FBS）：购自Gibco公司。

4. 0.25%胰蛋白酶：购自Gibco公司。

5. 抗CD29、CD34、CD45抗体：购自BD公司。

6. 流式细胞仪：购自BD公司。

7. 其他试剂：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、PBS含2%FBS、4%多聚甲醛等。

三、实验方法1. 骨髓采集：将大鼠麻醉后，无菌操作下取出髌骨，用剪刀剪成小块，置于含有PBS的离心管中，充分漂洗后，用镊子将骨髓组织分离出来。

2. 骨髓细胞消化：将分离出的骨髓细胞用PBS洗涤2次，加入0.25%胰蛋白酶消化5分钟，再用PBS终止消化。

3. 骨髓细胞计数：将消化后的细胞用PBS洗涤2次，调整细胞浓度至1×10^6个/mL。

4. 骨髓细胞培养：将骨髓细胞接种于DMEM/F12培养基中，添加10%FBS，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

5. 细胞传代：当细胞贴壁生长至80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代至新的培养瓶中。

6. 细胞鉴定：取第3代细胞，用抗CD29、CD34、CD45抗体进行流式细胞仪检测，分析细胞表型。

四、实验结果1. 骨髓细胞在培养箱中贴壁生长，形态呈梭形。

2. 流式细胞仪检测结果显示，骨髓细胞表达CD29、CD34，不表达CD45。

3. 骨髓细胞表现出典型的间充质干细胞表型。

五、实验结论本实验成功从大鼠骨髓中提取了间充质干细胞，并通过流式细胞仪检测验证了其表型。

这为后续的实验研究提供了可靠的细胞来源。

六、实验讨论1. 骨髓是MSCs的重要来源之一，具有来源丰富、易于获取等优点。

2. 本实验采用胰蛋白酶消化法分离骨髓细胞，操作简便，细胞活力较高。

全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性【摘要】目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(MSC) 的方法，研究MSC的生物学特性。

方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC，体外培养和连续传代, 在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；利用四唑盐比色（MTT）法测定MSC的生长曲线；流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜抗原。

结果原代分离的MSC在接种后48 h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。

经传代扩增,细胞进一步纯化。

细胞传代后2天内处于潜伏期, 3天后进入生长期,7天后进入平台期。

论文百事通FCM检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。

结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。

【关键词】间充质干细胞;骨髓;贴壁法分离培养Abstract:Objective To establish a simple and effective method of isolation, purification and cultivation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) in vitro, and explore their biologicalcharacteristics.Methods MSC were isolated and purified for culture in vitro and serial passage by the attachment culture method. The morphological changes of the MSC were continuously observed under the inverted microscope. The cell growth curve was measured by MTT method, and membrane antigens were detected with flow cytometry (FCM).Results The MSC in primary culture which were adhered to plastic surface within 48 h after displacement took the oval, asteroid, short and fusiform shapes. 12 days after culture in DMEM-F12 medium containing 10% FBS, the cells reached 90% confluence in single layers, taking a long and fusiform shape. Further purification was achieved by expansion at serial passages. MSC were in latency for 2 days, converted into growth period on the 3rd day and entered the stationary phase on the 7 th day. FCM results indicated that the positive rate of CD45 and CD90 was 19.60% and 95.38%, respectively.Conclusion The attachment culture method can be effectively used to isolate and purify rat MSC. The cultured MSC are stable in growth with active proliferation and share the general biological characteristics of MSC, which will further make them ideal seed cells for tissue engineering.Key words: mesenchymal stem cells; bone marrow; attachment culture骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC) 是骨髓内除造血干细胞外另一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的条件下能分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、成纤维细胞及神经星状细胞等，且具有极强的自我修复能力。

绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞培养及鉴定

绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞培养及鉴定

绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞培养及鉴定刘慧娟;胡若愚;戴王娟;刘元果;闵波;蒋犁【摘要】目的体外分离、培养和鉴定增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs).方法取EGFP转基因大鼠胫、股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养、纯化BMSCs;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪分析细胞表型;CCK-8法绘制细胞生长曲线并与野生型BMSCs增殖情况相比较;分别向成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定;将细胞经鼠尾静脉移植入大鼠体内,观察其在体内定植情况.结果获得稳定表达EGFP的BMSCs,以长梭形为主,融合后呈漩涡状排列;生长曲线示EGFP-BMSCs增殖能力旺盛,与野生型BMSCs相比差异无统计学意义(t=-0.023,P=0.982);细胞CD29、CD90、CD34、CD49d、CD45表达率分别为99.4％、96.4％、0.171％、0.049％、0.038％;成脂、成骨、成软骨诱导后,分别给予油红O、茜素红、甲苯胺蓝染色,结果均呈阳性;在肺组织内可检测到稳定的绿色荧光.结论成功获得高纯度、稳定表达EGFP的BMSCs,干细胞特性不受EGFP 影响.细胞定植后,示踪效果良好,可用于后续实验研究.【期刊名称】《中国医学科学院学报》【年(卷),期】2016(038)001【总页数】7页(P9-15)【关键词】骨髓间充质干细胞;绿色荧光蛋白;诱导分化【作者】刘慧娟;胡若愚;戴王娟;刘元果;闵波;蒋犁【作者单位】东南大学附属中大医院儿科,南京210009;东南大学附属中大医院心胸外科,南京210009;东南大学附属中大医院儿科,南京210009;东南大学附属中大医院心胸外科,南京210009;东南大学附属中大医院心胸外科,南京210009;东南大学附属中大医院儿科,南京210009【正文语种】中文【中图分类】R394.2间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中[1- 3]。