抑制消减杂交SSH步骤

抑制性减法杂交技术1996年，L. Diatchebko在RDA的基础上建立了抑制性减法杂交（supression subtractive hybridization, SSH）技术，该技术是RDA技术的发展，能有效克服RDA或cDNA RDA技术难以解决的问题，如两者不能用于分离两组基因表达差异较小的基因，也不能用于研究存在上调表达的基因等。

(1) SSH的主要原理SSH的核心技术是抑制性PCR (suppression PCR )，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。

其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。

因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异cDNA的概率，简化了对消减文库的分析。

抑制PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，使非目标序列片段两端的长反向重复序列(long inverted repeats)在复性时产生“锅柄样”(panhandle-like）结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。

同时，根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA复性时产生同源杂交速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度存在差异的cDNA相对含量趋于基本一致。

（2）SSH的基本过程如图所示，SSH的主要步骤包括：限制性核酸内切酶切割，产生大小适当的平头末端cDNA片段。

②将检测cDNA分成均等的两份，分别接上接头1或接头2,接头（adaptor)由一长链(40nt)和一短链(l0nt)组成的一端是平末端的双链cDNA分子。

长链3′端与cDNA5′端相连。

长链外侧序列（约20nt）与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。

此外，接头上含有升启动子序列及内切酶识别位点（如Not I, Srf I, Sma I和Xba I等），为以后将该片段插入克隆载体和测序提供便利。

・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第5期抑制性消减杂交技术的应用李小庆　景志忠(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046) 摘　要:　基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容。

在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH )技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中。

近年来,抑制性消减杂交(SSH )技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展。

主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述。

关键词:　抑制性消减杂交　差异表达　功能基因　DS N 均一化技术　c DNA 微阵列Suppressi on Subtracti ve Hybr i di zati on Techn i que andProgress i n the Appli cati onL i Xiaoqing Jing Zhizhong(Lanzhou Veterinary R esearch Institute CAAS,Key Laboratory of Ani m al Parasitology of Gansu P rovince,Key Laboratory of Veterinary PublicHealth of M inistry of Agriculture,S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,Lanzhou 730046) Ab s trac t:　D ifferential exp ressi on of genes is the centralmolecular mechanis m of regulating all kinds of life acti ons 1Among all thetechnol ogies of identifying differential exp ressed genes,supp ressi on subtractive hybridizati on (SSH )is considered t o be with high s peci 2ficity,l ow backgr ound,high sensitivity,convenient mani pulati on,and had been widely app lied in life science and medicine research fields 1I n this paper,the p rinci p le,method,characteristics and the research p r ogress of SSH technique were intr oduced 1Key wo rd s:　Supp ressi on subtractive hybridizati on D ifferential exp ressi on Functi onal genes DS N (dup lex 2s pecific nuclease )2nor malizati on method c DNA m icr oarray收稿日期:2008211211基金项目:国家自然科学基金项目(30871884),国家高新技术“863”项目(2006AA10A203),甘肃省支撑计划项目(0804NKCA076)作者简介:李小庆(19832),男,硕士,专业方向:畜禽疫病的分子生物学与免疫学通讯作者:景志忠,博士,研究员,主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究;E 2mail:zhizhongj@yahoo 1com 1cn 上世纪90年代以来,随着分子生物学技术的快速发展以及多物种包括人类的基因组全序列测定计划的陆续完成,分子生物学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能和表达调控的功能基因组研究,于是多种用于差异表达分析的基因克隆技术相继问世。

1 PolyA+ mRNA的分离纯化PolyA+ mRNA的分离纯化采用Oligotex TM m RNA试剂盒(Qiagen公司)，首先确定总RNA的数量(OD260×40 µg/mL×稀释倍数×v)在250～500 µg之间，加无RNase的水至总体积为500 µL，然后再加入500 µL的Bufer OBB和30 µL的Oligotex悬液，通过吹打或轻弹使其充分混合。

在基因扩增仪上，70℃温浴样品3 min,(此时洗脱缓冲液OEB可一起预热)然后从水浴中将样品取出，室温(20--30℃)放置10 m in。

最大转速(140 00g )离心2m in，使Oligotex:mR NA的复合物沉淀，然后仔细的除去上清液。

保存上清液直到得到满意的结果。

用400 µL的洗涤缓冲液OW2通过涡旋振荡或吹打重悬Oligotex:mRNA沉淀，将重悬的样品加入到Small spin column(置于1.5 mL的离心管上)中，140 00g 离心1m in，然后将small spin column转移到一新的1.5 mL的无RNase的微量离心管中，再加入400 µL的洗涤缓冲液OW2于small spin cloumn,混匀，140 00g 离心1m in。

转移small spin column到一新的无RNase的1.5 mL的微量离心管中;取15 µL洗脱缓冲液OEB重悬Oligotex,14 0 00g 离心1m in。

将甩下的洗脱缓冲液OEB再重悬Oligotex,最高速离心，然后将甩下的洗脱缓冲液OEB转移至0.5 mL的离心管(无RNase )中，体积约10 µL左右。

重复洗脱三次，共计回收4管mRNA，最后几管测吸光值，看是否洗脱干净。

测OD 值，取1 µL 样品，加99 µL无RNase的水稀释，将样品从稀到浓进行OD260和OD280的测定，计算出mRNA的量(mRNA的含量>1 µg/µL). mRNA在洗脱液中可以贮存在-20 ℃或-70 ℃。

SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍SSH抑制性消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization，简称SSH）文库构建是一种用来富集和表达特定基因的方法。

它可以用于比较两种样品中的差异基因，以便进一步研究其功能和调控机制。

下面将介绍SSH文库构建的步骤及相关注意事项。

1.SSH文库构建的原理：SSH文库构建过程中，通过对目标样品和参考样品进行两轮的杂交和选择，可以移除两者之间相似的序列，从而富集出两者之间差异的序列。

这是通过抑制性消减和杂交的方式实现的。

第一轮杂交可以提取出高表达的差异基因，第二轮杂交可以进一步筛选出表达量更低的差异基因。

2.SSH文库构建的步骤：（1）制备目标DNA和参考DNA：从目标样品中提取总RNA，合成cDNA；从参考样品中提取总RNA，合成cDNA。

（2）第一轮杂交：将目标cDNA和参考cDNA进行杂交。

可根据实验要求对目标和参考cDNA进行标记，如将目标cDNA用偶联荧光物标记为红色，参考cDNA用偶联荧光物标记为绿色。

（3）第一轮选择：通过差异表达的双链RNA（dsRNA）的特性，使用RNAse H酶将dsRNA降解，保留差异表达的单链RNA（ssRNA），并与固相矩阵连接。

（4）第二轮差异杂交：将第一轮杂交产物与参考cDNA进行杂交，反转标记荧光物，即将红色标记转为绿色，绿色标记转为红色。

（5）第二轮选择：采用同样的方法将差异表达的ssRNA连接到固相矩阵上。

（6）PCR扩增：对固相矩阵上连接的差异基因进行PCR扩增，得到SSH文库。

3.注意事项：（1）杂交温度和时间：根据不同实验需求，可以调整杂交温度和时间，以保证高效的结合。

一般来说，较高的温度（如68℃）可以提高特异性结合。

（2）选择条件：选择条件要严格控制，以保证只有差异表达的ssRNA被固定在固相矩阵上。

（3）PCR扩增条件：PCR扩增过程中，应根据实验需求选择适当的引物和PCR条件，以获得高效的文库扩增。

抑制差减杂交（SSH）抑制差减杂交技术运用了杂交二级动力学原理,即高丰度的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度快于低丰度的单链cDNA,在试验组(tester)和驱动组(driver)的cDNA变性后再复性的过程中,原来在丰度上有差别的单链cDNA达到均一化。

同时,由于试验组的cDNA在进行杂交之前等分的两份加有不同的接头,因此杂交时将产生5种不同类型的分子a、b、c、d和e(图1),当采用与两个不同接头序列互补的引物进行PCR扩增时,只有目标序列得到有效扩增,非目标序列因两端存在反向重复序列,退火时易产生类似”锅柄”的结构,无法与引物配对,扩增受到抑制。

抑制差减杂交(SSH)技术的主要步骤有:(1)cDNA的合成与酶切;(2)试验组cDNA分成两份,并与两个不同的接头连接;(3)试验组(tester)的cDNA与过量的驱动组(driver)cDNA杂交;(4)选择性PCR扩增与接头相连的试验组cDNA分子;(5)克隆PCR产物,构建差减文库;(6)筛选文库SSH方法一般只用于两个样品的差异比较分析,样品间的差异不宜太大或太小,而对于多个样品则无能为力,这在很大程度上限制了它的应用。

提取tester RNA的时期非常关键,选择使用该方法时,首先要根据不同的研究目的确定取材的最佳时期,取材时期不当将会给试验带来意想不到的困难,或许只得到很少几个差减克隆或根本得不到克隆,或得到一些非目的克隆。

从技术本身讲,提取的tester RNA和driver RNA及从中分离的mRNA的质量、限制酶的酶切效率、接头的连接效率、第二次PCR产物的转化效率及差减克隆的筛选方法等关系着验的成败。

另外SSH所需的起始RNA量较大,一般为几微克,对于一些珍贵稀有的不易获得足够RNA的材料要慎重使用。

SSH方法在研究植物基因的差异表达方面已得到有效应用,该方法在应用范围和深度上可进一步拓宽和加深:(1)利用SSH方法研究生物(如细菌和真菌等)和非生物逆境(如干旱和寒冷等)对植物的影响及生物与寄主植物的互作时,可进一步提早取材时期(如逆境诱导后的6小时或更早)和缩短取材间隔,以获得植物差异表达基因的表达动态和进行有关转录因子等方面的研究,进而获得植物与逆境互作的关键点,更好地理解其互作机制,为从分子水平上定向培育抗旱、抗寒、抗病等作物提供更可靠的理论依据。