SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍

抑制性减法杂交技术1996年，L. Diatchebko在RDA的基础上建立了抑制性减法杂交（supression subtractive hybridization, SSH）技术，该技术是RDA技术的发展，能有效克服RDA或cDNA RDA技术难以解决的问题，如两者不能用于分离两组基因表达差异较小的基因，也不能用于研究存在上调表达的基因等。

(1) SSH的主要原理SSH的核心技术是抑制性PCR (suppression PCR )，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。

其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。

因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异cDNA的概率，简化了对消减文库的分析。

抑制PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，使非目标序列片段两端的长反向重复序列(long inverted repeats)在复性时产生“锅柄样”(panhandle-like）结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。

同时，根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA复性时产生同源杂交速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度存在差异的cDNA相对含量趋于基本一致。

（2）SSH的基本过程如图所示，SSH的主要步骤包括：限制性核酸内切酶切割，产生大小适当的平头末端cDNA片段。

②将检测cDNA分成均等的两份，分别接上接头1或接头2,接头（adaptor)由一长链(40nt)和一短链(l0nt)组成的一端是平末端的双链cDNA分子。

长链3′端与cDNA5′端相连。

长链外侧序列（约20nt）与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。

此外，接头上含有升启动子序列及内切酶识别位点（如Not I, Srf I, Sma I和Xba I等），为以后将该片段插入克隆载体和测序提供便利。

抑制性消减杂交技术（ＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎＳｕｂｔｒａｃｔｉｖｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ）是Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ等于１９９６年依据消减杂交和抑制ＰＣＲ发展起来的一种分离差异表达基因的新方法［１，２］，该技术具有假阳性率低、筛选效率高、操作简单等优点，特别适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。

而消减文库是使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料（如同类菌种的高产、低产品系），提取ｍＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ，在一定条件下用大大过量的不含目的基因的一方作为驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ），与含有目的基因的试验方（Ｔｅｓｔｅｒ）进行杂交，选择性的去除两部分共同基因杂交形成的复合物，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，连接到载体形成文库。

高等真核生物的所有生命现象，例如细胞生长、器官形成、恶性转化、特定代谢产物分泌等都是基因选择性表达的结果，要弄清这些生命现象的分子调节机制，就要对选择性表达的基因进行分离、克隆、序列分析，然后研究其氨基酸组成，表达产物的结构功能。

抑制性消减杂交技术为寻找表达基因和研究已知基因的新生物学功能提供了一个有利工具。

１ＳＳＨ的基本原理与过程［３，４］１．１提取样本ｍＲＮＡ，利用随机引物反转录为双链ｃＤＮＡ，将不含目的基因的一方作为驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ），含有目的基因的样品称为试验方（Ｔｅｓｔｅｒ）。

１．２用识别四碱基的限制性内切酶ＲｓａＩ（或ＨａｅⅢ）酶切。

双链ｃＤＮＡ经酶切后，每个片段一般小于６００ｂｐ，可防止长链ｃＤＮＡ片段所形成的复杂结构干扰消减杂交。

１．３将ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ分成两组（１和２），分别于其５′端接上去磷酸化的接头１和接头２（ａｄａｐｔｏｒ１，ａｄａｐｔｏｒ２）。

两接头分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，由一长链（约４０余个核苷酸）和一短链（约１０余个核苷酸）组成的双链ＤＮＡ片段，长链外侧２０余个核苷酸序列与第一次ＰＣＲ引物序列相同，而内侧序列与第二次ＰＣＲ引物序列相同。

・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第5期抑制性消减杂交技术的应用李小庆　景志忠(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046) 摘　要:　基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容。

在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH )技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中。

近年来,抑制性消减杂交(SSH )技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展。

主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述。

关键词:　抑制性消减杂交　差异表达　功能基因　DS N 均一化技术　c DNA 微阵列Suppressi on Subtracti ve Hybr i di zati on Techn i que andProgress i n the Appli cati onL i Xiaoqing Jing Zhizhong(Lanzhou Veterinary R esearch Institute CAAS,Key Laboratory of Ani m al Parasitology of Gansu P rovince,Key Laboratory of Veterinary PublicHealth of M inistry of Agriculture,S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,Lanzhou 730046) Ab s trac t:　D ifferential exp ressi on of genes is the centralmolecular mechanis m of regulating all kinds of life acti ons 1Among all thetechnol ogies of identifying differential exp ressed genes,supp ressi on subtractive hybridizati on (SSH )is considered t o be with high s peci 2ficity,l ow backgr ound,high sensitivity,convenient mani pulati on,and had been widely app lied in life science and medicine research fields 1I n this paper,the p rinci p le,method,characteristics and the research p r ogress of SSH technique were intr oduced 1Key wo rd s:　Supp ressi on subtractive hybridizati on D ifferential exp ressi on Functi onal genes DS N (dup lex 2s pecific nuclease )2nor malizati on method c DNA m icr oarray收稿日期:2008211211基金项目:国家自然科学基金项目(30871884),国家高新技术“863”项目(2006AA10A203),甘肃省支撑计划项目(0804NKCA076)作者简介:李小庆(19832),男,硕士,专业方向:畜禽疫病的分子生物学与免疫学通讯作者:景志忠,博士,研究员,主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究;E 2mail:zhizhongj@yahoo 1com 1cn 上世纪90年代以来,随着分子生物学技术的快速发展以及多物种包括人类的基因组全序列测定计划的陆续完成,分子生物学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能和表达调控的功能基因组研究,于是多种用于差异表达分析的基因克隆技术相继问世。

1 PolyA+ mRNA的分离纯化PolyA+ mRNA的分离纯化采用Oligotex TM m RNA试剂盒(Qiagen公司)，首先确定总RNA的数量(OD260×40 µg/mL×稀释倍数×v)在250～500 µg之间，加无RNase的水至总体积为500 µL，然后再加入500 µL的Bufer OBB和30 µL的Oligotex悬液，通过吹打或轻弹使其充分混合。

在基因扩增仪上，70℃温浴样品3 min,(此时洗脱缓冲液OEB可一起预热)然后从水浴中将样品取出，室温(20--30℃)放置10 m in。

最大转速(140 00g )离心2m in，使Oligotex:mR NA的复合物沉淀，然后仔细的除去上清液。

保存上清液直到得到满意的结果。

用400 µL的洗涤缓冲液OW2通过涡旋振荡或吹打重悬Oligotex:mRNA沉淀，将重悬的样品加入到Small spin column(置于1.5 mL的离心管上)中，140 00g 离心1m in，然后将small spin column转移到一新的1.5 mL的无RNase的微量离心管中，再加入400 µL的洗涤缓冲液OW2于small spin cloumn,混匀，140 00g 离心1m in。

转移small spin column到一新的无RNase的1.5 mL的微量离心管中;取15 µL洗脱缓冲液OEB重悬Oligotex,14 0 00g 离心1m in。

将甩下的洗脱缓冲液OEB再重悬Oligotex,最高速离心，然后将甩下的洗脱缓冲液OEB转移至0.5 mL的离心管(无RNase )中，体积约10 µL左右。

重复洗脱三次，共计回收4管mRNA，最后几管测吸光值，看是否洗脱干净。

测OD 值，取1 µL 样品，加99 µL无RNase的水稀释，将样品从稀到浓进行OD260和OD280的测定，计算出mRNA的量(mRNA的含量>1 µg/µL). mRNA在洗脱液中可以贮存在-20 ℃或-70 ℃。

Proc. Natl. Acad. Sci. USAVol. 93, pp. 6025–6030, June 1996Biochemistry抑制性消减杂交：生成差异调控或组织特异性cDNA探针和文库的方法L UDA D IATCHENKO*, Y UN-F AI C HRIS L AU†, A ARON P. C AMPBELL†, A LEX C HENCHIK*, F AUZIAM OQADAM*, B ETTY H UANG*, S ERGEY L UKYANOV‡, K ONSTANTIN L UKYANOV‡, N ADYA G URSKAYA‡,E UGENE D. S VERDLOV‡, AND P AUL D. S IEBERT*摘要一种高效消减cDNA文库构建的新方法，抑制性消减杂交（SSH），已被开发。

它是基于最近报道的抑制性PCR，并整合了常规和消减步骤。

常规PCR步骤使所有目标cDNA的丰度都达到同一水平，消减步骤则排除了检测子与驱赶子共有的序列。

在一个标准系统中，SSH技术能够在一轮消减杂交中富集稀有cDNA达1000倍以上。

我们通过构建一个睾丸特异性cDNA文库和用消减cDNA混合物作为杂交探针鉴定人类Y染色体粘粒文库中的同源序列证实了这一技术的有效性。

人类DNA在分离粘粒的插入，进一步确证了它在睾丸中特异性表达的方式。

这一结果表明SSH技术可应用于许多分子遗传和定位克隆研究，来鉴定疾病，发育和组织特异性或差异表达的基因。

正文在高等真核细胞中，例如细胞生长，器官形成等生物学过程都受控于基因表达的不同。

要弄清调控这些过程的分子机制，必须鉴定，克隆和深入研究相关的差异表达基因（1－3）。

消减cDNA杂交是鉴定和分离差异表达基因cDNA强有力的方法。

至今，已有大量的cDNA消减方法见于报端。

概括而言，它们都涉及用一种（检测子）cDNA与另一种（驱赶子）过剩的mRNA（cDNA）杂交，然后从杂交的共有序列中分离出不杂交的片断（目标片断）的方法。

SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍SSH抑制性消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization，简称SSH）文库构建是一种用来富集和表达特定基因的方法。

它可以用于比较两种样品中的差异基因，以便进一步研究其功能和调控机制。

下面将介绍SSH文库构建的步骤及相关注意事项。

1.SSH文库构建的原理：SSH文库构建过程中，通过对目标样品和参考样品进行两轮的杂交和选择，可以移除两者之间相似的序列，从而富集出两者之间差异的序列。

这是通过抑制性消减和杂交的方式实现的。

第一轮杂交可以提取出高表达的差异基因，第二轮杂交可以进一步筛选出表达量更低的差异基因。

2.SSH文库构建的步骤：（1）制备目标DNA和参考DNA：从目标样品中提取总RNA，合成cDNA；从参考样品中提取总RNA，合成cDNA。

（2）第一轮杂交：将目标cDNA和参考cDNA进行杂交。

可根据实验要求对目标和参考cDNA进行标记，如将目标cDNA用偶联荧光物标记为红色，参考cDNA用偶联荧光物标记为绿色。

（3）第一轮选择：通过差异表达的双链RNA（dsRNA）的特性，使用RNAse H酶将dsRNA降解，保留差异表达的单链RNA（ssRNA），并与固相矩阵连接。

（4）第二轮差异杂交：将第一轮杂交产物与参考cDNA进行杂交，反转标记荧光物，即将红色标记转为绿色，绿色标记转为红色。

（5）第二轮选择：采用同样的方法将差异表达的ssRNA连接到固相矩阵上。

（6）PCR扩增：对固相矩阵上连接的差异基因进行PCR扩增，得到SSH文库。

3.注意事项：（1）杂交温度和时间：根据不同实验需求，可以调整杂交温度和时间，以保证高效的结合。

一般来说，较高的温度（如68℃）可以提高特异性结合。

（2）选择条件：选择条件要严格控制，以保证只有差异表达的ssRNA被固定在固相矩阵上。

（3）PCR扩增条件：PCR扩增过程中，应根据实验需求选择适当的引物和PCR条件，以获得高效的文库扩增。

[转载]基因⽂库构建的过程、原理及⽅法原⽂地址：基因⽂库构建的过程、原理及⽅法作者：蓝茶基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。

经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。

其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。

由于 RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。

在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。

这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。

1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。

为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。