大鼠骨骼肌细胞培养实验指导

一、实验目的1. 探讨大鼠骨骼的结构、形态和生长发育规律；2. 分析大鼠骨骼的生理功能及影响因素；3. 为骨骼疾病的研究和预防提供理论依据。

二、实验材料与方法1. 实验动物：选用健康的Wistar大鼠，体重在180-220g之间，雌雄各半；2. 实验仪器：电子天平、解剖显微镜、切片机、显微镜、图像分析系统等；3. 实验方法：（1）骨骼标本采集：对实验大鼠进行麻醉，取其头骨、躯干骨、四肢骨等部位；（2）骨骼形态学观察：采用解剖显微镜观察大鼠骨骼的形态、大小、结构等特征；（3）骨骼生长发育规律研究：选取不同月龄的大鼠，比较其骨骼形态、大小、结构等特征；（4）骨骼生理功能研究：通过测量大鼠的骨密度、骨强度等指标，探讨骨骼的生理功能；（5）影响因素研究：研究不同环境、营养等因素对大鼠骨骼发育的影响。

三、实验结果1. 骨骼形态学观察（1）头骨：大鼠头骨呈椭圆形，分为颅骨和面骨，颅骨主要由额骨、顶骨、颞骨、枕骨等构成，面骨主要有上颌骨、鼻骨、泪骨等；（2）躯干骨：大鼠躯干骨包括颈椎、胸椎、腰椎、骶椎、尾椎等，颈椎较短，胸椎较宽，腰椎较长，骶椎和尾椎较短；（3）四肢骨：大鼠四肢骨包括肱骨、桡骨、尺骨、股骨、胫骨、腓骨等，四肢骨呈对称分布，具有明显的生长发育规律。

2. 骨骼生长发育规律研究（1）头骨：大鼠头骨的形态、大小、结构随月龄的增长而逐渐发育成熟；（2）躯干骨：大鼠躯干骨的形态、大小、结构随月龄的增长而逐渐发育成熟，其中腰椎的发育速度最快；（3）四肢骨：大鼠四肢骨的形态、大小、结构随月龄的增长而逐渐发育成熟，其中肱骨和股骨的发育速度最快。

3. 骨骼生理功能研究（1）骨密度：大鼠的骨密度随月龄的增长而逐渐增加，其中头部、上肢、大腿、躯干和肋骨部骨密度值均显著或极显著高于同月龄全身骨密度值；（2）骨强度：大鼠的骨强度随月龄的增长而逐渐增强，其中头部、上肢、大腿、躯干和肋骨部的骨强度均显著或极显著高于同月龄全身骨强度值。

冻存细胞的复苏1、于液氮罐中取出冻存管。

2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。

3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。

4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。

5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。

组织块法培养骨骼肌细胞1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。

2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。

3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。

5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。

翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。

入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。

贴壁细胞的传代和冻存1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。

2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。

3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。

4、加培养液终止消化。

5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。

6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。

7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。

8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。

9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。

细胞计数血球计数板每一大方格长为1mm，宽为1mm，高为0.1mm，体积为0.1mm3，可容纳的溶液是0.1μl，那么每ml溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格中数出的细胞数的10000倍。

上海交通大学学报(医学版)Vol .28No .7Jul .2008Journal of Shanghai J iaotong University (Medical Science )基金项目:上海市科委基金(044119605)(Shanghai Science and Technol ogy Comm ittee Foundati on,044119605)。

作者简介:徐　可(1975-),男,上海人,主治医师,博士;电子信箱:huashanxuke @medmail 。

通讯作者:方祖军,电子信箱:huashanfangzujun @ 。

文章编号:　0258-5898(2008)07-0775-04・论　著・大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性徐　可,　方祖军,　李映川,　郑　捷,　丁　强(复旦大学　华山医院泌尿外科,上海　200040)摘　要:目的建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。

方法采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。

免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MTT 法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性。

结果获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白des m in 呈强阳性表达。

体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1～2d 的潜伏期,5～6d 进入平台期。

细胞汇合至60%～70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞。

结论酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法。

骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞。

关键词:骨骼肌卫星细胞;　培养;　增殖;　分化中图分类号:Q 813.11 文献标志码:ACharacter isti cs of proli fera ti on and m yotube cell forma ti on of ra t skelet a l m uscle s a tellite cells cultured in vitroXU Ke,FANG Zu 2jun,L I Ying 2chuan,ZHENG Jie,D I N G Q iang(D epart m ent of U rology,Huashan Hospital,Fudan U niversity,Shanghai 200040,China )Abstract:　O bjective To establish a method of is olation and purificati on of rat skeletal muscle satellite cells,and observe the characteristics of p r oliferati on and my otube cell for mati on of skeletal muscle satellite cells cultured in vitro .　M ethods Purified skeletal muscle satellite cells were obtained by i mp r oved t wo 2step enzy matic digesti on method and p re 2p lating technique .I m munohistochem ical staining was emp l oyed t o identify the skeletal muscle satellite cells cultured in vitro .The gr owth of skeletal muscle satellite cells cultured in vitro was exam ined by MTT assay .The differentiati on of skeletal muscle satellite cells was observed by inverted m icr oscopy .　Resu lts The skeletal muscle satellite cells with higher purity were obtained and confir med by the high exp ressi on of des m in .W hen cultured in vitro ,the latent phase of skeletal muscle satellite cells was the first t o the second day,and the p latfor m phase was the fifth t o the sixth day .My otube cells gradually for med when cell confluence was more than 60%t o 70%or differential medium with l ower fetal bovine serum was used .Conclusion The co mbinati on of i mp r oved t wo 2step enzy matic digesti on method and p re 2p lating technique serve as an easyand p ractical way to obtain skeletal muscle satellite cells with higher purity .Skeletal muscle satellite cells can for m myotube cells with contraction characteristics without any s pecial induction .Key words:　skeletal muscle satellite cell;　culture;　p r oliferation;　differentiation 骨骼肌卫星细胞是存在于骨骼肌肌膜和基底膜之间的一些单个核细胞,被认为是一种具有一定自我更新能力[1]及已发生某种程度定向分化的成体组织内的专能干细胞[2],因此在组织工程和基因治疗领域有着良好的应用前景。

冻存细胞的复苏1、于液氮罐中取出冻存管。

2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。

3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。

4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。

5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。

组织块法培养骨骼肌细胞1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。

2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。

3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。

5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。

翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。

入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。

贴壁细胞的传代和冻存1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。

2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。

3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。

4、加培养液终止消化。

5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。

6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。

7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。

8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。

9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。

细胞计数血球计数板每一大方格长为1mm，宽为1mm，高为0.1mm，体积为0.1mm3，可容纳的溶液是0.1μl，那么每ml溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格中数出的细胞数的10000倍。

相关记录：年月日星期天气：实验内容：C57小鼠心肌细胞培养参加人员：王朗郭源源一、培养前准备：1 器械：取心脏： wpi剪2把、显微镊弯2把、眼科镊1把取心脏后：显微剪1把、持针器2把、吉利刀片2片、眼科镊2把、400目细胞滤网2 器皿：外：烧杯1个 100ml内：盛酒精小烧杯、棉签2包，鼠板盛小鼠尸体，玻璃皿100mm 2，碎冰盆底加两个冰袋，离心管架1，6孔板，EP管，15ml离心管，50ml离心管3 试剂与配制1.培养基：DMEM/F12，添加15%FBS2.提前融化：BrdU溴脱氧尿苷 100X储藏液(10 mM)，小牛血清、II型胶原酶〔10mg/ml储藏液〕、0.25%胰酶提前融化3.D-Hanks液：二方法1 心脏取出1. 加10ml和6ml未加血清的DMEM/F12到2个100mm皿中，平皿放入冰盆预冷。

2. 将20只小鼠婴放入100mm玻璃平皿，镊取小鼠放入75%酒精中浸泡数秒，对其颈部以下消毒，抓取小鼠，固定住上肢与下肢，从颈部剪下头部，剪刀由颈部伸入胸腔沿胸骨左侧剪开，轻轻挤压胸廓，让心脏跳出，迅速用镊子取下心脏，放入盛有10ml DMEM/F12的玻璃平皿中。

3. 轻柔清洗心脏的血液后转入另一个盛有10ml DMEM/F12液的10cm培养皿中，用显微剪将心脏剪成1-2mm的碎片。

4. 以上过程应在冰上30min之内完成。

2 消化细胞1. 将剪碎的组织转入15ml离心管，吸去DMEM/F12，参加酶消化液4ml。

2. 37度水浴中轻摇，消化10min，静止数秒钟，吸取上清液，弃去。

此时消化下的细胞为不需要的红细胞、细胞碎片以与心内膜和心外膜细胞。

3. 37度水浴中轻摇，消化4-5min。

静止数秒钟，吸取上清液，放入预先放好7ml〔体积为上清液体积的2-3倍〕含20%小牛血清的DMEM/F12培养基的15ml离心管中终止消化，并置于冰上。

4. 重复3步骤，循环5-6次。

取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。

·实验研究·大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养的实验研究夏家红　谢艾妮　徐磊　张凯伦 基金项目:国家自然科学基金资助项目(03970720);武汉市晨光计划青年基金资助项目(20035002016-17)作者单位:430022武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院心脏外科 【摘要】　目的　改进鼠肌卫星细胞体外培养方法,得到更高纯度的肌卫星细胞。

方法　采用成年Wistar 大鼠,将两步消化法加以改进,采用Ficoll 分离和差速贴壁法两步纯化得到更高纯度的肌卫星细胞。

所得细胞采用免疫组织化学方法加以鉴定。

结果　此方法肌卫星细胞纯化率可达到98%。

细胞增殖快,生长良好。

结论　本实验成功建立了卫星细胞纯化方法,适用于心外科及相关科室开展细胞移植和基因治疗方面的研究。

【关键词】　肌细胞;　细胞培养;　纯化C ulture of rat musclesatellite cell in vitro XI A Jia -hong ,X IE Ai -ni ,XU Lei ,et al .Depart ment ofCardiovascular Surgery ,Uion Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and T echnology ,Wuhan 430022,China【Abstract 】　Objective To improve the culture method of rat muscle setellite cell in vitro and ob -tain more purified muscle setellite cells .Methods T he mo re purified satellite cells w ere obtained from adult Wistar rats isolated by improved two -steps digestion metho d ,and purified by the tw o -step method of F icoll seperation and velocity sedimentation .T he cells w ere identified by immunochemical stain .Results T he purification rate of satellite cells was 98%by using this method and they showed stro ng proliferative ablity and g rew well .Conclusion T he purification technique for satellite cell was developed successfully .It w as useful for cardial surg ery department or other departments to study cell transplantion and gene therapy .【Key words 】　M uscle cell ;　Cell culture ;　Purificatio n 1961年Mauro [1]发现了骨骼肌卫星细胞,并证实其是骨骼肌干细胞。

骨骼肌成纤维细胞分离培养
骨骼肌成纤维细胞（skeletal muscle fibroblasts）的分离和
培养是一种常用的实验技术，用于研究骨骼肌相关的生物学过程以及
肌肉疾病等。

以下是骨骼肌成纤维细胞分离培养的一般步骤：
1.准备离体骨骼肌组织。

从小鼠或人的骨骼肌中取出组织，最好是新鲜组织以确保细胞的活力。

2.组织消化。

将骨骼肌组织切成小块，用胶原酶或胰蛋白酶等消化酶进行消化，使细胞从组织中释放出来。

3.细胞筛选。

通过过筛网或离心的方式将消化后的细胞悬浮液筛选，去除大部分的纤维束和其他细胞类型。

4.细胞培养。

将筛选后的细胞悬浮液转移到培养皿中，添加含有合适培养基和补充物的培养液，将培养皿放置在适当的培养箱中。

5.培养条件。

骨骼肌成纤维细胞通常在37°C的孵育箱中，与5% CO2的空气保持湿润的环境中培养。

6.细胞生长和传代。

骨骼肌成纤维细胞会在培养皿中黏附并开始增殖。

当细胞达到一定密度时，可以进行传代，将细胞分离并分散到
新的培养皿中。

需要注意的是，分离和培养骨骼肌成纤维细胞需要一定的实验技巧和设备，以保证细胞的存活和生长。

同时，细胞的培养基选择和培
养条件的控制也对细胞的生长和功能有重要影响。

因此，在进行这项
技术时，需要按照具体实验要求和相关文献中的方法进行操作。

一、实验目的1. 了解肌肉细胞的生物学特性。

2. 掌握肌肉细胞的培养方法。

3. 学习显微镜观察肌肉细胞形态和结构。

二、实验原理肌肉细胞是人体内负责运动的重要细胞，具有收缩和舒张的功能。

通过体外培养肌肉细胞，可以研究肌肉细胞的生长、分化和功能特性。

本实验采用动物肌肉组织作为实验材料，通过组织块培养法培养肌肉细胞，并在显微镜下观察其形态和结构。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠肌肉组织、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、无菌手术器械等。

2. 实验仪器：超净工作台、手术显微镜、倒置显微镜、细胞培养箱、移液器、离心机等。

四、实验步骤1. 获取肌肉组织：取小鼠肌肉组织，用无菌手术器械将其剪成小块。

2. 培养基制备：将DMEM培养基与胎牛血清、青霉素、链霉素混合，调整pH至7.2-7.4。

3. 组织块培养：将肌肉组织块放入培养皿中，加入适量培养基，放入细胞培养箱中培养。

4. 细胞传代：待肌肉细胞长满培养皿后，用吸管吸取细胞悬液，离心后弃去上清液，加入新鲜培养基重悬细胞。

5. 观察与记录：将细胞悬液滴加于载玻片上，用盖玻片覆盖，放入倒置显微镜下观察肌肉细胞形态和结构。

五、实验结果1. 肌肉细胞在培养皿中生长良好，呈长梭形，排列紧密。

2. 肌肉细胞具有收缩和舒张功能，可通过显微镜观察到细胞在培养基中的收缩现象。

3. 随着细胞传代次数的增加，细胞形态逐渐趋于成熟，细胞间连接增多。

六、实验讨论1. 本实验成功培养了肌肉细胞，为后续研究提供了实验材料。

2. 肌肉细胞在体外培养过程中，具有较好的生长和分化能力，为研究肌肉细胞的生物学特性提供了有力支持。

3. 通过显微镜观察，可以看出肌肉细胞具有收缩和舒张功能，这与肌肉细胞在体内的生理功能相一致。

七、实验结论1. 本实验成功培养了肌肉细胞，为后续研究提供了实验材料。

2. 肌肉细胞在体外培养过程中，具有较好的生长和分化能力。

3. 肌肉细胞具有收缩和舒张功能，这与肌肉细胞在体内的生理功能相一致。

骨骼肌的原代培养一.试剂1.包被用多聚赖氨酸poly-lysine的配制与包被1）准备0.94%硼酸溶液称取0.94硼酸粉末溶于80ml水中，用NaOH将pH值调至8.4，再定容。

2）按每4.9mg多聚赖氨酸粉末溶解于98ml0.94%硼酸溶液配制100ml.3）0.22µM过滤分装，-20°C储存，避免反复冻融。

4）包被：按10cm皿用4ml包被液进行包被，4°C过夜或37°C 2 小时后，吸干，回收包被液，包被过的皿置4°C保存可达一个月，临用前用PBS或灭菌的去离子水洗3遍再使用，整个包被过程均为无菌操作。

多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。

也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。

多聚赖氨酸包被培养板使用前是用灭菌的去离子水稀释，最好不要用双蒸水或别的，因为多聚赖氨酸包被的原理是通过改变器皿表面的电荷而促进细胞的黏附。

2. 0.1% I型胶原酶（1mg/ml）100mg I型胶原酶溶于100ml D-hank’s液中，过滤后4°C保存。

3. D-hank’s液（可以直接购买使用）KCl 0.40g，KH2PO4 0.06g，NaCl 8.00g, NaHCO30.35g, NaH2PO4·7H2O 0.09g，酚红0.01g。

以上均为分析纯，加三蒸水定容至1L后高压灭菌，4℃分装备用;4. 血清的灭活:常用的血清要先在56℃水浴中灭活30min方可使用。

灭活后-20℃保存备用;5. 细胞生长液的配制(100mL):即含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液。

取20ml灭活的血清，再加青、链霉素各100IU，然后用DMEM/F12培养基补充到100 mL，4℃保存备用。

6. 0.1%胶原酶II(100 mL)的制备:称取胶原酶II 100mg用100mL DMEM/F12液充分溶解，0.22µM过滤后分装备用，-20℃保存;7. 75%乙醇8. Mini-Q(超纯水)--灭菌无离子水二.实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4、眼科镊和止血钳5、烧杯6、15ml离心管三、正常小鼠原代骨骼肌细胞培养实验流程取肌肉于平皿，Hank’s洗3次↓剔除脂肪、结缔组织↓肌肉标本剪约0.1cm3小块↓移至离心管，Hank’s洗3次↓静置1min，弃去上层液及漂浮组织↓0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次↓生长培养基终止消化，反复吹打，依次100，200，400目过筛↓离心，1000rmp,10min，弃去上清↓重悬，计数细胞，接种密度以5 × 105个/ml↓悬液加入未经PPL包被培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度，1h↓转移包被瓶中，生长培养基培养，培养37℃，5%CO2↓4d换液，以后每天换四、实验操作1、新生小鼠拉颈椎处死，乙醇消毒腿部，在超净工作台内，取肌肉于平皿，Hank’s 洗3次，剔除脂肪、结缔组织，将肌肉标本剪约0.1cm3小块；2、将剪碎的肌肉移至离心管，Hank’s洗3次，静置1min，弃去上层液及漂浮组织；3、向上述离心管中加入0.25%胰酶，37度水浴消化20min，每5min摇动或吹打1次离心管，然后加入生长培养基终止消化；4、反复吹打后，依次100，200，400目过筛，滤液收集后，1000r/min离心10min；5、弃去清夜，用生长培养基重悬细胞，悬液加入未经PPL包被的培养瓶中，差速贴壁去除成纤维细胞，37度培养1h后，转移包被瓶中，生长培养基培养，4d 换液，以后每天换液1次。

骨骼肌实验报告一、引言骨骼肌是人体最重要的组织之一，负责身体的运动和姿势维持。

为了更深入地了解骨骼肌的结构和功能，本次实验旨在观察骨骼肌在不同条件下的运动表现，并分析其中的变化和原因。

二、实验材料和方法实验所需材料包括细胞培养基、骨骼肌组织样本、显微镜、培养皿等。

首先，从动物实验对象中取得骨骼肌样本，并通过适当的处理方法将其分离成细胞。

然后，将这些细胞放入培养皿中添加细胞培养基，放置于恒温培养箱中进行培养。

在培养过程中，可以通过显微镜观察骨骼肌细胞的变化，并记录下相应的数据。

三、实验观察与结果在实验过程中，观察到骨骼肌细胞呈现出不同的形态和运动表现。

当放置在培养皿中时，细胞会自发地进行收缩和伸展，呈现出规律的运动节奏。

在培养基中添加不同的药物后，观察到骨骼肌细胞的运动方式发生了变化。

例如，在添加镇静剂后，细胞的运动变得缓慢而有序。

而在添加兴奋剂后，细胞则呈现出异常兴奋的状态。

通过对实验观察结果的分析，我们可以得出以下结论：1. 骨骼肌细胞具有自发的收缩和伸展能力，这是维持身体运动和姿势的基础。

2. 药物的添加可以改变骨骼肌细胞的运动表现，进一步证实了药物对身体活动的影响。

3. 不同药物对骨骼肌细胞的作用方式也不同，有些会缓慢细胞的运动，而有些会提高细胞的兴奋性。

四、讨论与分析骨骼肌的运动受到神经系统的控制和调节。

在本次实验中观察到的不同运动方式，可以反映出神经冲动在骨骼肌收缩和伸展过程中的传导和调节。

不同药物的添加会对神经冲动的传导产生影响，进而改变骨骼肌细胞的运动方式。

此外，实验结果还可以为骨骼肌疾病的研究和治疗提供一定的指导。

通过观察药物对骨骼肌细胞的作用方式，可以研发出更有效的治疗手段，进一步改善骨骼肌疾病患者的生活质量。

然而，本次实验还存在一些局限性。

首先，由于实验条件的限制，我们只能通过细胞培养的方式观察骨骼肌细胞的运动变化，无法模拟完全真实的人体运动情况。

其次，实验中使用的药物数量和种类有限，可能无法涵盖所有可能的影响因素。

实验题目：大鼠骨骼解剖实验实验日期：2023年X月X日一、实验目的和要求1. 熟悉大鼠骨骼系统的组成和结构。

2. 掌握大鼠骨骼的解剖方法和步骤。

3. 了解大鼠骨骼的形态、功能和相互关系。

4. 培养实验操作技能和观察分析能力。

二、实验材料和用具1. 实验大鼠（白化品系，雄性，约6个月龄）1只。

2. 解剖器械：解剖剪、解剖镊、解剖刀、解剖针、解剖盘等。

3. 实验用品：生理盐水、消毒液、棉签、纱布等。

4. 实验记录表格。

三、实验内容1. 实验前准备- 将实验大鼠置于解剖盘中，用棉签蘸取消毒液对大鼠进行全身消毒。

- 在大鼠背部进行编号，以便后续记录。

2. 大鼠骨骼解剖- 头部解剖：沿大鼠背部中线切开皮肤，暴露头骨。

用解剖剪剪开颅骨，观察大脑、颅神经、血管等结构。

- 躯干解剖：沿大鼠背部中线切开皮肤，暴露脊柱、胸骨、肋骨等。

观察脊柱的弯曲形态，胸骨和肋骨的连接方式。

- 四肢解剖：将大鼠四肢分别进行解剖。

观察四肢骨骼的形态、位置和相互关系，如肱骨、桡骨、尺骨、股骨、胫骨、腓骨等。

- 骨盆解剖：沿大鼠腹部中线切开皮肤，暴露骨盆。

观察骨盆的形态、大小和骨盆内的器官。

3. 骨骼肌解剖- 在大鼠背部和四肢分别进行骨骼肌解剖。

观察骨骼肌的附着点、形态和分布，如背阔肌、股四头肌、肱二头肌等。

四、观察步骤1. 观察头部骨骼：观察颅骨的形状、大小、厚度，颅神经和血管的走向。

2. 观察躯干骨骼：观察脊柱的弯曲形态、胸骨和肋骨的连接方式，脊柱的椎骨形态和大小。

3. 观察四肢骨骼：观察四肢骨骼的形态、位置和相互关系，如肱骨、桡骨、尺骨、股骨、胫骨、腓骨等。

4. 观察骨盆骨骼：观察骨盆的形态、大小和骨盆内的器官。

5. 观察骨骼肌：观察骨骼肌的附着点、形态和分布。

五、实验结果1. 大鼠颅骨为扁圆形，厚度适中，颅神经和血管走向清晰。

2. 躯干骨骼包括脊柱、胸骨、肋骨等，脊柱呈"S"形弯曲，胸骨和肋骨连接紧密。

3. 四肢骨骼包括肱骨、桡骨、尺骨、股骨、胫骨、腓骨等，骨骼形态规则，位置明确。

大鼠骨骼肌卫星细胞培养的研究张晨晖,朱道立＊　(南通大学生命科学学院,江苏南通226007)摘要　[目的]探讨在体外条件下骨骼肌卫星细胞纯化、培养、鉴定的方法及确定其生物学特性。

[方法]取新生大鼠的小腿肌肉,采用肌组织块和肌细胞培养两种方法。

分别用胰蛋白酶对培养中的肌组织块和肌细胞进行消化,采用离心及差速贴壁法纯化,得到更高纯度的大鼠骨骼肌肌卫星细胞,进行体外原代骨骼肌和传代骨骼肌的细胞培养。

传至第2代后,用分化培养基诱导分化,观察骨骼肌细胞各个阶段的形态特征并拍照。

[结果]此方法分离的细胞成活率较高,体外生长、增殖良好。

在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。

[结论]该实验成功探讨了新生大鼠骨骼肌卫星细胞的分化能力并建立了卫星细胞纯化方法,适用于开展细胞移植和肌组织工程方面的研究。

关键词　大鼠;骨骼肌;原代培养;传代培养;纯化中图分类号　S865.1+2 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2008)12-05004-03Study o n C ulture of the Skeletal Muscle Satellite Cells in the N eo nate R ats ZHA NG C hen -hui et al (School of Life Science ,Nantong University ,Nantong ,Jian gs u 226007)A bstract [Obective ]The methods of the p urification ,culture an d id entification an d th e biol ogical ch aracteristics of sk eletal mu scle s atellite cells in vitro were explore .[Met hod s ]Skeletal m uscle s pecim en s harvested from rats were used to d o pure tiss ue culture and m uscle cell culture .The s keletal muscle satellite cells were s ep arated with trypsin .The skeletal muscle satellite cells were obtained by centrifu ge and velocit y sed imentation ,th en the cellswere cul -tured an d s ub -cultured in vitro .The secondly cells were up -gro wn in the differentiation media .Morph ological observation was used and ph otos were taken in all stages .[Result ]Th e cells isolated by this method s howed strong proliferate abilit y in the proliferate media in vitro and could form myotu bes in differen -tiation media .[Concl usion ]In all ,a method for exploring the differentiation ab ility and t he purificati on techniq ue of satellite cell was establis hed success -full y ,which was useful for cell transpl antin g or muscle tis sue en gin eerin g .Key w ords R at ;S keletal muscle ;Primary culture ;Secondary culture ;Purification基金项目　南通大学第3批大学生课外学术科技作品立项课题(加13)。

骨骼肌线粒体的提取[160]麻醉取材，迅速分离相应骨骼肌，区分红肌和白肌。

分别用介质Ⅰ（0.12M KCl，20mM Hepes，5mM MgCl2，pH 7.4）冲洗肌组织两遍，剔除脂肪及结缔组织、置于盛有适量介质Ⅰ的小烧杯中，用剪刀剪碎，加100毫升介质I，分成4-5份，电动匀浆器匀浆1200转/分钟，上下三次，加40毫升介质I，0-4℃离心，600g离心10分钟，弃沉淀，上清用两层薄纱布过滤以去除脂肪，滤过液于17000g 离心10分钟，沉淀用5毫升介质Ⅰ悬浮，混匀，加入20毫升介质Ⅰ，7000g离心10分钟，沉淀悬浮在20毫升介质Ⅱ（0.3M Sucrose，2.0mM Hepes，0.1mM EDTA，2mg 脱脂BSA/ml，pH 7.4）中，3500g离心10分钟，沉淀悬浮于1毫升介质Ⅱ中。

以上操作均在冰浴中进行。

2.6心肌线粒体的提取在每一个运动时间点即刻断头处死，迅速取出心脏，用分离介质(0.25M Succose, 3.0mM Hepes, 0.5mM EDTA, pH 7.4)冲洗两遍，剔除脂肪及结缔组织、剪碎，加100ml分离介质，分成4-5份，电动匀浆器匀浆800转/min，上下三次，加40ml 分离介质，0-4℃离心，800g离心10min，弃沉淀，上清液于10000g离心10min，沉淀用1ml分离介质悬浮，混匀，加入20ml分离介质，10000g离心10min，沉淀悬浮于1ml分离介质中。

以上操作均在冰浴中进行。

大鼠肝脏线粒体的制备运动后即刻敲击鼠头部处死,迅速取出肝脏,置于冷生理盐水中洗净,称重后置于液氮中冷冻,低温保存待用。

采用同样的方法处死对照组动物并取样。

将样品在0～4 ℃放置10min ,然后将其移至预冷的匀浆缓冲液中剪碎,组织/ 缓冲液为1∶10 (w/ v) ,用电动匀浆器制备匀浆液。

匀浆缓冲液成分(mmol/ L) 为:蔗糖250 、Tris2HCl 5 、EDTA 1 、p H714 。