研究生分子生物学实验讲解

分 子 生 物 学 实 验 讲 义内蒙古科技大学数理与生物工程学院自治区基础生物实验示范中心基础生物教学部2009年10月目录实验一质粒DNA的小量提取实验二琼脂糖凝胶电泳实验三大肠杆菌感受态细胞的制备实验四大肠杆菌感受态细胞转化宿主细胞实验五聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片断实验六重组DNA分子的构建实验七质粒DNA的酶切和电泳鉴定实验八植物基因组DNA的提取实验九植物基因组总RNA的提取实验十与人类遗传病相关的核苷酸重复序列的克隆实验一 质粒DNA的小量提取一、目的要求1、掌握用碱变性法提取质粒DNA的技术2、掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法二、基本原理在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb 之间，是双链闭合环状的DNA分子。

在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。

碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA 的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。

当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。

通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

三、仪器、材料和试剂（一）仪器微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计（二）材料含有质粒的大肠杆菌DH5a（三）试剂及溶液LB培养基、葡萄糖1、用于碱法提取质粒DNA的溶液溶液1（GET）缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HClpH8.0，用前加溶菌酶4mg/Ml。

2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。

为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。

操作步骤：1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。

2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。

3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。

4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。

5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。

6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。

7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。

8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。

注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。

3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。

（二）反转录实验安排：每人做一管。

反应体系（20μl）：按下列顺序加样反应条件：42℃ 1h注意事项：1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。

如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。

2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。

3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。

实验一植物基因组DNA的分离一、相关知识分离植物DNA是分子生物学实验的一个基本要求。

不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。

例如，在构建用于筛选植物基因或其他诸如RFLP这样的遗传标记基因组DNA文库时，需要使用高相对分子质量、高纯度的DNA；而在进行遗传分析时，对DNA的纯度要求就可以低一些。

一般而言，一个好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准：（1）所得DNA的纯度应满足下游操作的要求，用于RFLP分析的DNA，其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交；用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物；（2）所得DNA应当完整，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型；（3）所得的DNA应有足够的量。

如果对植物进行大规模筛选，还应当满足操作程序应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂这样的要求。

二、实验原理植物DNA的提取程序应包括以下几项：首先，必须粉碎（或消化）细胞壁以释放出细胞内溶物。

分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉；或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉沫。

其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中，这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。

去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。

通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。

最后，一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。

剧烈振荡或Tip头小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。

分离高相对分子质量的DNA还只是工作的一部分。

因为在粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。

大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNase除去。

但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，往往用一些DNA纯化试剂盒来进一步纯化DNA。

实验质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA, 大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份, 通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态, 但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上, 随着染色体的复制而复制, 并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子, 重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取, 本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法, 其基本原理为: 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时, 蛋白质与DNA发生变性, 当加入中和液后, 质粒DNA分子能够迅速复性, 呈溶解状态, 离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状, 离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如, 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法, 但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA, 经过苯酚、氯仿抽提, RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA, 所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求, 故在分子生物学实验室中常用。

二、实验试剂1.溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0）。

1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml, 0.5M EDTA（pH 8.0）10ml, 葡萄糖4.730g, 加ddH2O至500ml。

在10 lbf/in2高压灭菌15min , 贮存于4℃。

2.溶液Ⅱ: 0.2N NaOH, 1% SDS。

2N NaOH 1ml, 10%SDS 1ml, 加ddH2O至10ml。

分子生物学实验报告重组质粒的pcr验证（目的基因的pcr扩增）姓名:xxx学号：xxx专业：xxx界别：xxx同组者：xxxx一．实验目的（1）自学掌控pcr反应的基本原理和实验技术。

（2）了解引物设计的基本要求。

1.pcr基本原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)，简称pcr，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增dna，类似dna的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链dna变性为单链dna、单链dna能与引物复性（退火）成为引物-dna单链复合物、以及在dntps存在下dna聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链dna（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个pcr循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量的要扩增的dna片段。

pcr技术的基本原理类似dna的天然激活过程，其特异性依赖与靶序列两端优势互补的寡核苷酸引物。

pcr由变性--淬火--延展三个基本反应步骤形成：①模板dna的变性：模板dna经加热至90~95℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的淬火(复性)：模板dna经冷却变性成单链后，温度降到55℃左右，引物与模板dna单链的优势互补序列接合融合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的复制链。

经过“变性—淬火—延展”三个过程就可以赢得代莱dna分子，而且这种崭新dna分子又可以沦为下次循环的模板。

因此，变性、淬火和延展循环反复25~30次后，即可从少量的模板dna中扩充出来大量的目的产物。

pcr引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板dna序列，因此，引物的优劣直接关系到pcr的特异性与成功与否。

分子生物学实验指导分子生物学实验课程的内容是从亚克隆一个基因直到最终表达出该基因产物的一个完整的科研项目。

以表达纳豆激酶为例，从已经克隆在pMD-18-T载体上的纳豆激酶酶原基因上用PCR扩增出837bp的纳豆激酶成熟肽基因片段，与T载体连接后转入DH5 菌中筛选鉴定，然后用双酶切下纳豆激酶成熟肽基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-Trx，在表达菌BL(21)DE3中诱导表达出纳豆激酶蛋白质并用SDS-PAGE鉴定。

整套实验围绕纳豆激酶基因的亚克隆、重组、转化、筛选直到表达这一研究顺序进行操作。

其间共涉及学习约11种基因操作的基本技术，我们按这些操作技术出现的先后顺序分别编为实验一至实验十一。

各个实验之间具有很强的逻辑性和连贯性，前一个实验的结果就是下一个实验的原料。

整套实验设计实际上是一个基因操作实验平台，随时能根据需要更改外源基因和表达载体或进一步扩充实验内容。

我们在每年的教学实践中会不断增加目的基因和表达载体的种类，以便于学生实验小组能够从事不同的项目，减少雷同，增加兴趣。

分子生物学实验的宗旨是让学生在独立实践操作中学习分子生物学的基本研究方法和体会分子生物学研究的严密逻辑和科研理念。

实验教学的组织方式是科研项目式管理，即在教师的总体指导下，在给定的实验材料和实验条件的基础上，让学生独立思考、自行规划实验流程、制定实验计划、准备实验材料、动手操作、整理和分析实验结果，最后完成实验项目，写出实验论文。

因此学生在实验前要认真预习实验内容，结合学过的分子生物学原理，弄懂每一步实验的目的和原理，了解实验的内容和总体实验方案，写出分子生物学大实验《开题报告》，交教师审阅和讨论修改后才能进入实验室操作。

在实验过程中，教师不干涉学生的实验安排和操作程序，仅以导师的身份对学生的实验操作进行现场巡回指导、回答学生的疑问、为学生示范一些高档实验仪器和软件的使用，提供公用的试剂（如酶）等，并对学生的每一步实验结果进行评价和把关。

硕士研究生分子生物学及生化实验技术路线：HindIIIBamHIFGF9FGF 的PCR 扩增、回收HindIII 连接、转化BL21（DE3）阳性克隆的PCR 鉴定＋BamHI 酶切、回收HindIII ＋BamHI 酶切、回收pET30a(+) 质粒提取阳性克隆的酶切鉴定阳性克隆的诱导培养 目标蛋白的纯化一、感受态细胞的制备1．实验材料及试剂受体菌：BL21（DE3）、质粒pET-30a＋转化液：50mM CaCl2培养基：LB培养基(pH7.0) 121℃，20min 高压灭菌NaCl 5g/L酵母提取物5g/L胰蛋白胨10g/L2.．实验步骤1. 感受态细胞的制备1）活化的BL21（DE3）平板上挑取一单菌落，接种于100mL LB液体培养基中37℃振荡培养过夜。

2）取培养过夜的菌液100μL接种于100ml新鲜的LB培养基中，37℃振荡培养约5h。

3）每组取2支10ml离心管，各转入8ml菌液，4000r/min离心3min，收集菌体。

4）弃去上清液，在涡旋器上将细胞悬浮于冰冷的2mL 50mmol/L CaCl2溶液中，将2管合并为1管，并在冰上放置15-30min。

4000r/min离心3min。

5）弃去上清液，加入1ml冰冷的50mmol/L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，置冰上，即制成了感受态细胞悬液，可直接用于转化实验，也可加入占总体积20%左右高压灭菌过的甘油，混合后分装于Eppendorf管中，置于-70℃条件下，可保存6-12个月。

二、FGF的PCR扩增与回收（一）试剂电泳缓冲液（50×TAE）Tris 242g冰醋酸 57.1mlEDTA(0.5mol/L pH8.0) 100ml使用时用蒸馏水稀释50倍。

DNA快速纯化/回收试剂盒（二）方法1.PCR反应条件目的基因模板来源于质粒pcDNA3.1-FGF，将质粒稀释100倍，PCR反应采用50μl反应体系。

分子生物学实验教学教案一、实验原理1. 介绍分子生物学的定义和基本概念，理解分子生物学实验的目的和意义。

2. 掌握DNA提取、PCR扩增、DNA测序、基因克隆、蛋白质表达和纯化等基本实验技术。

3. 了解各种实验试剂的使用方法、实验仪器的操作和维护。

二、实验内容1. DNA提取与纯化2. PCR扩增目的基因3. DNA测序4. 基因克隆与载体构建5. 蛋白质表达与纯化三、实验材料与试剂1. 实验材料：细胞样本、DNA提取试剂、PCR反应体系、DNA测序试剂、基因克隆试剂、表达载体、细菌和酵母等。

2. 试剂：蛋白酶K、NaCl、EDTA、DNase、PCR酶、DNA连接酶、限制性内切酶、琼脂糖、DNA胶回收试剂、SDS等。

四、实验步骤与操作要点1. DNA提取与纯化：(1) 细胞裂解：向细胞样本中加入蛋白酶K和NaCl，充分混合后置于55-60℃水浴中保温1-2小时。

(2) 蛋白质去除：向上述混合物中加入SDS和DNase，充分混合后置于65℃水浴中保温1小时。

(3) DNA沉淀：向上述混合物中加入体积分数为70%的冷酒精，充分混合后置于-20℃冰箱中沉淀1小时。

(4) DNA纯化：将沉淀的DNA用70%的冷酒精洗涤两次，用无水酒精洗涤一次，空气中晾干。

2. PCR扩增目的基因：(1) 配制PCR反应体系：含DNA模板、引物、dNTPs、PCR酶等。

(2) PCR扩增：将反应体系置于PCR仪中，进行高温变性、低温复性和中温延伸等步骤。

(3) 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

3. DNA测序：(1) 制备DNA测序模板：将PCR产物经过纯化后，作为测序模板。

(2) 进行DNA测序：使用DNA测序试剂和测序仪进行测序。

(3) 分析测序结果。

4. 基因克隆与载体构建：(1) 将目的基因插入到表达载体中。

(2) 将重组载体转化到细菌或酵母等宿主细胞中。

(3) 筛选和鉴定重组子。

5. 蛋白质表达与纯化：(1) 将重组质粒转化到表达菌株中，进行蛋白质表达。

分⼦⽣物学实验报告全解（有图有真相）讲解分⼦⽣物学实验报告慕蓝有志班梦想学院⽬录实验⼀细菌的培养 (2)实验⼆质粒DNA的提取 (4)实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (7)实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (9)实验五聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (11)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (14)实验七RNA分离与纯化 (17)实验⼋RT-PCR扩增⽬的基因cDNA (19)实验九质粒载体和外源DNA的连接反应 (21)实验⼗感受态细胞的制备及转化 (23)实验⼗⼀克隆的筛选和快速鉴定 (25)实验⼗⼆地⾼⾟标记的Southern杂交 (27)实验⼗三阿拉伯糖诱导绿⾊荧光蛋⽩的表达 (31)思考题 (32)分⼦实验⼼得总结 (33)实验⼀细菌的培养⼀、⽬的学习细菌的培养⽅法及培养基的配置。

⼆、原理在基因⼯程实验和分⼦⽣物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。

质粒的保存、增殖和转化；基因⽂库的建⽴等都离不开细菌。

特别是常⽤的⼤肠杆菌。

⼤肠杆菌是含有长约3000kb的环状染⾊体的棒状细胞。

它能在仅含碳⽔化合物和提供氮、磷和微量元素的⽆机盐的培养基上快速⽣长。

当⼤肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进⼊⼀个滞后期。

然后进⼊对数⽣长期，以20~30min复制⼀代的速度增殖。

最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速⽣长的浓度时，菌体密度就达到⼀个⽐较恒定的值，这⼀时期叫做细菌⽣长的饱和期。

此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。

培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。

实验室中最常⽤的是LB培养基。

三、实验材料、试剂与主要仪器（⼀）实验材料⼤肠杆菌（⼆）试剂1. 胰蛋⽩胨2. 酵母提取物3. 氯化钠4. 1mol/L NaOH5. 琼脂粉6. 抗⽣素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1. 培养⽫2. 带帽试管3. 涂布器4. 灭菌锅5. ⽆菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌⽛签等）6. 恒温摇床四、操作步骤（⼀）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离⼦⽔中加⼊：细菌培养⽤胰蛋⽩胨10g细菌培养⽤酵母提取物5gNaCl 10g摇动容器直⾄溶质完全溶解，⽤1mol/L NaOH调节pH位⾄7.0。