研究生课程-分子生物学-专题篇

3.专题篇 第十九章 基因诊断 基因诊断：以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在，结构缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。 基本原理：检测DNA或RNA的结构变化与否、量的多少及表达功能是否正常，确定受检者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病诊断的依据。 意义：不仅能对疾病作出早期和确切诊断，而且能确定个体对疾病的易感性及疾病的分期、分型、疗效监测、预后判断等。

第一节 基因诊断的技术方法 一、 常用的分子生物学技术 （一）核酸分子杂交 包括Southern blot; Northern blot; dot blot; in situ hybridization等 （二）聚合酶链式反应（PCR） 常与其他技术联合应用 （三）单链构象多态性检测（SSCP； single strand conformation polymorphism） 是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法，常与PCR联用，称PCR-SSCP. PCR产物变性后， 经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。 （四）限制酶酶谱分析 限制性片段长度多态性（RFLP；restrict fraction length polymorphinsm） （五）DNA序列测定 是进行基因突变检测最直接、最准确的方法，不仅可确定突变的位置，而且可确定突变的性质。 （六）DNA芯片技术 实际上是一种快速、敏感、高效、自动化的核酸杂交技术 二、 基因诊断的基本方法 特点: 1：特异性强检测特异性高达100% 2. 早期诊断 3. 灵敏度高 检测灵敏度达毫微微克(fg)水平 4. 取样方便 任一有核细胞均可作为检测样品

（一）基因突变的诊断 1、点突变的诊断 （1） 已知的点突变 可采用PCR/ASO（等位基因特异性寡核苷酸；allele specific oligonucleotide）探针法检测。 （2） 未知的突变 PCR-SSCP； DNA序列测定； DNA芯片技术；等 2、少数核苷酸缺少或插入 探针法 3、大片段丢失或插入 PCR； 多重PCR（因为常规PCR扩增2kb 以上的片段比较困难） 4、基因重排（染色体易位） PCR； 原位杂交（包括FISH）； 5、基因扩增 Southern blot（先用酶切，再作blot） （二）多态性分析 1、RFLP分析 （1） 限制酶酶谱直接分析法 （2） RFLP间接分析法 2、DNA重复序列多态性分析 （三）基因表达异常的诊断 1、mRNA相对定量分析 （1） 斑点或狭缝杂交 （2） RT-PCR 2、mRNA绝对定量分析 RT-PCR/竞争性PCR 3、mRNA长度分析 Northern blot （四）外源DNA检测 血清学等方法不够灵敏或特异，考虑用核酸分子杂交或PCR等技术，应用基因特异性探针或合成特异的寡核苷酸引物来检测。 第二节 肿瘤的基因诊断 一、 肿瘤基因诊断的策略 1、检测肿瘤相关基因 2、检测肿瘤相关病毒的基因 3、检测肿瘤标志物基因或mRNA

第二十章 基 因 治 疗 基因治疗  一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治疗方法。 基因治疗的主要策略  基因置换（gene replacement)或称基因矫正（gene correction）：特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。

 基因添加或称基因增补（gene angmentation）：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。  基因干预（gene interference）：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。 基因置换或基因添加的必要条件  对导入的基因及其产物有详尽的了解  外来基因能有效地导入靶细胞  导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留  导入基因能有适度水平的表达  基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害

 导入自杀基因－－细胞自杀效应 将自杀基因转移入宿主细胞中，该基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞“自杀”，清除肿瘤细胞。  基因修饰－－改变细胞功能 基因修饰肿瘤细胞的“疫苗”疗法 基因修饰TIL的过继免疫方法 免疫增强基因疗法 原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法  基因标记（gene labeling）：基因标记实验是基因治疗的前奏，并不在于直接治疗疾病而是期望能够提供有关正常细胞生物学和疾病病理方面的信息。

基因治疗基本上涉及三步  基因导入（administration）：把基因或把含有基因的载体导入机体。  基因传递（delivery）：基因从导入部位进入靶细胞核。  基因表达（expression）：细胞中治疗性基因产物的形成。

理想的基因治疗载体具备的性质  易于进入靶细胞。  在特异细胞或组织达到有规律、充分及持续的外源基因表达。  外源基因应含或整合于基因组活化区内或能自主复制的构件。  整个过程应安全有效并具有选择性。  易于大量生产。

基因治疗载体的选择（考虑因素）  靶细胞或靶组织  疾病类型  期望是否持续或短暂表达  所要求的基因表达水平  体内或回体基因治疗  安全性：风险效应比。

病毒载体具备的条件  携带外源基因并能包装成病毒颗粒  介导外源基因的转移和表达  对机体不致病

病毒载体类型  重组型病毒载体:以完整的病毒基因组为改造对象，选择性删除病毒的某些必需基因（早期基因、控制表达的基因），缺失的功能由互补细胞反式提供；利用同源重组方法将适当长度的外源基因插入病毒基因组的非必需区,不改变病毒复制和包装所需的顺式元件。  无病毒基因的病毒载体：由载体质粒和辅助系统组成。载体质粒：由外源基因表达盒、病毒复制和包装所必需的顺式作用元件及质粒骨架组成；辅助系统：由病毒复制和包装所必需的反式作用元件组成

逆转录病毒载体  优点：高效地感染分裂的宿主细胞（100%）；在感染后，逆转录病毒能够将前病毒基因组稳定地整合到宿主基因组的随机位点上；利用重组逆转录病毒能将目的DNA传递给整个细胞群体；逆转录病毒载体可感染多种人和动物的细胞，宿主范围非常广；不产生任何有免疫原性的病毒蛋白，对宿主细胞无毒性作用，可建立细胞系长期持续表达外源基因。  缺点：只能整合至分裂相的细胞；容量小（不超10kb)；病毒滴度不高；由于其随机整合，有激活癌基因的潜在危险。

腺病毒载体  优点：转染效率高、安全；宿主范围广，与细胞分裂无关；容量大，制备较易，病毒滴度较高。  缺点:不能整合到染色体,表达时间短暂(1-6周);具有免疫原性;反复治疗效率降低;缺陷病毒可与宿主基因组或其它病毒发生重组,产生危险系数高的新病毒

腺相关病毒  优点:是非病原微生物,未发现野生型AAV与人类疾病有关;它既能感染分裂细胞,又能感染非分裂细胞;宿主范围广,能感染多种宿主细胞;插入突变的危险性相当低。  缺点：只能包装小于5kb的目的基因片段，相对转基因能力受限；整合时需要辅助病毒感染才能进行复制，增加包装的难度；很难大量生产。

单纯疱疹病毒载体  优点：HSV载体能携带30-50kb的外源基因，可在多种细胞中复制；能感染分裂和非分裂细胞，对神经细胞易感。  缺点：病毒不能整合入宿主细胞染色体，只能短暂表达；对感染的细胞产生毒性作用。

基因治疗的非病毒载体  非病毒方法是依赖细胞机制将DNA导入细胞进而转移至细胞核。  与病毒载体相比非病毒载体的优点：对受转移的DNA大小没有限制；DNA容易进行操作，对于包装与复制需要的病毒序列没有特殊要求；比构建的病毒载体安全，不可能诱发任何感染；免疫源性问题少。 理想的非病毒DNA传递系统应具备的性质：  已知结构及成分  在生物液体中，传递系统的稳定性受到复合物成分的控制  细胞摄取受细胞特异性浆膜受体的控制  能迅速从内容泡中释放（依赖于pH值）  能有效地脱包膜并经细胞质运输DNA  DNA的核摄取充分  能达到所期望的持续表达

核酶（ribozyme）  RNA组成的酶  可催化RNA切割和RNA剪接反应。  结构：锤头状和发夹状。  具有催化RNA切割的核酶可作为基因表达和病毒复制的抑制剂，目前已被开发用于基因治疗。

三链DNA（triple-strand DNA）  当某一DNA或RNA寡核苷酸与DNA高嘌呤区结合时可形成三链。  三链形成寡核苷酸（triple-forming oligonucleotide，TFO）能特异地结合在DNA大沟中，并与富含嘌呤链上的碱基形成Hoogsteen氢键。  TFO与靶DNA的结合具有高度序列特异性，这是三链DNA的应用基础。 TFO的作用机制：基因调控区形成三链DNA后抑制基因转录

基因治疗的疾病 遗传病的基因治疗  在DNA水平明确其发病原因及机制